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生物技术制药生物技术制药第一章第一章 现代生物技术现代生物技术一、现代生物技术的定义与主要内容一、现代生物技术的定义与主要内容生物技术生物技术(Biotechnology or Bioengineering）:对对生生物物有有机机体体（微微生生物物至至高高等等动动、植植物物）或或其其组组成成部部分分（器器官官、组组织织、细细胞胞或或细细胞胞器器等等），运运用用分分子子生生物物学学、细细胞胞生生物物学学、生生物物化化学学、生生物物物物理理学学、生生物物信信息息学学等等手手段段，研研究究、设设计计、改改造造，以以改改良良生生物物乃乃至至创造新的生物品种创造新的生物品种的一种技术体系。的一种技术体系。现代生物技术包括四个方面：现代生物技术包括四个方面：（1 1）基基因因工工程程：生生物物遗遗传传物物质质核核酸酸的的分分离离、提提取取、体外剪切、拼接重组以及扩增与表达等技术。体外剪切、拼接重组以及扩增与表达等技术。（2）细细胞胞工工程程：细细胞胞（也也包包括括器器官官或或组组织织）的的离离体体培培养养、繁繁殖殖、再再生生、融融合合及及细细胞胞核核、细细胞胞质质及及染染色色体体与与细细胞胞器器（如如线线粒粒体体、叶叶绿绿体体等等）的的移移植植与与改改建建等等操操作作技术。技术。（3）酶酶工工程程：利利用用酶酶，借借助助固固定定化化、生生物物反反应应器器和和生生物物传传感感器器等等新新技技术术、新新装装置置，高高效效优优质质地地生生产产特特定定产产品的技术。品的技术。（4）发发酵酵工工程程（微微生生物物工工程程）：给给微微生生物物提提供供最最适适宜宜的发酵条件以生产特定产品的技术。的发酵条件以生产特定产品的技术。生物技术的依据和出发点：生物有机体的种种生物技术的依据和出发点：生物有机体的种种机机能能，是生物在生长、发育与繁殖过程中进行物质合成、，是生物在生长、发育与繁殖过程中进行物质合成、降解和转化的能力（即利用其新陈代谢的能力），降解和转化的能力（即利用其新陈代谢的能力），反应器、代谢反应、酶、特定的遗传基因反应器、代谢反应、酶、特定的遗传基因核心基础：核心基础：基因工程和细胞工程基因工程和细胞工程“工程菌株工程菌株”或或“工程细胞株工程细胞株”使酶工程或发酵工程生产出更多、使酶工程或发酵工程生产出更多、更好的产品，发挥出更大的经济效益。更好的产品，发挥出更大的经济效益。酶工程和发酵工程酶工程和发酵工程 现代生物技术产业化，特别是发现代生物技术产业化，特别是发展大规模生产的展大规模生产的最关键环节最关键环节。二、现代生物技术的优越性二、现代生物技术的优越性（一）（一）不可取代性不可取代性植物品种改良植物品种改良 杂交育种杂交育种基因工程改良品种基因工程改良品种基因资源的来源可不受限制基因资源的来源可不受限制 牛牛(猪猪)生长激素基因生长激素基因鱼鱼 生长、发育快，体重速增生长、发育快，体重速增 人人血血红红蛋蛋白白基基因因猪猪体体内内 生生产产人人的的血血红红蛋蛋白白，分分离离，可作为人血液的替代物。可作为人血液的替代物。生生长长激激素素释释放放抑抑制制因因子子（抑抑制制生生长长激激素素不不合合时时宜宜的的分泌，分泌，“肢端肥大症肢端肥大症”的特效药）的特效药）50万个羊脑万个羊脑 5mg样品，化学法样品，化学法 300多美元多美元/5mg 基因工程基因工程 7.5升大肠杆菌发酵升大肠杆菌发酵 5mg,成本几十美分。成本几十美分。（二）（二）快速、精确快速、精确 试剂盒试剂盒 有效的早期诊断（有效的早期诊断（遗传病、病毒引起的遗传病、病毒引起的 疾病和癌症等）。疾病和癌症等）。McAb检查妇女妊娠检查妇女妊娠 比比用用抗抗血血清清法法检检查查提提高高了了灵灵敏敏度度，怀怀孕孕后后8天天得得知知，准确率准确率100（三）（三）低耗、高效低耗、高效 “酶酶”催催化化化化学学效效应应，无无需需高高温温、高高压压和和强强酸酸碱碱等等大大大降低能耗的成本、能耗。大降低能耗的成本、能耗。例：例：L-苹果酸生产（生物技术）苹果酸生产（生物技术）产氨短杆菌产氨短杆菌 收集菌体收集菌体固定化细胞固定化细胞 L-苹果酸苹果酸原理：延胡索酸原理：延胡索酸 L-苹果酸苹果酸成本比化学合成降低几十倍。成本比化学合成降低几十倍。人生长激素（治疗侏儒病）人生长激素（治疗侏儒病）一个患者每年需用量一个患者每年需用量 50个死人的垂体中提取个死人的垂体中提取基因工程生产基因工程生产 价格为价格为14提取，不需依赖死人脑。提取，不需依赖死人脑。