第七章---微生物的遗传变异和育种课件.ppt

第第 七七 章章 微生物的遗传变异微生物的遗传变异和育种和育种第一节第一节 遗传变异的物质基础遗传变异的物质基础第二节第二节 基因突变和诱变育种基因突变和诱变育种第三节第三节 基因重组和杂交育种基因重组和杂交育种第四节第四节 基因工程基因工程第五节第五节 菌种的衰退、复壮与保藏菌种的衰退、复壮与保藏遗传和变异遗传和变异遗传遗传遗传遗传：亲代将自身一整套遗传因子传递给下一代的行：亲代将自身一整套遗传因子传递给下一代的行为和功能。为和功能。变异变异变异变异：生物体的遗传物质结构和数量的改变，在群体：生物体的遗传物质结构和数量的改变，在群体中以极低的几率（中以极低的几率（10-510-6）出现，性状变化幅度）出现，性状变化幅度大；新性状稳定、可遗传。大；新性状稳定、可遗传。基本概念基本概念遗传型遗传型遗传型遗传型（genotype）：一个生物体所含有的基因的总）：一个生物体所含有的基因的总和。和。表型表型表型表型（phenotype）：一个生物体所具有的一切外表特）：一个生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和。征和内在特性的总和。饰变饰变饰变饰变（modification）：指生物体由于非遗传因素引起）：指生物体由于非遗传因素引起的表型改变，变化发生在的表型改变，变化发生在转录、转译转录、转译水平，特点是水平，特点是几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化，几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化，性状变化的幅度小，不遗传，引起饰变的因素消失性状变化的幅度小，不遗传，引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。举例：后，表型即可恢复。举例：Serratiamarcescens(粘粘质沙雷氏菌）质沙雷氏菌）的红色素在的红色素在25和和37的变化。的变化。表型的差异只与环境有关表型的差异只与环境有关特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为表型饰变表型饰变Productionofaredpigment(prodigiosin)bySerratiamarcescens.Fromlefttoright:slantculturegrownat25,slantculturegrownat37,brothculturegrownat25,brothculturegrownat37.种质连续理论种质连续理论种质连续理论种质连续理论：18831889年间德国学者年间德国学者Weissmann提出，提出，认为遗传物质是一种具有认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物特定分子结构的化合物，具有稳定，具有稳定性和连续性。性和连续性。基因学说基因学说基因学说基因学说：二十世纪初发现了染色体并提出基因学说，使得遗：二十世纪初发现了染色体并提出基因学说，使得遗传物质基础的范围缩小到传物质基础的范围缩小到染色体染色体上。上。染色体由核酸和蛋白质两种长链高分子组成。染色体由核酸和蛋白质两种长链高分子组成。20多种氨基酸多种氨基酸经过不同排列组合，可以演变出的蛋白质数目几乎可以达到经过不同排列组合，可以演变出的蛋白质数目几乎可以达到一个天文数字，而核酸的组成却简单得多，一般仅由一个天文数字，而核酸的组成却简单得多，一般仅由4种不种不同的核苷酸组成，它们通过排列组合只能产生较少种类的核同的核苷酸组成，它们通过排列组合只能产生较少种类的核酸，因此当时认为决定生物遗传型的染色体和基因，其活性酸，因此当时认为决定生物遗传型的染色体和基因，其活性成分是蛋白质。成分是蛋白质。DNADNA是遗传变异的物质基础的证明是遗传变异的物质基础的证明是遗传变异的物质基础的证明是遗传变异的物质基础的证明：1944年以后，利用微生物年以后，利用微生物为实验对象进行的三个著名实验（肺炎球菌的转化试验、噬为实验对象进行的三个著名实验（肺炎球菌的转化试验、噬菌体感染试验、病毒的拆开与重建试验）充分证明了菌体感染试验、病毒的拆开与重建试验）充分证明了DNA是是遗传物质。遗传物质。