显微镜及制片技术.ppt

目的与要求目的与要求1、了解显微镜的构造及维护。、了解显微镜的构造及维护。2、初步掌握使用显微镜地方法。、初步掌握使用显微镜地方法。4、了解普通显微镜的成像原理及光路图、了解普通显微镜的成像原理及光路图3、了解光学显微镜的主要类型、了解光学显微镜的主要类型.生物显微镜，测微尺，生物显微镜，测微尺，“E”字字玻片标本，香柏油等玻片标本，香柏油等材料和仪器材料和仪器实验内容实验内容二、植物制片技术二、植物制片技术三、绘图法三、绘图法一、显微镜一、显微镜（一）（一）.显微镜成像原理显微镜成像原理（二（二).显微镜的类型显微镜的类型(三三).显微镜的构造显微镜的构造（四）（四）.使用显微镜的主要步骤和方法使用显微镜的主要步骤和方法（五）（五）.放大率放大率（六）（六）.测微尺的使用测微尺的使用一、显微镜一、显微镜（一）显微镜的成像原理一）显微镜的成像原理1.显微镜的光学原理显微镜的光学原理2.显微镜的照明原理显微镜的照明原理（1）临界照明）临界照明（2）柯拉照明）柯拉照明被检物被检物AB放在物镜放在物镜(O1)下方的一倍焦距之间，下方的一倍焦距之间，则在物镜则在物镜(O1)后方形成一个倒立得放大实像，这个后方形成一个倒立得放大实像，这个实像正好位于目镜实像正好位于目镜(O2)的下焦点之内，通过目镜后的下焦点之内，通过目镜后形成一个放大的虚像形成一个放大的虚像A2B2，这个虚像通过调焦装置，这个虚像通过调焦装置使其落在眼睛明视距处，即使其落在眼睛明视距处，即25cm，使所看到的物，使所看到的物体最清晰，也就是虚像体最清晰，也就是虚像A2B2是在眼睛晶状体的两倍是在眼睛晶状体的两倍焦距之外，在眼球后的视网膜形成一个倒立的焦距之外，在眼球后的视网膜形成一个倒立的A2B2缩小像缩小像A3B3.1.显微镜的光学原理显微镜的光学原理临界照明：光源经扣光镜后哦汇聚在被检物体，临界照明：光源经扣光镜后哦汇聚在被检物体，光束狭而强，这是它的优点，但是光源的灯丝像与光束狭而强，这是它的优点，但是光源的灯丝像与被检物体的平面重合，这样就造成被检物体的照明被检物体的平面重合，这样就造成被检物体的照明呈现出不均匀性，在有灯丝的部分则明亮，无灯丝呈现出不均匀性，在有灯丝的部分则明亮，无灯丝的部分则暗淡，不仅影响成像质量，更不适于显微的部分则暗淡，不仅影响成像质量，更不适于显微照相。照相。柯拉照明：照明光路中的光学组件包括光源、集柯拉照明：照明光路中的光学组件包括光源、集光器、视场光栏、孔径光栏、聚光器和物台。在柯拉光器、视场光栏、孔径光栏、聚光器和物台。在柯拉照明光路中，在集光器透镜两侧，灯丝和孔径光栏位照明光路中，在集光器透镜两侧，灯丝和孔径光栏位一对共轭面，灯丝的像成在孔径光栏的平面上。在聚一对共轭面，灯丝的像成在孔径光栏的平面上。在聚光器透镜两侧，视场光栏和物台为一对共轭面，视场光器透镜两侧，视场光栏和物台为一对共轭面，视场光栏的像呈现在舞台上，因此柯拉照明比临界照明要光栏的像呈现在舞台上，因此柯拉照明比临界照明要优越。一是照明均匀。二是通过调节视场光栏的大小优越。一是照明均匀。二是通过调节视场光栏的大小和位置可以可以控制标本平面上照明区域的大小和位和位置可以可以控制标本平面上照明区域的大小和位置。置。