（四）（四）副产物少、不良反应小、安全性好副产物少、不良反应小、安全性好 疫苗的生产疫苗的生产 常规方法常规方法 用血液，成本高，可带来病毒感染的危险性。用血液，成本高，可带来病毒感染的危险性。现代生物技术现代生物技术 用大肠杆菌用大肠杆菌 如乙肝疫苗，凝血因子等如乙肝疫苗，凝血因子等大大改进使用的安全性。大大改进使用的安全性。2.“生物导弹生物导弹”McAb接接抗抗癌癌药药物物体体内内McAb只只与与该该肿肿瘤瘤细细胞胞特特异异性结合性结合抗癌药物专一、靶向到肿瘤细胞抗癌药物专一、靶向到肿瘤细胞 小鼠的免疫球蛋白小鼠的免疫球蛋白 McAb免疫球蛋白分子中含有人免疫球蛋白分子片段免疫球蛋白分子中含有人免疫球蛋白分子片段三、现代生物技术在医药领域的应用三、现代生物技术在医药领域的应用（）在疾病诊断与治疗中的应用）在疾病诊断与治疗中的应用1.单克隆抗体与疾病诊断单克隆抗体与疾病诊断 妊娠试验妊娠试验 FDA批准上市的批准上市的McAb产品产品 已有几十种。已有几十种。3.基因诊断基因诊断 核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术 80年年代代中中期期 聚聚合合酶酶链链反反应应（polymerase chain reaction,PCR）体外扩增基因的方法）体外扩增基因的方法产产前前和和症症状状前前基基因因诊诊断断:苯苯丙丙酮酮尿尿症症、珠珠蛋蛋白白合合成成障障碍碍性性贫贫血血、假假肥肥大大型型肌肌营营养养不不良良、甲甲型型血血友友病病、乙乙型型血血友友病病、成年型多囊肾、慢性进行性舞蹈病等遗传病成年型多囊肾、慢性进行性舞蹈病等遗传病4.基基因因治治疗疗 因因单单一一结结构构基基因因即即编编码码蛋蛋白白质质的的基基因因缺缺陷陷所引起的遗传病。所引起的遗传病。治治疗疗:导导入入正正常常基基因因校校正正缺缺陷陷基基因因引引起起的的DNA代代谢谢异常及细胞突变异常及细胞突变使之恢复正常功能。使之恢复正常功能。（二）未来医药卫生领域中的生物技术展望（二）未来医药卫生领域中的生物技术展望1.转基因动物生产的转基因动物生产的“转基因药物转基因药物”1978年年 把把人人tPA基基因因转转入入小小鼠鼠受受精精卵卵发发育育成成转转基基因因小小鼠鼠并证明在其乳汁中能得到并证明在其乳汁中能得到tPA 美国美国DNx公司的公司的“制药工厂制药工厂”转基因猪转基因猪 环球基因药物公司环球基因药物公司 转基因奶牛转基因奶牛 基因酶公司基因酶公司 转基因山羊转基因山羊 英国药物蛋白公司英国药物蛋白公司 转基因绵羊转基因绵羊“转基因药物转基因药物”与基因工程药物相比与基因工程药物相比,产产量量高高，成成本本低低,具具有有与与人人体体自自身身产产生生的的蛋蛋白白相相同同的的生生物物学学活活性性。乳乳腺腺细细胞胞能能进进行行一一系系列列的的翻翻译译后后修修饰饰作作用，包括糖基化作用等，正确地产生人体蛋白。用，包括糖基化作用等，正确地产生人体蛋白。2.人型人型McAb(monoclonal antibody)的制备的制备 技术路线：技术路线：鼠鼠型型McAb分分子子中中更更换换一一段段人人抗抗体体分分子子中中与与抗抗原原结结合的链段（用蛋白质工程的方法）；合的链段（用蛋白质工程的方法）；从从人人鼠鼠杂杂交交瘤瘤细细胞胞中中直直接接克克隆隆人人抗抗体体基基因因，并并使使之在细菌中得到表达；之在细菌中得到表达；将将人人免免疫疫球球蛋蛋白白重重链链C区区基基因因转转入入小小鼠鼠受受精精卵卵，发发育育成成转转基基因因小小鼠鼠，用用特特定定抗抗原原免免疫疫得得人人型型化化McAb。3.基因治疗基因治疗 “基因打靶基因打靶”技术技术 将将外外源源基基因因定定点点整整合合到到细细胞胞基基因因组组的的某某一一确确定定位位点上，因而能对缺陷基因进行原位修复。点上，因而能对缺陷基因进行原位修复。聚合酶链反应及其他不断涌现的分子生物学新技术聚合酶链反应及其他不断涌现的分子生物学新技术 将得到广泛应用。将得到广泛应用。在细菌、酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等不同的在细菌、酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等不同的细胞内能得到高效表达的载体细胞内能得到高效表达的载体 将不断地构建成功，大幅提高基因工程的生产效率。将不断地构建成功，大幅提高基因工程的生产效率。生物技术后处理工程和蛋白质工程生物技术后处理工程和蛋白质工程 将迅速发展将迅速发展有目的地修饰、改造乃至重新组建有目的地修饰、改造乃至重新组建4.