第一节第一节 遗传变异的物质基础遗传变异的物质基础一、证明一、证明DNADNA是遗传物质是遗传物质的三个经典实验的三个经典实验（一）经典转化实验（一）经典转化实验F.Griffith，1928年年研究对象：研究对象：Streptococcuspneumoniae（肺炎双球菌）（肺炎双球菌）S型菌株：有致病性，菌落表面光滑，有荚膜型菌株：有致病性，菌落表面光滑，有荚膜R型菌株：型菌株：S型突变菌株，无致病性，菌落表面粗糙，型突变菌株，无致病性，菌落表面粗糙，无荚膜无荚膜（2 2）细菌培养实验）细菌培养实验热死热死S S菌菌不生长不生长活活R R 菌菌长出长出R R菌菌热死热死S S菌菌+活活R R菌菌长出大量长出大量R R菌和菌和1010-6-6S S菌菌（3 3）S S型菌的无细胞抽提液试验型菌的无细胞抽提液试验活活R R菌菌+S+S菌无细胞抽提液菌无细胞抽提液长出大量长出大量R R菌和少量菌和少量S S菌菌（1 1）动物实验）动物实验对小鼠注射活对小鼠注射活R R菌或死菌或死S S菌菌 小鼠存活小鼠存活对小鼠注射活对小鼠注射活S S菌菌小鼠死亡小鼠死亡对小鼠注射活对小鼠注射活R R菌和热死菌和热死S S菌菌 小鼠死亡小鼠死亡抽取心血分离活的抽取心血分离活的S S菌菌GriffithGriffith转化试验转化试验示意示意混合培养混合培养RII型活菌型活菌SIII型活菌型活菌SIII型热死菌型热死菌RII型活菌型活菌SIII型活菌型活菌健康健康健康健康健康健康健康健康健康健康健康健康健康健康病死病死病死病死病死病死以上实验说明：加热杀死的以上实验说明：加热杀死的S型细菌细胞内型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入式进入R型细胞并使型细胞并使R型细胞获得稳定的型细胞获得稳定的遗传性状。遗传性状。1944年年O.T.Avery、C.M.MacLeod和和M.McCarty从热死从热死S型型S.pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，在离体条件中提纯了可能作为转化因子的各种成分，在离体条件下进行了转化试验下进行了转化试验实验证明，只有实验证明，只有S S型细菌的型细菌的DNADNA才能将才能将S.PneumoniaeS.Pneumoniae的的R R型转化为型转化为S S型。且型。且DNADNA纯度越高，转化效率也越高。说明纯度越高，转化效率也越高。说明S S型菌株转移给型菌株转移给R R型菌株的，是遗传因子型菌株的，是遗传因子DNADNA。（二）噬菌体感染实验（二）噬菌体感染实验vA.D.Hershey和和M.Chase，1952年年v实验证明，进入实验证明，进入细菌细胞内部的细菌细胞内部的物质是物质是DNA。vDNA包含有产生包含有产生完整噬菌体的全完整噬菌体的全部信息。部信息。（三）植物病毒的重建实验（三）植物病毒的重建实验v为了证明核酸是遗传物质，为了证明核酸是遗传物质，H.Fraenkel-Conrat（1956）用含）用含RNA的烟草花叶病毒的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的）进行了著名的植物病毒重建实验植物病毒重建实验。v将将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后核心相分离。分离后的的RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。能分离出正常病毒粒子。实验证明，遗传信息的流向与实验证明，遗传信息的流向与DNADNA的传递是一致的。的传递是一致的。上述结果上述结果说明，在说明，在RNARNA病毒中，病毒中，遗传的物质基础也是核酸。遗传的物质基础也是核酸。二、遗传物质在微生物细胞内存在的二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式部位和方式（一）遗传物质在（一）遗传物质在7 7个水平上的形式个水平上的形式1 1、细胞水平、细胞水平2 2、细胞核水平、细胞核水平3 3、染色体水平、染色体水平4 4、核酸水平、核酸水平5 5、基因水平、基因水平6 6、密码子水平、密码子水平7 7、核苷酸水平、核苷酸水平1、细胞水平、细胞水平v真核微生物：细胞核真核微生物：细胞核v原核微生物：核区原核微生物：核区v细胞核或核区的数目在不同的微生物中是不同的细胞核或核区的数目在不同的微生物中是不同的真核生物真核生物 细胞核细胞核 核染色体核染色体原核生物原核生物 核区核区 DNADNA链链核基因组核基因组在核基因组之外，还存在各种形式的核外遗传物质在核基因组之外，还存在各种形式的核外遗传物质2、细胞核水平、细胞核水平遗传物质类型遗传物质类型核基因组核基因组核外染色体核外染色体真核生物真核生物原核生物原核生物细胞质基因细胞质基因共生生物共生生物2um质粒质粒线粒体线粒体叶绿体等叶绿体等F因子因子R因子因子Col质粒质粒Ti质粒质粒巨大质粒巨大质粒降解性质粒降解性质粒3、染色体水平、染色体水平v染色体是由组蛋白与染色体是由组蛋白与DNA构成的线状结构构成的线状结构v染色体的数目在不同的染色体的数目在不同的生物中是不同的生物中是不同的v染色体的倍数在同一生染色体的倍数在同一生物的不同生活时期是不物的不同生活时期是不同的同的4、核酸水平、核酸水平v核酸种类：核酸种类：DNA，RNAv核酸结构：双链、单链；环状，线状，超螺旋状核酸结构：双链、单链；环状，线状，超螺旋状vDNA长度：因种而异长度：因种而异v微生物基因组测序工作是在人类基因组计划的促进微生物基因组测序工作是在人类基因组计划的促进下开始的，最开始是作为模式生物，后来不断发展，下开始的，最开始是作为模式生物，后来不断发展，已成为研究微生物学的最有力的手段。