用不同蛋白质分析方法鉴定玉米分泌蛋白组的比较研究.pdf

第30卷,第10期 光谱学与光谱分析Vol1 30,No1 10,pp2762-27662 0 1 0 年 1 0 月 Spectroscopy and Spectral AnalysisOctober,2010 用不同蛋白质分析方法鉴定玉米分泌蛋白组的比较研究马 玮1,Frank Hochholdinger2,李春俭1*1.中国农业大学资源与环境学院,农业部植物营养学重点开放实验室,北京 1001932.Center for Plant Molecular Biology,Department of General Genetics,Eberhard Karls University Tuebingen,72076 T uebingen,Germany摘 要 玉米根系在生长过程中向根际分泌蛋白质类大分子物质。采用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳-质谱技术,一维液相色谱-质谱联用(LC/MS)和 Shotgun 三种不同鉴定方法对无菌条件收集的玉米根系分泌蛋白进行了分离、分析与鉴定,对 3 种鉴定方法在分泌蛋白分析中的应用做了详细阐述和比较。结果表明,双向电泳通过银染可以看到 200 个蛋白质点,但由于蛋白量少,通过质谱无法对玉米根系分泌蛋白进行鉴定;用LC/M S 鉴定得到了 152 个蛋白;用 Shotgun 技术鉴定得到了 2 848 个蛋白。LC/MS 鉴定得到的蛋白全部出现在用 Shotgun 技术鉴定得到的 2 848 个蛋白中,后 2 种方法的结果可以互相验证。Shotgun 技术具有更高的灵敏性,更适合对蛋白质浓度低、干扰物多的植物根分泌蛋白组进行鉴定,能够获得完整可靠的信息。关键词 玉米根系分泌物;分泌蛋白组;双向电泳;LC-MS;Shotgun;MudPIT中图分类号:S123 文献标识码:A DOI:1013964/j 1 issn11000-0593(2010)10-2762-05 收稿日期:2009-12-12,修订日期:2010-03-16 基金项目:国家自然科学基金项目(30671237)和国家自然科学基金委员会创新群体项目(30821003)资助 作者简介:马 玮,女,1982 年生,中国农业大学资源与环境学院博士研究生 *通讯联系人 e-mail:lichj 引 言 根分泌物是植物在生长过程中通过根系向生长基质中释放的种类繁多的一组物质1,2。其中包括低分子量的可溶性有机物和高分子量有机分泌物,如多糖,多聚半乳糖醛酸以及蛋白质,酶类等。目前对于根系分泌物的研究主要集中在小分子物质方面,如不同养分胁迫下的专一性根分泌物有机酸、麦根酸;豆科植物向根际释放的类黄酮物质以诱导结瘤等。对根系分泌的蛋白质等大分子物质的研究很少。植物根系具有分泌蛋白质和特异性蛋白及酶类的能力 3-5。分泌蛋白是一类具有重要功能的蛋白,参与植物根系胞外信号途径、形态发生、细胞凋亡、细胞分化等多种生物过程 6。分泌蛋白组研究是蛋白质组学研究的重大挑战,这是由于分泌蛋白组不同于组织和细胞蛋白质组,其分泌量低,干扰物多,又受收集、浓缩等过程的限制7。目前国际上已发表的关于植物分泌蛋白组的文章只有两篇,并集中在拟南芥、豌豆和油菜 8,9等双子叶植物分泌蛋白组方面,对单子叶植物分泌蛋白组的研究还是空白。双向电泳与质谱联用是目前植物蛋白质组学研究中最常用的方法 10,但由于要求上样量大,所以不适合植物分泌的量少并且干扰物质多的蛋白样本的分析鉴定。LC-MS 是另一种高效分离蛋白质的方法,对于样品复杂程度不高的蛋白样本,可以采用这一方法来取代或者补充双向电泳与质谱联用的鉴定结果。Shotgun 鉴定方法是一种新的蛋白质组学研究技术 11。集成了 2 种或 2 种以上色谱分离机理的优化和组合 10。此项技术的核心是对所获取的全蛋白首先进行全酶切,然后对多肽混合物进行两维或多维毛细管液相色谱分离和在线串联质谱分析。在已报道的植物分泌蛋白组的研究中,采用 MudPIT 和LC-MS/MS 方法分别在拟南芥、豌豆和油菜根系分泌物中鉴定得到了 124,52 和 16 个分泌蛋白 8,9。本文对在无菌条件下收集得到的玉米根系分泌蛋白样品,分别采用双向电泳-质谱、LC-MS 和 Shotgun 三种方法鉴定玉米根系分泌蛋白。结果证明,采用 Shotgun 技术得到的蛋白信息最多,并且不受蛋白浓度低,干扰物质多及难以浓缩纯化的限制。1 材料与方法1 1 1 无菌玉米根分泌蛋白的收集实验材料为玉米杂交种农大 108。实验所用的试剂、溶液和器皿等用具全部高压灭菌(121 e,1 1 5 kPa)。