生物技术的各个环节生物技术的各个环节第一节第一节 生物药物生物药物(biopharmaceutics)一、概念一、概念 利用利用生物体及其成分生物体及其成分综合利用生物学、生物化学、微生物学、生物组织免综合利用生物学、生物化学、微生物学、生物组织免疫学、物理化学、药学原理、方法加工制造的疫学、物理化学、药学原理、方法加工制造的 预防预防 诊断疾病的制品诊断疾病的制品 治疗治疗第二章第二章 生物药物与生物技术生物药物与生物技术药物概述药物概述（一）按来源和制造方法（一）按来源和制造方法1.动物来源动物来源 动物脏器动物脏器 资源丰富资源丰富 家畜：家畜：猪、马、牛、羊猪、马、牛、羊 家禽：家禽：鸡、鸭鸡、鸭 海洋生物：海带、鲨鱼、海蛇海洋生物：海带、鲨鱼、海蛇二、分类二、分类2.2.微生物来源发酵法微生物来源发酵法优点：优点：1 1）微生物及其代谢物资源丰富、开发潜力大）微生物及其代谢物资源丰富、开发潜力大2 2）培养、繁殖快、产量高、成本低，）培养、繁殖快、产量高、成本低，便于大规模工业生产，便于大规模工业生产，不受原料、运输、保存、季节和资源供应影响不受原料、运输、保存、季节和资源供应影响3 3）生产的生物药物可综合利用）生产的生物药物可综合利用 代谢物和菌丝体代谢物和菌丝体;诱变选育良种诱变选育良种;加入前体培养法加入前体培养法4 4）体内酶的转化作用，使复杂、难反应能专一、迅速）体内酶的转化作用，使复杂、难反应能专一、迅速4.4.化学合成化学合成 氨基酸、多肽、核酸降解物及其衍生物、维氨基酸、多肽、核酸降解物及其衍生物、维生素、激素生素、激素 结构改造以高效，长效和高专一性结构改造以高效，长效和高专一性3.3.植物来源植物来源 植物中的蛋白质、多糖、脂类、核酸等植物中的蛋白质、多糖、脂类、核酸等 生物大分子的研究和利用生物大分子的研究和利用5.现代生物技术产品现代生物技术产品基因工程技术生产的重组活性多肽基因工程技术生产的重组活性多肽 活性蛋白质类活性蛋白质类 基因工程疫苗基因工程疫苗 McAb 多种细胞生长因子多种细胞生长因子利用转基因动、植物生产的生物药物利用转基因动、植物生产的生物药物 利用蛋白质工程技术改造天然蛋白质创造自然利用蛋白质工程技术改造天然蛋白质创造自然界没有的而功能上更优良的蛋白质类生物药物界没有的而功能上更优良的蛋白质类生物药物生生物物技技术术药药物物（基基因因工工程程药药物物，Biotech Drugs）:以以DNA重重组组技技术术（包包括括基基因因工工程程技技术术、蛋蛋白白质质工工程程技技术术）生生产产的的蛋蛋白白质质、多多肽肽、酶酶、激激素素、疫疫苗苗、单单克克隆隆抗抗体体和和细胞生长因子类药物。细胞生长因子类药物。1.细胞因子干扰素类：细胞因子干扰素类：IFN-、IFN-和和IFN-。IFN-有有 lb，2a，2b等等2.细胞因子白介素类和肿瘤坏死因子类：细胞因子白介素类和肿瘤坏死因子类：IL-2和突变型白介素和突变型白介素-2；TNF-和和TNF受体。受体。二、生物技术药物的主要类型二、生物技术药物的主要类型第二节第二节 生物技术药物生物技术药物一、概念一、概念3.造血系统生长因子类造血系统生长因子类：粒粒细细胞胞集集落落刺刺激激因因子子（G-CSF）、巨巨噬噬细细胞胞集集落落刺刺激激因因子子（M-CSF）、巨巨噬噬细细胞胞粒粒细细胞胞集集落落刺刺激激因因子子（GM-CSF）、红红细细胞胞生生成成素素（EPO）、促促血血小小板板生生成素（成素（TPO)、干细胞生长因子（、干细胞生长因子（SCF）等。）等。4.生长因子类：生长因子类：促进细胞生长、组织再生和创伤治疗。促进细胞生长、组织再生和创伤治疗。胰胰 岛岛 素素 样样 生生 长长 因因 子子（ICF）、表表 皮皮 生生 长长 因因 子子（ECF）、血血小小板板衍衍生生生生长长因因子子（PDGF）、转转化化生生长长因因子子（TGF-与与TGF-）、神神经经生生长长因因子子（NGF）及及各各种种神经营养因子。神经营养因子。5.重组蛋白质与多肽类激素：重组蛋白质与多肽类激素：人人 重重 组组 胰胰 岛岛 素素（Humulin）、人人 生生 长长 激激 素素（rhGH）、促促卵卵泡泡激激素素（FSH）、促促黄黄体体生生成成素素（LH）、绒毛膜促性腺激素（）、绒毛膜促性腺激素（HCG）等。）等。6.心血管病治疗剂与酶制剂：心血管病治疗剂与酶制剂：心血管疾病和抗肿瘤治疗心血管疾病和抗肿瘤治疗因因子子、水水蛭蛭素素、组组织织纤纤溶溶酶酶原原激激活活剂剂（tPA）、尿尿激激酶酶、链链激激酶酶、葡葡激激酶酶、门门冬冬酰酰胺胺酶酶、超超氧氧化化物物歧歧化化酶酶（SOD）、葡萄糖脑苷酶及、葡萄糖脑苷酶及DNase等。