已成为研究微生物学的最有力的手段。DNADNA就是脱氧核糖核酸（长链）就是脱氧核糖核酸（长链）腺嘌呤（A）鸟嘌呤（G）胸腺嘧啶（T）胞嘧啶（C）ATCGAAATTTTTTAAAGGGGGCCCCCGC基因测序基因测序就是读出就是读出A-C-T-G-T-G-A-A-C-G.5、基因水平、基因水平v基因是什么？基因是什么？v基因是生物体内具有自主基因是生物体内具有自主复制能力的最小复制能力的最小遗传功能遗传功能单位单位，其物质基础是一段，其物质基础是一段核酸序列。核酸序列。v众多基因构成染色体。众多基因构成染色体。v基因记录和传递遗传信息。基因记录和传递遗传信息。v基因决定生物体的生、长、基因决定生物体的生、长、病、老、死等一切生命现病、老、死等一切生命现象象 染染色色体体基因基因基因基因DNADNA基因控制基因控制PrPr因而控制性状因而控制性状GATCTAGAUDNAmRNA天冬天冬氨酸氨酸大肠杆菌基因组大肠杆菌基因组4100个基因，个基因，4.7106bp遗传信息的连续性遗传信息的连续性功能相关的结构基因组成操纵子功能相关的结构基因组成操纵子结构基因单拷贝及结构基因单拷贝及rRNA多拷贝多拷贝基因的重复序列少而短基因的重复序列少而短原核生物基因调控系统原核生物基因调控系统操纵子操纵子RPO结构基因结构基因启动基因启动基因操纵基因操纵基因调节调节基因基因6、密码子水平、密码子水平v遗传密码遗传密码v密码子密码子7、核苷酸水平、核苷酸水平核苷酸是最小核苷酸是最小突变单位和交换单位突变单位和交换单位几个重要数据几个重要数据vbp,分子量约分子量约650；v1*106的的dsDNA约为约为1.5kb或或0.5um;v3nmol的碱基重量约为的碱基重量约为1ug.v细菌的基因组为细菌的基因组为19个个Mb。（三）原核生物的质粒（三）原核生物的质粒1、定义和特点、定义和特点质粒（质粒（plasmid）：一种独立于染色体外，能进行自主复制的）：一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，通常以共价闭合环状细胞质遗传因子，通常以共价闭合环状(covalentlyclosedcircle，简称，简称CCC)的超螺旋双链的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；分子存在于细胞中；也发现有线型双链也发现有线型双链DNA质粒和质粒和RNA质粒；质粒；质粒分子的大小范围从质粒分子的大小范围从1kb左右到左右到1000kb；细菌质粒多在细菌质粒多在10kb以内）以内）主要存在于各种微生物细胞中。主要存在于各种微生物细胞中。质粒所含的基因对宿主细胞一般是质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需非必需的；的；在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势。从而使宿主得到生长优势。质粒与核染色体的复制可以不同步；在某些条件下能够消除；质粒与核染色体的复制可以不同步；在某些条件下能够消除；有些质粒可以在不同菌株之间转移；有些可以整合核染色体，有些质粒可以在不同菌株之间转移；有些可以整合核染色体，称为附加体；另外，质粒还有重组的功能。称为附加体；另外，质粒还有重组的功能。2、质粒在基因工程中的应用、质粒在基因工程中的应用（1）体积小，易分离和操作）体积小，易分离和操作（2）环状，稳定）环状，稳定（3）独立复制）独立复制（4）拷贝数多）拷贝数多（5）存在标记位点，易筛选）存在标记位点，易筛选E.coli的的pBR322质粒是一个质粒是一个常用的克隆载体常用的克隆载体3、质粒的分离与检测、质粒的分离与检测t质粒的分离一般包括细胞的裂解，蛋白质和质粒的分离一般包括细胞的裂解，蛋白质和RNA的去除，的去除，以及设法使质粒以及设法使质粒DNA和基因组和基因组DNA分离等步骤。分离等步骤。