（二（二).显微镜的类型显微镜的类型电子显微镜电子显微镜使用电子束作光源的一类显使用电子束作光源的一类显微镜微镜,以特殊的电极和磁极作为透镜代替玻璃以特殊的电极和磁极作为透镜代替玻璃透镜透镜,能分辨相距能分辨相距0.2左右的物体放大倍数可左右的物体放大倍数可80-120万倍万倍光学显微镜光学显微镜以可见光作为光源以可见光作为光源,用玻璃制用玻璃制作透镜的显微镜作透镜的显微镜.其有效放大倍数可达其有效放大倍数可达1250倍倍,最高分辨力为最高分辨力为0.2微米微米.显微镜可分为光学显微镜和电子显微镜显微镜可分为光学显微镜和电子显微镜光学显微镜可分为单式显微镜和复式显微光学显微镜可分为单式显微镜和复式显微镜。镜。单式显微镜单式显微镜结构简单结构简单,扩大的是方向一致的扩大的是方向一致的虚像虚像.复式显微镜复式显微镜结构比较复杂结构比较复杂,放大倍数较高放大倍数较高,包包括括普通生物显微镜普通生物显微镜,暗视野显微镜暗视野显微镜,相差显微相差显微镜镜,荧光显微镜荧光显微镜等等.光学显微镜光学显微镜单筒复式普通生物显微镜单筒复式普通生物显微镜下一页下一页双筒复式普通生物显微镜双筒复式普通生物显微镜普通显微镜普通显微镜的放大倍数的放大倍数10X4低倍观察低倍观察10X10中倍观察中倍观察10X40高倍观察高倍观察10X100油镜油镜普通生物显微镜的放大倍数普通生物显微镜的放大倍数物镜是决定显微镜质量好坏的重要部件物镜是决定显微镜质量好坏的重要部件,放大倍数放大倍数有有10,40,油镜油镜100倍倍,目镜放大倍数有目镜放大倍数有5,10,16倍倍.暗视野显微镜暗视野显微镜特点是该显微镜具有暗视野聚特点是该显微镜具有暗视野聚光器，使光线不直接进人物镜，故呈暗视野。光器，使光线不直接进人物镜，故呈暗视野。暗视野暗视野Darkfieldmicroscope根据根据Tyndall效应原理设计，效应原理设计，在黑背景下观察物体的外部在黑背景下观察物体的外部细节，分辨率高该显微镜适用于观察细胞内微细节，分辨率高该显微镜适用于观察细胞内微小颗粒，例如线粒体、细菌运动等。小颗粒，例如线粒体、细菌运动等。荧光显微镜是用以观察细胞及组织内荧光物质的分荧光显微镜是用以观察细胞及组织内荧光物质的分布。它是装有、能产生紫外线（短波长）的光源及系列布。它是装有、能产生紫外线（短波长）的光源及系列滤片装置的显微镜。滤片装置的显微镜。：相差显微镜的特点相差显微镜的特点装有不同大装有不同大小环状光阑的聚光器。小环状光阑的聚光器。物镜内装有位物镜内装有位相板。相板。中心望远镜装置。相差显微镜中心望远镜装置。相差显微镜的基本原理是通过上述装置。把透过标的基本原理是通过上述装置。把透过标本的可见光的相位差变成振幅本的可见光的相位差变成振幅差，从而差，从而提高了标本内各种结构之间的对比度，提高了标本内各种结构之间的对比度，使标本中的结构清晰可辨。使标本中的结构清晰可辨。使用电子束作光源的年一类显微镜使用电子束作光源的年一类显微镜,以特殊的电极和磁极以特殊的电极和磁极作为透镜代替玻璃透镜作为透镜代替玻璃透镜,能分辨相距能分辨相距0.2左右的物体放大倍数可左右的物体放大倍数可80-120万倍。万倍。