等。7.重组疫苗与单抗制品：重组疫苗与单抗制品：重重组组乙乙肝肝表表面面抗抗原原疫疫苗苗（酵酵母母）、乙乙肝肝基基因因疫疫苗苗（重重组组乙乙肝肝表表面面抗抗原原疫疫苗苗、CHO细细胞胞）、艾艾滋滋病病疫疫苗苗和和肿瘤疫苗等。肿瘤疫苗等。己己开开发发的的McAb有有72种种，多多用用于于治治疗疗难难治治性性疾疾病病如如预防移植物急性排斥、免疫性疾病和肿瘤等。预防移植物急性排斥、免疫性疾病和肿瘤等。8.基因药物：基因药物：应用于基因治疗目的的应用于基因治疗目的的DNA片段重组片段重组药物。药物。基因治疗基因治疗:将将外源基因外源基因导入机体以达到治疗疾病目的。导入机体以达到治疗疾病目的。遗遗传传性性疾疾病病、肿肿瘤瘤、艾艾滋滋病病、囊囊性性纤纤维维变变性性、糖糖尿病和心血管病等。尿病和心血管病等。我我国国已已批批准准上上市市品品：IFN-1b（自自研研），IFN-2a，IFN-2b，IFN-，IL-2，IL-2 125Ser，G-CSF，GM-CSF，SK，EPO，EGF，ECF衍衍生生物物，b-ECF，胰胰岛岛素素，GH，TPO，TNF衍衍生生物物，抗抗IL-8单单抗抗乳乳膏膏剂剂，胸苷激酶基因工程细胞制剂，乙肝疫苗，痢疾疫苗等。胸苷激酶基因工程细胞制剂，乙肝疫苗，痢疾疫苗等。细细胞胞:生生物物有有机机体体形形态态结结构构和和生生命命活活动动的的基基本本单单位。位。第三章第三章 细胞工程技术概念细胞工程技术概念细胞工程：细胞工程：以细胞作为研究对象，运用细胞生物学、分以细胞作为研究对象，运用细胞生物学、分子生物学等学科的原理与方法，按照人们的意志设计改子生物学等学科的原理与方法，按照人们的意志设计改造细胞的某些造细胞的某些遗传性状遗传性状，培育出新的生物，培育出新的生物改良改良品种或通品种或通过细胞培养获得自然界中难以获得的过细胞培养获得自然界中难以获得的珍贵珍贵产品的新兴生产品的新兴生物技术物技术细胞培养、细胞融合、细胞重组和遗传物质转移等细胞培养、细胞融合、细胞重组和遗传物质转移等第一节第一节 细胞培养技术细胞培养技术细细胞胞培培养养：生生物物体体内内某某一一块块组组织织，用用酶酶消消化化法法分分散散成成单单个个细细胞胞，接接种种至至特特定定的的培培养养容容器器中中并并给给予予必必要要的的生生长长条条件，使其在体外生长繁殖的技术。件，使其在体外生长繁殖的技术。细胞生长所需的培养条件：细胞生长所需的培养条件：1.足够的营养，足够的营养，糖、氨基酸、维生素、无机盐等；糖、氨基酸、维生素、无机盐等；2.生长环境，合适的温度、生长环境，合适的温度、pH值、无菌条件。值、无菌条件。动动物物细细胞胞的的培培养养：先先在在无无菌菌条条件件下下用用消消化化酶酶将将组组织织分分散散成成单单个个细细胞胞，用用培培养养基基制制成成细细胞胞悬悬液液，使使其其在在体体外合适的条件下生长繁殖的技术。外合适的条件下生长繁殖的技术。一、动物细胞培养一、动物细胞培养细胞培养的对象细胞培养的对象 单个的细胞，单个的细胞，组织培养的对象组织培养的对象 组织块组织块（0.51mm），），器官培养的对象器官培养的对象 器官的一部分或整个器官。器官的一部分或整个器官。动物细胞分类：动物细胞分类：（）动物细胞培养特征（）动物细胞培养特征贴壁依赖性细胞贴壁依赖性细胞 贴壁贴壁 大多数动物细胞大多数动物细胞非贴壁依赖性细胞非贴壁依赖性细胞 悬浮悬浮 血液淋巴细胞、肿瘤细胞、血液淋巴细胞、肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系杂交瘤细胞、转化细胞系兼性贴壁细胞兼性贴壁细胞 附壁或悬浮附壁或悬浮1.原代培养原代培养（or初次培养，初次培养，primary culture）胚胎或出生后几天幼龄动物的脏器获取组织，胚胎或出生后几天幼龄动物的脏器获取组织，剪成小块剪成小块 长宽长宽1mm、厚约、厚约0.5mm，胰酶消化分散，稀释成胰酶消化分散，稀释成21057105ml，分装到培养瓶（板）于分装到培养瓶（板）于37 CO2培养箱内培养。培养箱内培养。原原代代培培养养的的细细胞胞特特点点：离离体体时时间间短短，一一般般具具二二倍倍体体遗遗传传性状性状，能较好地反映在体内的生长状况，能较好地反映在体内的生长状况 适合用作适合用作药物测试和细胞分化药物测试和细胞分化的研究工具。的研究工具。（二）动物细胞培养技术（二）动物细胞培养技术2传代培养传代培养（或继代培养，或继代培养，subculture）将细胞悬液转接分装到将细胞悬液转接分装到两个瓶中培养两个瓶中培养 传代培养。