u超速离心或琼脂糖凝胶超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；电泳后观察；u对于实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点，对于实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点，如抗药性初步判断。如抗药性初步判断。u提取所有胞内提取所有胞内DNA后电镜观察；后电镜观察；4、质粒的主要种类、质粒的主要种类质粒所编码质粒所编码的功能和赋的功能和赋予宿主的表予宿主的表型效应型效应致育因子（致育因子（Fertilityfactor，F因子因子）抗性因子（抗性因子（Resistancefactor，R因子因子）产细菌素的质粒产细菌素的质粒（Bacteriocinproductionplasmid）毒性质粒（毒性质粒（virulenceplasmid）代谢质粒（代谢质粒（Metabolicplasmid）隐秘质粒（隐秘质粒（crypticplasmid）（1）致育因子致育因子(Fertilityfactor，F因子因子)又称又称F质粒，其大小约质粒，其大小约100kb，这是最早发现的一种与大肠杆菌，这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象（接合作用）有关的质粒。的有性生殖现象（接合作用）有关的质粒。携带携带F质粒的菌株称为质粒的菌株称为F+菌株菌株（相当于雄性），无（相当于雄性），无F质粒的质粒的菌株称为菌株称为F-菌株（相当于雌性）菌株（相当于雌性）。F因子能以游离状态因子能以游离状态(F+)和和以与染色体相结合的状态以与染色体相结合的状态(Hfr)存在于细胞中，所以存在于细胞中，所以又称之为附加体又称之为附加体pisome)。（2）抗性因子（抗性因子（Resistancefactor，R因子）因子）包括抗药性和抗重金属二大类，简称包括抗药性和抗重金属二大类，简称R R质粒。质粒。抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。R R质粒质粒抗性转移因子（抗性转移因子（RTFRTF）：转移和复制基因：转移和复制基因抗性决定因子抗性决定因子：抗性基因：抗性基因R100质粒质粒(89kb)可使宿主对下列药物及重金属具有抗性：可使宿主对下列药物及重金属具有抗性：汞（汞（mercuricion，mer）四环素（）四环素（tetracycline，tet）链）链霉素霉素(Streptomycin,Str)、磺胺、磺胺(Sulfonamide,Su)、氯霉素、氯霉素(Chlorampenicol,Cm)、夫西地酸（、夫西地酸（fusidicacid，fus）并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于抗性质粒上。并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于抗性质粒上。（3）产细菌素的质粒产细菌素的质粒（Bacteriocinproductionplasmid）产大肠杆菌素因子。产大肠杆菌素因子。大肠杆菌素大肠杆菌素是一种由是一种由E.coli的某些菌株所分泌的细菌蛋白，由质粒编码，具的某些菌株所分泌的细菌蛋白，由质粒编码，具有通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专有通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死不含一地杀死不含Col因子的近缘的其它肠道细菌。因子的近缘的其它肠道细菌。凡带凡带Col因子的菌株，由于质粒本身编码一种免因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。伤害。一般都位于一般都位于质粒或转座质粒或转座子上，因此，子上，因此，细菌素可以细菌素可以杀死同种但杀死同种但不携带该质不携带该质粒的菌株。粒的菌株。细菌素一般根据产生菌的种类进行命名：细菌素一般根据产生菌的种类进行命名：大肠杆菌（大肠杆菌（E.coli）产生的细菌素为）产生的细菌素为colicins（大肠杆菌（大肠杆菌素），而质粒被称为素），而质粒被称为Col质粒。质粒。细菌素结构基因涉及细菌素结构基因涉及细菌素运输细菌素运输及及发挥作用的蛋白质发挥作用的蛋白质的基因和的基因和赋予宿赋予宿主对该细菌素具有主对该细菌素具有“免疫力免疫力”的相的相关产物的基因关产物的基因（4）毒性质粒（毒性质粒（virulenceplasmid）许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，这些质粒具有这些质粒具有编码毒素编码毒素的基因，其产物对宿主的基因，其产物对宿主（动物、植物）造成伤害。