种子经消毒在无菌条件下萌发 24 48 h,待玉米主根长至 2 cm 左右时,将幼苗移到有孔的塑料盘中,使根系能够穿过孔生长在盛有 500 mL 经灭菌的 1 mol#L-1的 CaCl2溶液中,溶液中加入微生物抑制剂 Micropur(Katadyn Products Inc 1,Wal-lisellen,Switzerland)以抑制微生物对分泌物分解。移苗 12 h后,用经灭菌的移液枪头收集主根根冠的粘液,在 12 h 内收集 3 次。上述操作均在无菌层流柜内(1 400 L 700 W 370H)进行。收集到的根系分泌物经 14 000 g 4 e 离心 30 min 除去根冠脱落细胞后,旋转蒸发浓缩。浓缩后的粘液用预冷的TCA/丙酮(内加蛋白酶抑制剂)过夜沉淀,沉淀用预冷的丙酮洗涤 3遍,沉淀蒸发干燥后,加入蛋白提取液(7 mol#L-1尿素,2 mol#L-1硫脲,2%CHAPS,50 mol#L-1DTT,痕量溴酚蓝)提取蛋白,在此期间,将样品超声波处理 3 min,涡旋,14 000 g 4 e 离心 30 min,将上清液置于-70 e 保存直至进行双向电泳操作。112 双向电泳-质谱鉴定这部分实验在德国蒂宾根大学的蛋白质组中心完成。第一向固相 pH 梯度等电聚焦,使用 IPG 干胶条(pH 4 7,17 cm,非线性,GE Healthcare,USA)及 Multiphor 电泳仪(GE Healthcare,USA)。样品含有 100Lg 蛋白质。聚焦完备的 IPG 胶条先在平衡液 I(75 mol#L-1T ris-HCl(pH818),6 mol#L-1M 尿素,29 1 3%(U%)甘油,2%(X%)SDS,痕量溴酚蓝,0 1 1 g DTT)中平衡 15 min,再在平衡液(DT T 换成 0 1 25 g 碘乙酰胺,其余组成同 I)中平衡 15min。转移到 12%SDS-PAGE 均匀胶上,待封胶液凝固后用DALT SIX(amersham biosciences)进行第二向电泳,起初每块胶 1 W,1 h,然后每块胶 15 W 直至溴酚蓝前沿到达玻璃板底部。染色采用银染方法12。凝胶用 ImageMaster 扫描,用 PDQuest(amersham biosciences)软件分析图谱。银染的蛋白斑点切下后置于 1 1 5 mL EP 管中,用去离子水清洗 3 次;加入新鲜制备的 100 LL 脱色工作液(30 mmol#L-1K3Fe(CN)6与 100 mmol#L-1Na2S2O3,其体积比为1B 1),放置并晃动直到蛋白点的棕色消失(约 2 3 min),去上清液;马上用高纯水冲洗 2 3 次,去上清液;加入 100LL 100 mmol#L-1NH4HCO3洗胶 2 次,弃所有液体;加入100 LL 无水乙腈(ACN)脱水 2 遍至胶缩小变白,去掉乙腈溶液,真空干燥到完全干燥为止(约 20 30 min)。每管加入10 LL T PCK2 胰蛋白酶(Sigma,proteomics grade)100 ng#LL-1,溶于 50 mmol#L-1NH4HCO3中,冰上放置 30 min,待酶液被完全吸收后,吸去多余酶液,加约 30 LL 酶解覆盖液(40 mmol#L-1NH4HCO3,9%ACN)覆盖。37 e 消化过夜,获得肽片段的混合物;经 15 000 r#min-1离心,移上清于干净 EP 管中。酶解后的肽片段先用 30 LL 萃取液(0 1 1%(U)T FA/50%(U)ACN)萃取 2 次,15 000 r#min-1离心后取上清液。将酶解后的上清液与 2 次萃取液合并后真空抽干,抽干后溶于 10 LL 0 1 1%T FA 溶液中。将带样品的移液嘴在其中反复洗脱,取 1LL 液样于质谱样品板上,空气中自然干燥,待溶剂挥发干后将样品板置于 MALDI-T OF-MS 中进行分析。干燥后的肽混合物基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)进行肽质量指纹谱(PMF)测定。生物质谱 仪为 AUT OFLEX TOF-T OF(Bruker Daltonics,Germany),质谱仪用 sequazyme peptide massstandard kit 进行外部校正,用基质峰和胰蛋白酶自切峰作为内部校正。选择质谱质量较高的点,再进行 TOF-TOF 二级质谱鉴定。根据肽片断的有效质量将肽指纹在 NCBInr 数据库中找到相匹配的蛋白,检索其相应的蛋白质信息。1 1 3 LC/MS 联用技术这部分实验在北京蛋白质组研究中心进行。色谱柱采用 Dionex C18 PePMap300,5 Lm,300A;ID75Lm,长 15 cm。