传代培养。分裂次数：正常细胞有限分裂次数：正常细胞有限 一一般般人人正正常常细细胞胞可可传传代代5060次次有有限限细细胞胞系系（finite cell line），），传传代代过过程程中中可可无无限限制制生生长长繁繁殖殖的的细细胞胞系系连连续续细细胞胞系系（continuous cell line）或已确立的细胞系）或已确立的细胞系 肿瘤细胞肿瘤细胞 （三）动物细胞培养的营养条件（三）动物细胞培养的营养条件1.培养基培养基 1）天然培养基）天然培养基 成分复杂、来源有限成分复杂、来源有限 血清、水解乳蛋白、胶原、胚胎浸液等。血清、水解乳蛋白、胶原、胚胎浸液等。主主含含蛋蛋白白质质、氨氨基基酸酸、葡葡萄萄糖糖、激激素素、其其他他对对维维持持细细胞胞生生长长繁繁殖殖和和保保持持细细胞胞生生物物学学活活性性不不可可缺缺少少的的未未知因子，促进细胞知因子，促进细胞贴壁贴壁、中和有毒物质以保护细胞。、中和有毒物质以保护细胞。动物血清：动物血清：缺缺点点：来来源源困困难难，成成分分不不确确定定，使使得得细细胞胞生生长长过过程程不不易检测控制。易检测控制。水解乳蛋白水解乳蛋白 乳白蛋白的水解产物乳白蛋白的水解产物胶原胶原 动动物物真真皮皮（豚豚鼠鼠、牛牛）或或大大鼠鼠尾尾腱腱来来源源的的组组织织提提取取物物 胚胎浸液胚胎浸液 鸡胚和牛胚鸡胚和牛胚 特点：特点：一定化学组成一定化学组成主要组分：氨基酸、维生素、糖、无机盐、主要组分：氨基酸、维生素、糖、无机盐、其他一些辅助因子。其他一些辅助因子。2.2.合成培养基合成培养基根据天然培养基的成分，人工设计模拟合成根据天然培养基的成分，人工设计模拟合成RPMI-1640、DMEM、TC199、Eagles MEM等。等。只能维持细胞的生存只能维持细胞的生存(基础培养基基础培养基)须补充部分天然培养基，须补充部分天然培养基，血清血清 一般为一般为1020%。维持细胞维持细胞生长生长所需的激素和生长因子所需的激素和生长因子胰岛素、生长激素、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子胰岛素、生长激素、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子细胞细胞贴壁贴壁或或铺展铺展所需的细胞因子，所需的细胞因子，纤维粘连素、铺展因子、胎球蛋白等；纤维粘连素、铺展因子、胎球蛋白等；血清在培养液中的主要作用：血清在培养液中的主要作用：提供提供识识别别维维生生素素、脂脂类类、激激素素和和金金属属的的结结合合蛋蛋白白，调调节节被被结合物的活力结合物的活力白蛋白白蛋白 与维生素、脂类、激素结合，将它们载入细胞与维生素、脂类、激素结合，将它们载入细胞转铁蛋白转铁蛋白 结合并传递铁离子，结合并传递铁离子，结合蛋白与有毒金属或热原结合则可解除它们的毒性；结合蛋白与有毒金属或热原结合则可解除它们的毒性；细胞细胞生长生长所需的所需的脂肪酸与微量元素脂肪酸与微量元素磷脂质、胆固醇、前列腺素等，铜、锌等；磷脂质、胆固醇、前列腺素等，铜、锌等；蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂，使胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害；，使胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害；起起缓冲缓冲作用，作用，保证培养液保证培养液pH的稳定。的稳定。不足：不足：成分复杂，含已知或未知成分，成分复杂，含已知或未知成分，研究激素、细胞因子及药物的作用时，干扰研究激素、细胞因子及药物的作用时，干扰分析分析；产产品品生生产产 增增加加细细胞胞培培养养后后产产物物提提取取的的难难度度，或或影影响产品的响产品的质量质量；大规模培养大规模培养 成本成本过高。过高。消消除除因因不不同同批批次次血血清清之之间间的的差差异异而而造造成成的的实实验验误误差差，保证实验结果的准确性与稳定性；保证实验结果的准确性与稳定性；减少血清中可能存在的支原体、病毒所造成的减少血清中可能存在的支原体、病毒所造成的污染污染；3.3.无血清培养基无血清培养基优点优点 与含有血清的培养基相比与含有血清的培养基相比产产品品的的分分离离纯纯化化更更加加容容易易，简简化化鉴鉴定定细细胞胞工工程程产产品品的的程序；程序；来源稳定来源稳定，供应充足。，供应充足。