（动物、植物）造成伤害。产毒素大肠杆菌是引起人类和动物腹泻的主要病原产毒素大肠杆菌是引起人类和动物腹泻的主要病原菌之一，其中许多菌株含有为一种或多种编码肠毒菌之一，其中许多菌株含有为一种或多种编码肠毒素的质粒。素的质粒。苏云金杆菌含有编码苏云金杆菌含有编码内毒素内毒素(伴孢晶体中伴孢晶体中)的质粒的质粒根癌土壤杆菌所含根癌土壤杆菌所含TiTi质粒是引起双子叶植物冠瘿瘤质粒是引起双子叶植物冠瘿瘤的致病因子的致病因子Ti质粒质粒中的中的T-DNA可携带任何外源基因整合到植物基因组中，可携带任何外源基因整合到植物基因组中，存在于根癌土壤杆菌（存在于根癌土壤杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）中。赋予）中。赋予宿主引起许多双子叶植物的根癌的特性。当带有宿主引起许多双子叶植物的根癌的特性。当带有Ti质粒的细菌质粒的细菌侵入植物细胞中后，在其细胞中溶解，把细菌的侵入植物细胞中后，在其细胞中溶解，把细菌的DNA释放至植释放至植物细胞中。含有复制子的物细胞中。含有复制子的Ti质粒的小片段与植物细胞中的核染质粒的小片段与植物细胞中的核染色体发生整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它色体发生整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。是植物基因工程中有效的克隆载体。转变成癌细胞。是植物基因工程中有效的克隆载体。（5）代谢质粒（代谢质粒（Metabolicplasmid）质粒上携带有有利于微生物生存的基因，如能降解某质粒上携带有有利于微生物生存的基因，如能降解某些基质的酶，进行共生固氮，或产生抗生素（某些放些基质的酶，进行共生固氮，或产生抗生素（某些放线菌）等。线菌）等。降解质粒：降解质粒：如假单胞菌属中发现。它们的降解性质粒可为一系如假单胞菌属中发现。它们的降解性质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解的物列能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解的物质做碳源。这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分解质做碳源。这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分解CAM（樟（樟脑）质粒，脑）质粒，XYL（二甲苯）质粒，（二甲苯）质粒，SAL（水杨酸）质粒，（水杨酸）质粒，MDL（扁（扁桃酸）质粒，桃酸）质粒，NAP（奈）质粒和（奈）质粒和TOL（甲苯）质粒等。（甲苯）质粒等。将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式的简单形式，环境保护方面具有重要的意义。环境保护方面具有重要的意义。（6 6）隐秘质粒（隐秘质粒（cryptic plasmidcryptic plasmid）隐秘质粒不显示任何表型效应，它们的存在只有通过物隐秘质粒不显示任何表型效应，它们的存在只有通过物理的方法，理的方法，如酵母菌的如酵母菌的2um质粒。质粒。用凝胶电泳检测细胞用凝胶电泳检测细胞抽提液等方法才能发现。抽提液等方法才能发现。它们存在的生物学意义，目前几乎不了解。它们存在的生物学意义，目前几乎不了解。在应用上，很多隐秘质粒被加以改造作为基因工程的载体在应用上，很多隐秘质粒被加以改造作为基因工程的载体（一般加上抗性基因）（一般加上抗性基因）第二节第二节 基因突变和诱变育种基因突变和诱变育种一、基因突变一、基因突变二、突变与育种二、突变与育种一、基因突变一、基因突变v一个基因内部遗传结构或一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变序列的任何改变,可遗可遗传传,自发或诱变产生。自发或诱变产生。野生型（原始性状）野生型（原始性状）基因突变基因突变突变型（新性状）突变型（新性状）狭义：点突变狭义：点突变广义：基因突变和染色体畸变广义：基因突变和染色体畸变基因突变基因突变（一）微生物突变的主要类型（一）微生物突变的主要类型选择性突变株选择性突变株 菌落形态突变型菌落形态突变型菌体形态突变型菌体形态突变型非选择性突变株非选择性突变株营养突变体营养突变体(营养缺陷型营养缺陷型)抗性突变体抗性突变体条件致死突变体条件致死突变体抗原突变型抗原突变型产量突变型产量突变型按突变株按突变株的表型分的表型分（二）突变率（二）突变率定义定义：每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。