透射电镜是以电子束透过样品经过聚焦与放大后所产生的透射电镜是以电子束透过样品经过聚焦与放大后所产生的物像，物像，投射到荧光屏上或照相底片上进行观察。透射电镜的分辨投射到荧光屏上或照相底片上进行观察。透射电镜的分辨率为率为0.10.2nm，放大倍数为几万几十万倍。，放大倍数为几万几十万倍。扫描电镜是用极细的电子束在样品表面扫描，将产生扫描电镜是用极细的电子束在样品表面扫描，将产生的二次电子用特制的探测器收集，形成电信号运送到显像管，的二次电子用特制的探测器收集，形成电信号运送到显像管，在荧光屏上显示物体。（细胞、组织）表面的立体构像，可在荧光屏上显示物体。（细胞、组织）表面的立体构像，可摄制成照片。摄制成照片。电子显微镜电子显微镜点击看图点击看图点击看图点击看图透射电镜透射电镜（三）（三）.显微镜的构造显微镜的构造显微镜的基本构显微镜的基本构造包括两大部分造包括两大部分,光学光学系统系统和和机械系统机械系统,机械机械系统有系统有镜座镜座,镜柱镜柱,镜镜壁壁,镜筒镜筒,物镜转换器物镜转换器,载物台载物台,调焦螺旋调焦螺旋,聚聚光器调节螺旋光器调节螺旋.光学系光学系统有统有物镜物镜,目镜目镜,反光反光镜镜,聚光器聚光器,虹彩光圈虹彩光圈.下一页下一页下一页下一页下一页下一页下一页下一页下一页下一页下一页下一页（四）（四）.使用显微镜的主要步骤和方法使用显微镜的主要步骤和方法1、低倍镜观察、低倍镜观察2、高倍镜的使用、高倍镜的使用3、油镜的使用、油镜的使用4、显微镜使用后整理、显微镜使用后整理1、低倍镜观察、低倍镜观察（1）对对光光和和放放置置切切片片下一页下一页（2）调焦）调焦（3）低倍观察）低倍观察:将需观察的材料放到最有利的位将需观察的材料放到最有利的位置上置上,根据材料的颜色厚薄根据材料的颜色厚薄,成像反差再调节成像反差再调节,如如:视野太亮视野太亮可下降聚光器或调小光圈可下降聚光器或调小光圈.2、高倍镜的使用、高倍镜的使用（1）.选取目标选取目标:用低倍镜选取目标用低倍镜选取目标,并移至并移至视野中央视野中央,换上高倍镜换上高倍镜.（2）.调整焦点调整焦点:换上高倍镜后视野中即有模换上高倍镜后视野中即有模糊图象糊图象,调节细准焦螺旋使图象清晰调节细准焦螺旋使图象清晰0（3）.调节亮度调节亮度,因高倍镜视野较暗需升高聚因高倍镜视野较暗需升高聚光器光器,或放大光圈或放大光圈3.油镜的使用油镜的使用.（1）先从低倍油镜找到被检部分后先从低倍油镜找到被检部分后,再换高倍镜调整再换高倍镜调整焦点焦点,然后再换用油浸镜头然后再换用油浸镜头.（2）在换用油镜前在盖玻片上滴加一滴在换用油镜前在盖玻片上滴加一滴香波油香波油，在在油镜观察标本时，用油镜观察标本时，用细调焦螺旋调节焦点细调焦螺旋调节焦点。（3）油镜使用完毕，需立即擦净，擦拭方法是用棉油镜使用完毕，需立即擦净，擦拭方法是用棉棒或擦镜纸蘸少许清洁剂（棒或擦镜纸蘸少许清洁剂（乙醇或无水酒精的混合物乙醇或无水酒精的混合物，最好不用二甲苯，以免侵入镜头后最好不用二甲苯，以免侵入镜头后使树胶溶化，透镜使树胶溶化，透镜松散松散）4、显微镜使用后整理、显微镜使用后整理观察完毕升高镜筒取下玻片，再转观察完毕升高镜筒取下玻片，再转动物镜转换器，使两个物镜位于载物台动物镜转换器，使两个物镜位于载物台上通光孔的两侧，罩上防尘罩。