无血清培养基组成：无血清培养基组成：基础培养基基础培养基+替代血清作用的补充成分。替代血清作用的补充成分。1激素和生长因子：激素和生长因子：激素胰岛素、胰高血糖素、生长激素等多肽激素激素胰岛素、胰高血糖素、生长激素等多肽激素 及孕酮、氢化可的松、雌二醇等甾体类激素。及孕酮、氢化可的松、雌二醇等甾体类激素。胰岛素调节和控制细胞内多种代谢途径，胰岛素调节和控制细胞内多种代谢途径，加强糖原、蛋白质、甘油三酯及加强糖原、蛋白质、甘油三酯及DNA的合成。的合成。生长因子表皮生长因子、神经生长因子、成纤维生长生长因子表皮生长因子、神经生长因子、成纤维生长因子、血小板生长因子等。因子、血小板生长因子等。补充成分种类：补充成分种类：2.结合蛋白：结合蛋白：转铁蛋白增强细胞摄取和利用培养液中铁的能力，转铁蛋白增强细胞摄取和利用培养液中铁的能力，可结合有毒金属离子解除其毒性；可结合有毒金属离子解除其毒性；白白蛋蛋白白与与脂脂类类、金金属属离离子子、激激素素等等结结合合后后可可以以增增强强其作用，刺激细胞增殖。其作用，刺激细胞增殖。3.3.贴壁和铺展因子：贴壁和铺展因子：常用的贴壁因子有纤维连结素、多聚赖氨酸、胶原，常用的贴壁因子有纤维连结素、多聚赖氨酸、胶原，血清铺展因子则是一种糖蛋白。血清铺展因子则是一种糖蛋白。4.4.低分子量营养因子和元素：主要有维生素低分子量营养因子和元素：主要有维生素A A、抗坏血酸、抗坏血酸、-生育酚、硒等生育酚、硒等（四）动物细胞培养的环境条件（四）动物细胞培养的环境条件培培养养基基，培培养养环环境境无无毒毒无无菌菌；合合适适的的温温度度、湿湿度度、气气体环境和体环境和pH值。值。1.培养环境无毒无菌：培养环境无毒无菌：动物细胞动物细胞 体内体内 强大强大免疫系统免疫系统，清除和抵抗病原体，清除和抵抗病原体免受侵害免受侵害 体外培养体外培养 失去抵御能力失去抵御能力 保证环境的无毒无菌保证环境的无毒无菌(首要条件首要条件)加双抗液加双抗液青霉素、链霉素青霉素、链霉素以抑制可能存在的细菌和霉菌的生长以抑制可能存在的细菌和霉菌的生长2温度哺乳动物细胞温度哺乳动物细胞3537，动物细胞耐低温能力强于耐高温能力，动物细胞耐低温能力强于耐高温能力，41 细胞严重受损，细胞严重受损，4 细胞也能存活数日。细胞也能存活数日。培养物培养物+保护剂保护剂二甲亚砜（二甲亚砜（DMSO）或甘油）或甘油 -80或液氮罐（温度可降至或液氮罐（温度可降至-196）可长期保存。可长期保存。3 3渗透压：渗透压：哺乳动物细胞哺乳动物细胞 260260320mOsm320mOsmkgkg 渗透压可略低渗透压可略低 培养过程中水分蒸发培养过程中水分蒸发渗透压渗透压4 气体环境与气体环境与pH：一般为一般为95的空气的空气+5%CO2，O2 参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生长，参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生长，CO2 细胞生长所必需的成分，细胞生长所必需的成分，细胞的代谢产物，细胞的代谢产物，维持培养液的维持培养液的pH。大多数细胞生长的适宜大多数细胞生长的适宜pH是是7.27.4 NaHCO3 细胞培养过程中不断释放出细胞培养过程中不断释放出CO2，使培养液变酸，使培养液变酸，添加一定量的添加一定量的NaHCO3 碳酸盐缓冲系统碳酸盐缓冲系统维持培维持培养液养液pH值相对稳定值相对稳定（五）动物细胞种质保存与运输（五）动物细胞种质保存与运输 超低温冰冻方法超低温冰冻方法 长期保存长期保存 细细胞胞冻冻存存液液中中加加入入保保护护剂剂 DMSO或或甘甘油油，将将细细胞胞密封保存于密封保存于-80或或-196的液氮罐中。的液氮罐中。1.保护剂甘油或保护剂甘油或DMSO，速渗透入速渗透入胞内结合胞内结合H2O，降低冰点，延缓冻结过程，降低冰点，延缓冻结过程，同时增加同时增加胞膜对水的通透性胞膜对水的通透性，使，使H2O在冻结前缓慢透出在冻结前缓慢透出胞外，减少胞内冰晶，降低因冰晶形成而造成的胞损伤。胞外，减少胞内冰晶，降低因冰晶形成而造成的胞损伤。使用浓度使用浓度 甘油甘油520，DMSO 510。影响细胞冻存质量的因素：影响细胞冻存质量的因素：DMSO 与与甘甘油油相相比比，作作用用更更快快，膜膜通通透透性性更更强强，抗抗冻冻伤伤能能力力也也更更强强，细细胞胞在在DMSO中中30秒秒即即可可达达到到细细胞胞内内外外平衡（甘油需平衡（甘油需2h）实验室普遍采用。实验室普遍采用。2.