突变率为突变率为108是指该细胞在一亿次细胞分裂中，会发生一次突是指该细胞在一亿次细胞分裂中，会发生一次突变。突变率也可以用每一单位群体在每一世代中产生突变株变。突变率也可以用每一单位群体在每一世代中产生突变株（mutant，即突变型）的数目来表示。如一个含，即突变型）的数目来表示。如一个含108个细胞的个细胞的群体，当其分裂为群体，当其分裂为2108个细胞时，即可平均发生一次突变的个细胞时，即可平均发生一次突变的突变率也是突变率也是108。突变率突变率=突变细胞数突变细胞数/分裂前群体细胞数分裂前群体细胞数突变是突变是独立独立独立独立的的的的。某一基因发生突变。某一基因发生突变不会影响不会影响不会影响不会影响其它基因其它基因其它基因其它基因的突变率。的突变率。在同一个细胞中同时发生两个基因突变的几率是极低的，因在同一个细胞中同时发生两个基因突变的几率是极低的，因为双重突变型的几率只是各个突变几率的乘积。为双重突变型的几率只是各个突变几率的乘积。由于突变的几率一般都极低，因此，必须采用检出选择性突变由于突变的几率一般都极低，因此，必须采用检出选择性突变株的手段，尤其是采用检出营养缺陷型的恢复突变株（株的手段，尤其是采用检出营养缺陷型的恢复突变株（backmutant或或reversemutant）或抗性突变株特别是抗药性突变）或抗性突变株特别是抗药性突变株的方法来加以确定。株的方法来加以确定。（三）基因突变的特点（三）基因突变的特点适用于整个生物界，以细菌的抗药性为例。适用于整个生物界，以细菌的抗药性为例。不对应性不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。系。自发性自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。生。稀有性稀有性：突变率低且稳定。：突变率低且稳定。独立性独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。：各种突变独立发生，不会互相影响。可诱发性可诱发性：诱变剂可提高突变率诱变剂可提高突变率。稳定性稳定性：变异性状稳定可遗传。：变异性状稳定可遗传。可逆性可逆性：从原始的野生型基因到变异株的突变称为正向：从原始的野生型基因到变异株的突变称为正向突突 变（变（forwardmutation），从突变株回到野生型的），从突变株回到野生型的过程则称为回复突变或回变（过程则称为回复突变或回变（backmutation或或reversemutation）。）。（四）基因突变自发性和不对应性的实验证明（四）基因突变自发性和不对应性的实验证明三个经典实验三个经典实验变量实验变量实验涂布实验涂布实验影印实验影印实验证明突变是自发产生证明突变是自发产生的，并且突变的性状的，并且突变的性状与引起突变的原因间与引起突变的原因间无直接对应关系。无直接对应关系。野生型野生型（原始性状）（原始性状）特定环境特定环境突变型突变型（适应环境的新性状）（适应环境的新性状）驯化驯化定向定向诱变诱变筛选筛选？突变的原因突变的原因？大肠杆菌稀释培养物大肠杆菌稀释培养物10ml10ml(培养前先分成培养前先分成5050小管小管)(在同一个大管中作整体培养在同一个大管中作整体培养)2 3 7 1 4 4 3 5 抗噬菌体菌落数抗噬菌体菌落数 抗噬菌体菌落数抗噬菌体菌落数变量试验变量试验涂布试验涂布试验 涂布敏感菌涂布敏感菌5 510104 4个个共共1212个平板个平板5 510104 4个菌落个菌落50005000个细菌个细菌/菌落菌落喷入喷入T T1 1保温保温重新涂布后重新涂布后 喷入喷入T T1 1保温保温6 6个平板共个平板共353353个菌落个菌落 6 6个平板共个平板共2828个菌落个菌落初始接种量：初始接种量：5104个个/皿皿培养培养5小时，繁殖了小时，繁殖了12.3代，每个微菌落约含代，每个微菌落约含5100个细个细菌菌.这时，每个平皿上的细胞数为：这时，每个平皿上的细胞数为：510051042.6108个个/皿皿在在6个平板上，比接种时增加的细胞数为：个平板上，比接种时增加的细胞数为：6（2.6108 5104）=15.6108在未涂布的平板上共发现在未涂布的平板上共发现28个突变，故个突变，故突变率突变率=28/15.6108=1.810 8涂布试验中突变率的计算涂布试验中突变率的计算平板影印培养试验（平板影印培养试验（replicaplating）19521952年，年，J.LederbergJ.Lederberg夫妇的论文夫妇的论文平板影印培养法和细菌突变平板影印培养法和细菌突变株的间接选择株的间接选择，更好地证明了微生物的抗药性是在未接触药，更好地证明了微生物的抗药性是在未接触药物前自发地产生的，这一突变与相应药物环境毫不相干。