上通光孔的两侧，罩上防尘罩。（五）（五）.放大率放大率1.显微镜总放大率显微镜总放大率=物镜的放大倍数物镜的放大倍数目镜的放大倍数目镜的放大倍数2。显微镜的分辨力是主要由镜口率决定显微镜的分辨力是主要由镜口率决定物镜的有效镜口率物镜的有效镜口率=(物镜镜口率物镜镜口率+聚光器镜口率聚光器镜口率)/23.目镜光栏所围绕的圆即目镜光栏所围绕的圆即视野宽度视野宽度,视野宽度与放大率成反比视野宽度与放大率成反比.（六）（六）.测微尺的使用测微尺的使用台式测微尺台式测微尺目镜测微尺目镜测微尺下一页下一页1。将目镜测量尺（目尺）刻度向下装在目镜内。将镜将目镜测量尺（目尺）刻度向下装在目镜内。将镜台测量尺（台尺）安置在载物台上，调焦使台尺上的标尺分台测量尺（台尺）安置在载物台上，调焦使台尺上的标尺分度清晰。使台尺与目尺上的标尺在度清晰。使台尺与目尺上的标尺在“0”刻度上对齐。刻度上对齐。目镜测微尺的格植目镜测微尺的格植(微米微米)=两重合线间两重合线间台式测微尺的格数台式测微尺的格数10微米微米目镜测微尺的格数目镜测微尺的格数下一页下一页2。将台尺取下换上待测标本，观察所测物体所占。将台尺取下换上待测标本，观察所测物体所占目标尺的格数，再乘以目标尺上每格的长度，即为被目标尺的格数，再乘以目标尺上每格的长度，即为被测物体的长度。测物体的长度。台式测微尺一种特制的载玻片，具带刻度的标尺台式测微尺一种特制的载玻片，具带刻度的标尺长长1mm分分100小格。每格小格。每格0.01mm即即10微米微米（一）：临时玻片标本制作（一）：临时玻片标本制作（二）：徒手切片法（二）：徒手切片法（三）：石蜡制片法（三）：石蜡制片法二、植物制片技术二、植物制片技术植物体大部分都是不透明的不能直接观察。我们植物体大部分都是不透明的不能直接观察。我们需要利用各种方法对植物体进行处理，将其制成使光需要利用各种方法对植物体进行处理，将其制成使光线能够透过的制片。根据制片标本可保存的时间长短线能够透过的制片。根据制片标本可保存的时间长短通常将其分为临时制片和永久制片两大类型。现对几通常将其分为临时制片和永久制片两大类型。现对几种常用的制片方法介绍如下：种常用的制片方法介绍如下：临时玻片标本的制作是使用显微镜观察植物材料临时玻片标本的制作是使用显微镜观察植物材料时最基本的技术，现以洋葱叶表皮为实验材料来介绍：时最基本的技术，现以洋葱叶表皮为实验材料来介绍：（一）、临时玻片标本的制作（一）、临时玻片标本的制作2、实验过程实验过程1、材料与仪器、材料与仪器（1）、双面刀片、镊子、毛笔、培养皿、滴）、双面刀片、镊子、毛笔、培养皿、滴瓶、载玻片盖玻片、软布瓶、载玻片盖玻片、软布（2）、洋葱鳞叶）、洋葱鳞叶1、取载玻片和盖玻片用软布擦净、取载玻片和盖玻片用软布擦净2、用滴管滴、用滴管滴1-2滴清水，滴在载玻片中央。滴清水，滴在载玻片中央。3、用刀片在洋葱鳞叶外表皮或内表皮划一、用刀片在洋葱鳞叶外表皮或内表皮划一“井井”字，再字，再用镊子撕取用镊子撕取“井井”字中央的表皮，并将其平展与载玻片的小字中央的表皮，并将其平展与载玻片的小水滴中。水滴中。4、用镊子夹取一片干净的盖玻片，先以盖玻片的一边斜、用镊子夹取一片干净的盖玻片，先以盖玻片的一边斜着与小水滴接触，再慢慢放下盖玻片。