细细胞胞悬悬液液的的冻冻存存速速度度:降降低低冻冻存存速速度度使使冰冰晶晶尽尽量量在在胞胞外形成，减少胞内冰晶的形成外形成，减少胞内冰晶的形成降低对细胞的伤害。降低对细胞的伤害。先先缓缓降降至至一一定定温温度度，如如-30，使使胞胞外外冻冻结结，胞胞内内脱脱水，再迅速降温。水，再迅速降温。3.3.冻存后用液氮超低温保藏冻存后用液氮超低温保藏 -150-150-196-196，细胞所有理化活动均降至最低限度，或忽略不计细胞所有理化活动均降至最低限度，或忽略不计长期储存。长期储存。4.细胞复苏时的融化速度。细胞复苏时的融化速度。细细胞胞冻冻存存管管,取取出出迅迅速速升升温温胞胞外外结结晶晶在在短短时时间间内内融融化化避避免免因因缓缓慢慢融融化化而而使使水水分分渗渗入入胞胞内内再再次次形形成成冰冰晶晶对对细胞造成的伤害。细胞造成的伤害。操作：取出后立即投入到操作：取出后立即投入到3738水浴。水浴。大大规规模模培培养养：在在人人工工条条件件下下高高密密度度大大量量培培养养特特定定的的动动物物细胞从而生产珍贵医药产品的技术细胞从而生产珍贵医药产品的技术 是实现大规模生产的关键技术。是实现大规模生产的关键技术。产品：疫苗、激素、细胞因子、单克隆抗体等。产品：疫苗、激素、细胞因子、单克隆抗体等。（六）动物细胞的大规模培养（六）动物细胞的大规模培养1.培养基培养基 与实验室培养基基本一致（除用无血清培养基外）。与实验室培养基基本一致（除用无血清培养基外）。无血清培养基中难生长细胞无血清培养基中难生长细胞采用渐适法驯化细胞采用渐适法驯化细胞使适应于在无血清培养基中生长。使适应于在无血清培养基中生长。*无血清培养液中易出现细胞毒（与水中的微量元素无血清培养液中易出现细胞毒（与水中的微量元素或有机物污染有关）或有机物污染有关）制备培养液须用制备培养液须用高纯水高纯水，经，经0.22 m的微孔滤膜的微孔滤膜过滤除菌。过滤除菌。培养方法：悬浮培养，贴壁培养，贴壁培养方法：悬浮培养，贴壁培养，贴壁-悬浮培养。悬浮培养。（1）悬浮培养）悬浮培养非贴壁依赖性细胞和兼性贴壁细胞非贴壁依赖性细胞和兼性贴壁细胞气升式气升式生物反应器或生物反应器或通气搅拌式通气搅拌式反应器反应器动物细胞动物细胞 胞膜薄，娇嫩易碎，抗剪切能力弱胞膜薄，娇嫩易碎，抗剪切能力弱气升式反应器工作原理：通过气体的上下循环起到供气升式反应器工作原理：通过气体的上下循环起到供氧以及搅拌的效果。氧以及搅拌的效果。培养规模培养规模 5L、30L、100L到到1000L 2 2动物细胞大规模培养系统动物细胞大规模培养系统而微生物可用而微生物可用搅拌式发酵罐搅拌式发酵罐（2）贴壁培养（单层细胞培养）贴壁培养（单层细胞培养）贴壁依赖性细胞和兼性贴壁细胞贴壁依赖性细胞和兼性贴壁细胞转瓶（滚瓶）培养转瓶（滚瓶）培养 培养瓶旋转使吸附在瓶壁上的细胞培养瓶旋转使吸附在瓶壁上的细胞交替与培养液交替与培养液及空气接触及空气接触而增加细胞吸附面积。而增加细胞吸附面积。优点：普遍适用于大多数细胞的培养，规模较易放优点：普遍适用于大多数细胞的培养，规模较易放大，容易实现大，容易实现罐流培养罐流培养(及时放出陈旧培养液，补加及时放出陈旧培养液，补加新鲜培养液新鲜培养液)。缺点：操作较为繁琐，传代或放大时需要用蛋白酶缺点：操作较为繁琐，传代或放大时需要用蛋白酶将其从瓶壁上消化下来。将其从瓶壁上消化下来。（3）微载体培养）微载体培养 基本原理：将细胞附着在微载体的表面，后置于培养基本原理：将细胞附着在微载体的表面，后置于培养液中悬浮培养，使细胞在载体表面单层生长繁殖。液中悬浮培养，使细胞在载体表面单层生长繁殖。商品微粒商品微粒:DEAE-交联葡聚糖、二甲氨丙基聚丙烯酰胺交联葡聚糖、二甲氨丙基聚丙烯酰胺（Biocarrier）及聚苯乙烯（）及聚苯乙烯（Biosilon）等市售。）等市售。优点：优点：细胞附着表面积增大；细胞附着表面积增大；细胞生长环境均一，条件易于控制；细胞生长环境均一，条件易于控制；取样及细胞计数简单；取样及细胞计数简单；细胞与培养液易于分离；细胞与培养液易于分离；大规模培养只需对微生物发酵罐或气升式深大规模培养只需对微生物发酵罐或气升式深层培养系统稍加改进即可；层培养系统稍加改进即可；适合于培养原代细胞、二倍体细胞株以及基适合于培养原代细胞、二倍体细胞株以及基因重组细胞。因重组细胞。（4）固定化包埋培养与微囊培养）固定化包埋培养与微囊培养固定化包埋培养固定化包埋培养(大载体培养大载体培养)用高分子材料将细胞包埋并制成固定化颗粒，在用高分子材料将细胞包埋并制成固定化颗粒，在培养液中培养。培养液中培养。