物前自发地产生的，这一突变与相应药物环境毫不相干。平板影印培养法平板影印培养法，是一种能达到在，是一种能达到在一系列培养皿一系列培养皿的的相同位置上相同位置上出出现现相同遗传型菌落相同遗传型菌落的接种培养方法：把长有许多菌落的母种培的接种培养方法：把长有许多菌落的母种培养皿倒置于包有灭菌丝绒布的木质圆柱印章上，使其沾上来自养皿倒置于包有灭菌丝绒布的木质圆柱印章上，使其沾上来自平板上的菌落。然后可把这一平板上的菌落。然后可把这一“印章印章”上的菌落一一接种到不上的菌落一一接种到不同的选择性培养基平板上。待这些平板培养后，对各平板相同同的选择性培养基平板上。待这些平板培养后，对各平板相同位置上的菌落作对比后，就可选出适当的突变型菌株。据报道，位置上的菌落作对比后，就可选出适当的突变型菌株。据报道，用此法可把母平板上用此法可把母平板上101020%20%量的细菌转移到丝绒布上，并可利量的细菌转移到丝绒布上，并可利用这一用这一“印章印章”接种接种8 8个子培养皿。因此，通过影印培养法，个子培养皿。因此，通过影印培养法，就可以就可以从从从从在非选择性条件下生长的细菌群体中，分离出各种类在非选择性条件下生长的细菌群体中，分离出各种类型的突变株。型的突变株。影印培养无药无药培养基培养基含药含药培养基培养基影印培养试验影印培养试验 原始敏原始敏感菌种感菌种1、诱变及其机制、诱变及其机制2、自发突变及其机制、自发突变及其机制（五）基因突变及其机制（五）基因突变及其机制 基因突变基因突变v基因突变基因突变（genemutation）简称突变，是）简称突变，是变异的一种，指生物体内遗传物质的分子变异的一种，指生物体内遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化。突结构或数量突然发生的可遗传的变化。突变率常在变率常在10-810-9范围内。范围内。突变的机制突变的机制突突变变碱基置换（转换碱基置换（转换 颠换）颠换）移码突变（缺失移码突变（缺失 添加）添加）畸变：缺失、添加、易位、倒位畸变：缺失、添加、易位、倒位 点突变点突变诱变诱变自发突变自发突变1.诱变及其机制诱变及其机制v诱变（诱变（inducedmutation):是指通过人为的方是指通过人为的方法，利用物理、化学或生物因素显著提高基法，利用物理、化学或生物因素显著提高基因自发突变频率的手段。因自发突变频率的手段。v诱变剂（诱变剂（mutagen）：凡能提高突变率的任：凡能提高突变率的任何理化因子，诱变剂的种类很多，作用方式何理化因子，诱变剂的种类很多，作用方式多样。即使是同一种诱变剂，也常有不同的多样。即使是同一种诱变剂，也常有不同的作用方式。作用方式。(1)(1)碱基置换（碱基置换（substitution）v定义定义：对对DNA来说，碱基的置换属于一种染色来说，碱基的置换属于一种染色体的微小损伤（体的微小损伤（microlesion），一般也称点突），一般也称点突变（变（pointmutation）。它只涉及一对碱基被另）。它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换。一对碱基所置换。v分类分类：转换转换（transition），即），即DNA链中的一个嘌呤被链中的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换颠换颠换（transversion），即一个嘌呤被另一个嘧），即一个嘌呤被另一个嘧啶或是一个嘧啶被另一个嘌呤所置换。啶或是一个嘧啶被另一个嘌呤所置换。ATCG双链双链DNA单链单链DNA图图 碱基置换的两种类型碱基置换的两种类型转换（实转换（实 线，对角线）和颠换（虚线，纵横线）线，对角线）和颠换（虚线，纵横线）由碱基置换引起的由碱基置换引起的3种突变型种突变型转录转录转译转译对某一具体诱变剂来说，可同时引起转换与颠对某一具体诱变剂来说，可同时引起转换与颠换，也可只具其中的一种功能。根据化学诱换，也可只具其中的一种功能。根据化学诱变剂是直接还是间接地引起置换，可把置换变剂是直接还是间接地引起置换，可把置换的机制分成以下两类来讨论。的机制分成以下两类来讨论。