着与小水滴接触，再慢慢放下盖玻片。5、制作好的标本要求水分充满，当水分不足时，可用滴、制作好的标本要求水分充满，当水分不足时，可用滴管从盖玻片一侧的边缘滴少许水分，再另一侧用吸水纸吸管从盖玻片一侧的边缘滴少许水分，再另一侧用吸水纸吸6、临时装片标本如需短期保存，可滴入、临时装片标本如需短期保存，可滴入10%甘油水溶液，甘油水溶液，并放在培养皿中，上加盖子，减少蒸发；如需长期保存，则并放在培养皿中，上加盖子，减少蒸发；如需长期保存，则应通过固定、染色、脱水、透明、加拿大封藏等步骤制成永应通过固定、染色、脱水、透明、加拿大封藏等步骤制成永久玻片标本。久玻片标本。实验过程实验过程徒手切片法是指用手拿刀片和材料，并将材料切徒手切片法是指用手拿刀片和材料，并将材料切成玻片标本的一种切片方法。成玻片标本的一种切片方法。1、材料与器具、材料与器具双面刀片、毛笔、培养皿滴瓶、双面刀片、毛笔、培养皿滴瓶、新鲜植物材料新鲜植物材料2、实验过程实验过程（二）、徒手切片法（二）、徒手切片法1、取材、取材用刀片将材料切成用刀片将材料切成2-3CM长，并使材料的上端截面长，并使材料的上端截面平整平整2、切片、切片徒手切片时最重要的是，切下一小片平而薄的组织徒手切片时最重要的是，切下一小片平而薄的组织结构结构（1）、左手拇指食指及中指夹住材料，拇指要略）、左手拇指食指及中指夹住材料，拇指要略低于食指并使材料稍稍突出于手指之上约低于食指并使材料稍稍突出于手指之上约3MM（2）、用右手拇指和食指横向平握刀片，置于左）、用右手拇指和食指横向平握刀片，置于左手食指之上，刀口向内，与材料的纵轴垂直。手食指之上，刀口向内，与材料的纵轴垂直。实验过程实验过程（3）、切片时现在材料和刀口蘸些水，并使材料）、切片时现在材料和刀口蘸些水，并使材料和、装片都保持在水平位置，再用臂力进行连续切片和、装片都保持在水平位置，再用臂力进行连续切片每当切下数薄片时，即用毛笔蘸水，将切好的薄片拨每当切下数薄片时，即用毛笔蘸水，将切好的薄片拨到培养皿中。到培养皿中。3、装片、装片从切好的材料中，用毛笔挑出完整的、薄的、切面从切好的材料中，用毛笔挑出完整的、薄的、切面正的切片制成临时水装玻片标本，放置在显微镜下观正的切片制成临时水装玻片标本，放置在显微镜下观察。察。（三）石蜡制片法（三）石蜡制片法1、材料与器具：、材料与器具：（1）解剖刀、解剖针、镊子、培养皿、吸管、恒温箱、）解剖刀、解剖针、镊子、培养皿、吸管、恒温箱、酒精灯、面盆、纸盒、切片机、毛笔、蜡带盘、载玻片、酒精灯、面盆、纸盒、切片机、毛笔、蜡带盘、载玻片、盖玻片、水浴锅、染色缸、展片台、树胶瓶、显微镜、盖玻片、水浴锅、染色缸、展片台、树胶瓶、显微镜、真空泵、烤片架。真空泵、烤片架。（2）酒精、二甲苯、冰醋酸、福尔马林、石蜡、潘虹、）酒精、二甲苯、冰醋酸、福尔马林、石蜡、潘虹、固绿、中性树胶。固绿、中性树胶。（3）植物材料）植物材料2、实验过程实验过程合理布局合理布局先绘草图先绘草图绘图和文字一律用绘图和文字一律用3H铅笔铅笔图注在右侧图注在右侧,平行线引出平行线引出图形一律点线表示图形一律点线表示,明暗和颜色深浅用不同密度明暗和颜色深浅用不同密度圆点表示。圆点表示。三、绘图法三、绘图法-绘、标、注绘、标、注