流动 相 A 为:2%ACN+98%H2O+0 1 1%TFA;B为 80%ACN+20%H2O+0 1 1%T FA。洗脱流速为 012 LL#min-1。数据采集时间:130 min,喷雾电压(spray voltage):2 1 2 kV;毛细管温度(caplillary tempera-ture):200 e;碰撞能量(normalized collision energy):35%,采集质量范围:350 1 600 Da。数据过滤参数:对带+1 电荷的肽段 Xcor 值取大于 2 1 2,且$Cn 大于 0 1 08 的结果,对带+2 电荷的肽段 Xcor 值取大于 2 1 5,且$Cn 大于 0108 的结果,对带+3 电荷的肽段 Xcor 值取大于 3 1 5,且$Cn 大于0 1 08的结果。使用 SEQUEST 算法检索,软件:BioWorksRev 3 1 2,数据库:NCBI 下载的 Desulfovibrio desulfuricans全库。Swiss-PROT 数据库中搜索每个蛋白参与的生物途径以及生物学功能。运用生物信息学软件 SecretomeP 预测分泌蛋白,蛋白功能分类用M IPS funcats(http:/mips 1 gsf 1 de/proj/thal/db/tables/tables_gen_frame 1html 1)。1 1 4 Shotgun 方法这部分实验在德国蒂宾根大学蛋白质组中心完成。30Lg 蛋白用 12%SDS-PAGE 胶分离,考马斯亮蓝染色。胶条均匀分成 16 段,每段胶条分别进行酶解。用强阳离子交换柱 SCX 脱水(5 mm 320 Lm)为 100%乙腈,凝胶浸泡于 56 e,10 mol#L-1DTT,20 mol#L-1碳酸氢铵 45min以打断双硫键。避光条件下 55 mol#L-1碘乙酰胺,20mol#L-1碳酸氢铵 24 e30 min 进行半胱氨酸烷基化。50%10 mol#L-1碳酸氢铵/50%乙腈洗两遍,100%乙腈脱水,真空干燥。12 1 5 ng#LL-1胰蛋白酶,20 mol#L-1碳酸氢铵37 e 过夜酶解。酶解后的胶 30%乙腈/3%TFA,80%乙腈/0 1 5%乙酸,100%乙腈提取。离心后上清 RP-C18 StageTip柱脱盐 13,14。酶解后的肽段用在线 RP-nanoLC 系统(Axel Semrau,Sprockhvel,Germany),LT Q-Orbitrap-XL mass spectrome-ter(ThermoFisher,Bremen,Germany)。肽段混合物上柱,流速为 500 nL#min-1,200 nL#min-1从 1 1 6%64%乙腈(0 1 5%乙酸)线型洗脱。质谱 仪在 MassLynx 软 件 控 制 下 采 得 的 M S 以 及MSPMS 数据由 ProteinLynx 软件转换为含有一级母离子及二级碎片离子大小(mPz)和强度的 PKL 文件。将这些文件输入数据库(Swiss Prot),使用 Mascot 软件(Matrix ScienceLtd,UK)中的串级质谱数据搜索功能(MSPMS Ions Search)进行搜索。数据库的搜索选择下列参数:固定修饰选择 car-bamoylmethylation(Cys),可变修饰选择乙酰化(蛋白质 N 末端),氧化(Met),以及磷酸化(Ser,T hr,T yr)。酶选择胰蛋白酶,允许最大未酶切位点(missed cleavages)数为 2,肽段2763第 10 期 光谱学与光谱分析的质量容差(mw tolerance)为 112,碎片离子的质量容差为016,显示前 50 个结果。将肽段的得分(mowse scores)超过阈值(threshold)的视为鉴定的肽段,用来进行蛋白质的鉴定。对一些 MSPMS 图谱上有 3 个以上连续 y 系列或者 b 系列离子的 MSPMS 图谱,还用序列搜寻法(sequence query)对蛋白质进行进一步搜寻鉴定。2 结 果211 双向电泳-质谱鉴定结果在分子量 12-97 kD、等电点 4 7 范围内,通过银染法共计分离到约 200个蛋白质点 图 1(a)。经过软件分析,重复之间图谱重合,得到模板胶 图 1(b)。可以看到,玉米分泌蛋白中没有高丰度蛋白。选取染色较深的蛋白点,挖点测序。根据质谱分析获得每个样品的一组峰值,设定物种或物种门类,在较宽泛的分子量和等电点范围内,逐渐升高质量误差,设定的质量误差较低,检索结果的可信度就较高。但本次检索中如果将质量误差设定为 100 10-6,几乎都没有匹配的条目。表明用双向电泳-质谱分析方法无法对玉米根系分泌蛋白进行鉴定。