海藻酸钙包埋海藻酸钙包埋:细胞溶液与海藻酸钠溶液混合，通过喷珠装置将细胞溶液与海藻酸钠溶液混合，通过喷珠装置将其喷入氯化钙溶液其喷入氯化钙溶液直径约直径约2.6mm固定化颗粒固定化颗粒，去除，去除氯化钙溶液，通入培养液培养。氯化钙溶液，通入培养液培养。海藻酸钠分子中含有重复排列的葡糖醛酸和甘露海藻酸钠分子中含有重复排列的葡糖醛酸和甘露糖酸与钙离子作用后形成网络状凝胶珠，而将细胞包糖酸与钙离子作用后形成网络状凝胶珠，而将细胞包埋于其中。埋于其中。微囊培养微囊培养：细胞包被在薄的半透性膜中细胞包被在薄的半透性膜中 采用海藻酸钠包埋细胞制成固定化凝胶颗粒，采用海藻酸钠包埋细胞制成固定化凝胶颗粒，再用长链氨基酸聚合物、多聚赖氨酸包被形成坚再用长链氨基酸聚合物、多聚赖氨酸包被形成坚韧、多孔可通透的外膜。韧、多孔可通透的外膜。液化胶化小珠，使其成胶的物质从多孔膜流出，液化胶化小珠，使其成胶的物质从多孔膜流出，活细胞或生物活性物质留在多孔外膜内，活细胞或生物活性物质留在多孔外膜内，置气升式培养系统中进行增殖。置气升式培养系统中进行增殖。（5）中空纤维培养）中空纤维培养 数千根中空纤维封存于特制的圆筒里，组成一个数千根中空纤维封存于特制的圆筒里，组成一个中空纤维培养系统。中空纤维培养系统。“内室内室”灌流无血清培养液供细胞生长；灌流无血清培养液供细胞生长；“外室外室”细胞贴附于管壁上，吸取从细胞贴附于管壁上，吸取从“内室内室”渗透出来的养分，迅速生长繁殖。渗透出来的养分，迅速生长繁殖。单抗等细胞分泌的大分子量物质只能留在外室，单抗等细胞分泌的大分子量物质只能留在外室，且不断被浓缩。且不断被浓缩。收集产物收集产物 打开打开“外室外室”总出口总出口 代谢废物为小分子物质，渗进内室，从其出口代谢废物为小分子物质，渗进内室，从其出口流出，不对外室细胞产生毒害流出，不对外室细胞产生毒害优点：优点：培养器体积小，细胞密度高；培养器体积小，细胞密度高；产物浓度高、纯度高；产物浓度高、纯度高；自动化程度高，细胞生长周期长。自动化程度高，细胞生长周期长。缺点：价格较贵。缺点：价格较贵。（5）中空纤维培养）中空纤维培养第二节第二节 细胞融合细胞融合 离体条件下用人工将两或多个不同种的细胞通过无离体条件下用人工将两或多个不同种的细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的过程性方式融合成一个杂合细胞的过程 融合后的细胞含两或多个不同的细胞核（异核体），融合后的细胞含两或多个不同的细胞核（异核体），随后细胞的有丝分裂中，有些不同胞核的染色体合并到随后细胞的有丝分裂中，有些不同胞核的染色体合并到一个核中一个核中单核杂种细胞，而不能形成单核的融合细胞单核杂种细胞，而不能形成单核的融合细胞在培养过程中逐步死亡。在培养过程中逐步死亡。细胞融合细胞融合(体细胞杂交体细胞杂交):):法国法国 Barski 1960年年过过程程：细细胞胞在在促促融融因因子子的的作作用用下下发发生生凝凝集集现现象象，胞胞间间质质膜粘连，细胞融合，在培养过程中核融合膜粘连，细胞融合，在培养过程中核融合杂种细胞。杂种细胞。1）细胞的准备）细胞的准备 贴壁培养的细胞，两亲本细胞混合培养贴壁培养的细胞，两亲本细胞混合培养 悬浮细胞悬浮细胞 制成一定浓度的悬液；制成一定浓度的悬液；2）诱导融合）诱导融合 需要添加促融剂诱导融合；需要添加促融剂诱导融合；一、动物细胞融合一、动物细胞融合小鼠和田鼠，小鼠和小鸡，小鼠和人小鼠和田鼠，小鼠和小鸡，小鼠和人 远缘和超远缘的远缘和超远缘的体细胞杂交。体细胞杂交。1、动物细胞融合的基本过程、动物细胞融合的基本过程3）杂杂种种细细胞胞的的选选择择 利利用用选选择择性性培培养养基基，使使亲亲本本细细胞胞死死亡而让杂种细胞存活；亡而让杂种细胞存活；4）杂杂种种细细胞胞克克隆隆 选选择择与与纯纯化化杂杂种种细细胞胞，再再经经培培养养得得所所需要的无性繁殖系。需要的无性繁殖系。2.促融剂促融剂（1）病毒：仙台病毒）病毒：仙台病毒(灭活灭活)两两种种不不同同动动物物细细胞胞混混合合物物中中存存在在大大剂剂量量病病毒毒,即即细细胞胞周周围围布布满满病病毒毒，病病毒毒或或其其组组分分在在细细胞胞间间起起粘粘连连作作用用使使细细胞胞聚聚集集成成团团不不同同胞胞膜膜蛋蛋白白及及膜膜脂脂质质分分子子重重新新排布而结合成一个整体。排布而结合成一个整体。诱导细胞融合的关键诱导细胞融合的关键使细胞膜蛋白重新分布使细胞膜蛋白重新分布膜中脂质分子重排膜中脂质分子重排（2）PEG诱诱导导：当当不不同同种种属属动动物物细细胞胞混