直接引起置换的诱变剂直接引起置换的诱变剂间接引起置换的诱变剂间接引起置换的诱变剂直接引起置换的诱变剂直接引起置换的诱变剂v一类可直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变一类可直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂，例如剂，例如亚硝酸、羟胺和各种烷化剂亚硝酸、羟胺和各种烷化剂（硫酸二乙（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，酯，甲基磺酸乙酯，N-甲基甲基-N硝基硝基-N-亚硝基胍，亚硝基胍，N-甲基甲基-N-亚硝基脲，乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等）亚硝基脲，乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等）。它们可与一个或几个核苷酸发生化学反应，从它们可与一个或几个核苷酸发生化学反应，从而引起而引起DNA复制时碱基配对的复制时碱基配对的转换转换，并进一步，并进一步使微生物发生变异。在这些诱变剂中，除羟胺使微生物发生变异。在这些诱变剂中，除羟胺只引起只引起G CAT外，其余都是可使外，其余都是可使G C&AT发生互变的。能引起颠换的诱变剂很少，发生互变的。能引起颠换的诱变剂很少，只是部分烷化剂才有。只是部分烷化剂才有。碱基转换的分子机制碱基转换的分子机制v亚硝酸亚硝酸可使碱基发生可使碱基发生氧化脱氨氧化脱氨作用，故它能使腺嘌呤作用，故它能使腺嘌呤（A）变成次黄嘌呤变成次黄嘌呤（H），使胞嘧啶，使胞嘧啶（C）变成尿嘧变成尿嘧啶啶（U），从而发生转换。它也可使鸟嘌呤（，从而发生转换。它也可使鸟嘌呤（G）变成）变成黄嘌呤（黄嘌呤（X），但这时不能引起转换。其中），但这时不能引起转换。其中AH而引而引起的转换过程分以下几个环节：起的转换过程分以下几个环节：腺嘌呤经氧化脱氨后变成烯醇式次黄嘌呤（腺嘌呤经氧化脱氨后变成烯醇式次黄嘌呤（He）；）；He通过通过自发的互变异构效应自发的互变异构效应而形成而形成Hk（酮式次黄嘌（酮式次黄嘌呤）；呤）；DNA双链第一次复制，结果双链第一次复制，结果Hk因其在因其在6位上含有酮位上含有酮基，故只能与基，故只能与6位上含有氨基的胞嘧啶（位上含有氨基的胞嘧啶（C）配对；）配对；DNA双链的第二次复制，这时其中的双链的第二次复制，这时其中的C按常规与按常规与G配配对，因而最终实现了转换。对，因而最终实现了转换。碱基的置换碱基的置换直接引起置换的诱变剂直接引起置换的诱变剂HNO2CNH2腺嘌呤CO次黄嘌呤(Hk)A.THe.THk.THk.CA.THk.CG.CCOH次黄嘌呤(He)间接引起置换的诱变剂间接引起置换的诱变剂引起这类变异的诱变剂都是一些引起这类变异的诱变剂都是一些碱基类似物碱基类似物，如如5-溴尿嘧溴尿嘧啶（啶（5-BU）、）、5-氨基尿嘧啶（氨基尿嘧啶（5-AU）、）、8-氮鸟嘌呤（氮鸟嘌呤（8-NG）、）、2-氨基嘌呤（氨基嘌呤（2-AP）和）和6-氯嘌呤（氯嘌呤（6-CP）等。它们）等。它们的作用是通过细胞的代谢活动掺入到的作用是通过细胞的代谢活动掺入到DNA分子中后而引起分子中后而引起碱基置换，故是间接的。现以碱基置换，故是间接的。现以5-BU为例来加以说明。为例来加以说明。5-BU是是T的代谢类似物。当把某一微生物培养在含的代谢类似物。当把某一微生物培养在含5-BU的的培养液中时，细胞中有一部分新合成的培养液中时，细胞中有一部分新合成的DNA的的T就被就被5-BU所取代。所取代。5-BU一般以酮式状态存在于一般以酮式状态存在于DNA中中，因而仍可正，因而仍可正常地与常地与A配对，这时并未发生碱基对的转换。配对，这时并未发生碱基对的转换。有时有时5-BU会会以烯醇式状态出现在以烯醇式状态出现在DNA中，于是当中，于是当DNA进行复制时，在进行复制时，在其相对位置上出现的就是其相对位置上出现的就是G，而不是原来的而不是原来的A，因而引起了，因而引起了碱基对从原来的碱基对从原来的AT变至变至G C的转换。的转换。G.CA.BUG.BUA.BUG.CA.TA.TA.TA.TG.CA.BU酮式G.BU烯醇式烯醇式酮式5-BU在以酮式或烯醇式状态存在时引起的在以酮式或烯醇式状态存在时引起的ATG C的转换的转换v从上图中，还可看到从上图中，还可看到5-BU的掺入引起的的掺入引起的G C回复到回复到AT的过程。通过这两个图示，就很容易理解为什的过程。通过这两个图示，就很容易理解为什么同一种诱变剂既可造成正向突变，又可使它产生么同一种诱变剂既可造成正向突变，又可使它产生回复突变的原因了。另外，也可以看到，为什么像回复突变的原因了。另外，也可以看到，为什么像5-BU这类代谢类似物只有对正在进行新陈代谢和繁这类代谢类似物只有对正在进行新陈代谢和繁殖着的微生物才起作用，而对休止细胞、游离的噬殖着的微生物才起作用，而对休止细胞、游离的噬菌体粒子或离体的菌体粒子或离体的DNA分子却不起作用。分子却不起作用。(2)(2)移码突变移码突变移码突变移码突变（frame-shiftmutation）指诱变剂使）指诱变剂使DNA分子中的一个或少数几个核苷酸