Fig 1 1 Proteomic 2-D maps of maize primary roots 1 Proteinswere separated in the first dimension according to theirpIs on IPG strips pH 4 7 and in the second dimensionaccording to their Mr values on 12%SDS polyacrylam-ide gels 1 Proteins were stained with silver(a)1Thespots were labeled with blue circle,the image was ana-lysed with PDQuest software(b)212 LC/MS 联用技术鉴定结果使用 LC/MS 联用技术共测得 152 个蛋白,分属 47 种蛋白。其中大部分蛋白参与代谢,防御功能以及信号传导等途径。参与防御的蛋白有过氧化物酶,病源相关蛋白;参与代谢的蛋白有葡萄糖-1-磷酸腺苷转移酶,HMGc2,脂加氧酶;参与能量过程的蛋白有脂结合蛋白,ATP 合酶,腺苷酸激酶,阿拉伯半乳糖蛋白;参与信号传导的蛋白有 M APK,聚合蛋白,非特异性脂转移蛋白,磷脂转移蛋白;还有部分蛋白参与转录过程(图 2)。经分泌蛋白分析软件预测,80%以上蛋白具有信号肽(secretome P secore 0 1 5)。213 Shotgun 方法鉴定结果玉米根系分泌蛋白经 Shotgun 方法鉴定后,在玉米数据库中检索到 2848 个蛋白信息。这 2 848 个蛋白按功能分类分属于 12 种蛋白种类,分别属于参与代谢、具有结合功能、抗病防御功能、蛋白合成、信号传导、蛋白去向、能量、运输、转录、细胞循环、细胞组成的生物成因以及未知功能的蛋白类,构成了完整的玉米分泌蛋白图谱。在另一篇文章中,我们对这些蛋白的分泌特性、功能和分类做了详细的介绍,并与文献中已报道的豌豆、拟南芥和油菜 8,9的根系分泌蛋白的同源性进行了比较 15。Fig 12 Summary of functional classes that were attributed tothe 47 maize mucilage proteins identified by LC-MS inpercent3 讨 论 使用双向电泳-质谱技术,尽管在不影响电泳结果的前提下将上样量加到了最大,但由于蛋白丰度低,干扰物质多-尽管通过银染可以看到很多蛋白,但所得到的蛋白点不能达到质谱鉴定的丰度要求,所以没有得到可靠的鉴定结果。运用LC/MS 联用技术,不需对样本进行凝胶预分离,直接用一维色谱进行样本的分离并鉴定,得到了 152 个蛋白,分属于 47 种蛋白。运用 Shotgun 技术共鉴定得到了 2848 个蛋白,获得了较为完整的玉米根系分泌蛋白图谱。运用 LC/MS 联用技术鉴定得到的 152 个蛋白均涵盖在用 Shotgun 方法鉴定得到的 2848 个蛋白中,使 2 种鉴定方法得到的结果相互验证,一方面证明了 2 种方法的准确性,同时显示了Shotgun鉴定技术的优势。Lee 等(2007)采用 Shotgun 方法在拟南芥叶片中鉴定得到了 2 342 种非冗余蛋白质,同样用双向电泳-质谱技术只得到了几百种蛋白信息。常规的双向电泳-质谱技术除了其固有的局限性,如重复性差、偏向性严重、不易自动化等因素外 10,对于植物根系分泌蛋白的鉴定就更加困难。植物根系分泌蛋白的双向电泳结果不能达到考马斯亮兰染色所需的蛋白丰度,需要用银染法以获得更高的分辨率。但从蛋白鉴定的角度看,并非每个银染蛋白点的蛋白丰度都足以用于蛋白鉴定。相比较而言,多维高效液相色谱由于具有通量高、重复性好、易与质谱实现自动化等优点16-18,更适合低丰度蛋白的鉴定。Shotgun 方法适用于蛋白质组学中大规模蛋白质和复杂蛋白质混合物的分离鉴定18。Koller 在 PNAS 上发表研究,比较了传统的双向电泳分离-质谱鉴定方法与 Shotgun方法鉴定水稻根组织蛋白,前者只识别了 556 个蛋白,而后者则识别了 2 363 个蛋白19。可见,能否有效并可靠地鉴定出蛋白质,与所采用的分析方法有很大关系,改进蛋白分析鉴定策略有助于提高蛋白质的鉴定效率。基于多维液相色谱2764光谱学与光谱分析 第 30 卷一串联质谱联用的 Shotgun 技术迅速发展,并广泛应用于蛋白质表达谱、修饰谱及蛋白复合物等规模化的蛋白质鉴定研究中,在顶尖杂志上已发表多篇运用此方法的报道 20-25。本文采用 SDS-PAGE 预分离,将 SDS-PAGE 胶上不同等电点的蛋白质用多维色谱再次进行分离,这种有效的组合能够扬长避短,发挥了色谱方法和凝胶电泳这两类高效分离方法的优势。作为应用广泛的、经典的双向凝胶电泳方法的重要补充,多维液相色谱一质谱联用技术因其克服了双向凝胶电泳的歧视效应、实现了分析的仪器化、自动化,能够直接获得肽段序列信息,因此得到的鉴定结果更为可靠。Shot-gun 技术对样品的蛋白丰度要求较低,具有适合大规模和高通量分析的优势,适用于全蛋白质组作图,为制作全蛋白图谱提供了有力的工具和可靠的技术平台,在蛋白质组学研究中正在或即将发挥重要作用。每一项技术都存在优缺点,Shotgun技术的缺点是数据库检索比较费时,对色谱的操作有非常精细和经验的要求,不适合做差异蛋白组。对于差异蛋白质组的研究主要手段还是双向电泳-质谱,简单的样本也可以用 LC/MS 联用技术。参考文献 1 ZHANG Fu-suo,CAO Y-i ping(张福锁,曹一平).Acta Pedol.Sin.(土壤学报),1992,29(3):239.2 ZHANG Fu-suo(张福锁).J.China Agricultural University(北京农业大学学报),1992,18(4):353.3 Marschner H.Mineral Nutrition of Higher Plants.2nd.London:Academic Press,1995.4 SHEN Jian-bo,ZHANG Fu-suo(申建波,张福锁).Journal of China Agric.Sci.T ech.,(中国农业科技导报),1999,1(4):21.5 Bais H P,Park S W,Weir T L,et al.Trends Plant Sci.,2004,9(1):26.6 ZHANG Nan-nan,LIU Xin,SU N Jing,et al(张楠楠,刘 欣,孙 晶,等).Hereditas(遗传),2009,31(1):29.7 Chevallet M,Diemer H,Van Dorssealer A,et al.Proteomics,2007,7(11):1757.8 Basu U,Francis J L,Whittal R M,et al.Plant Soil,2006,286(1):357.9 Wen F S,Van 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results showed that 200 protein spots could be observed on two-dimensional electrophoresis gel stainedby silver nitrate.However,due to the low protein content for each protein spot,there was not reliable result after identificationby MADLI-TOF.On the other hand,152 and 2 848 proteins were identified by LC/MS and Shotgun technique,respectively.All152 proteins identified by LC/MS method could be found in the proteins identified by Shotgun method,and thus the results ob-tained by LC/MS and Shotgun method could be authenticated mutually.The results demonstrated that the Shotgun method ismore sensitive than the other methods for protein identification,especially for the proteins with lower contents and complex in-terfering substances,such as the plant root released proteins.Keywords Maize root exudation;Secreted proteome;Two-dimensional electrophoresis;LC/M S;Shotgun;M udPIT(Received Oct.12,2009;accepted Mar.16,2010)*Corresponding author2766光谱学与光谱分析 第 30 卷