葡萄球菌属基因检测与药敏结果分析_陈开森.pdf

#论 著#葡萄球菌属 mecA 基因检测与药敏结果分析陈开森,廖晚珍,彭卫华,胡雪飞,孙爱娣,余 阳,蔡 庆(南昌大学第一附属医院检验科,江西 南昌 330006)摘要:目的 探讨医院 2006 年分离的葡萄球菌属 mecA 基因检测及耐药情况,为医院耐药性监测和临床用药提供指导。方法 采用 Microscan-Autoscan-4 微生物分析仪及 PC12 复合板鉴定葡萄球菌属并测定对药物的敏感性;E-test 检测各菌株对苯唑西林的最低抑菌浓度(MIC)值;PCR 检测 mecA 基因。结果 共分离出 472 株葡萄球菌属,金黄色葡萄球菌 196 株,其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)133 株、甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(M SSA)63 株;凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)276株,其中耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)233 株、甲氧西林敏感凝固酶阴性葡萄球菌(MSCNS)43 株;PCR 检测出 MRSA 和 MRCNS 都具有 mecA 基因,耐药性高的菌株有阿莫西林(91.3%)、氨苄西林(95.6%)、青霉素(99.2%)和头孢唑林(93.5%),耐药性低的菌株有利福平(22.9%)、庆大霉素(21.7%);未发现耐万古霉素菌株。结论 医院葡萄球菌属耐药性较为严重;PCR 检测 mecA基因和苯唑西林 M IC 值具有良好相关性。关键词:葡萄球菌属;苯唑西林;mecA 基因;药敏试验中图分类号:R378.1+1 文献标识码:A 文章编号:1005-4529(2009)01-0021-03Detection of mecA Gene and Analysis of Drug-sensitivity in StaphylococciCHEN Ka-i sen,LIAO Wan-zhen,PENG We-i hua,HU Xue-fei,SUN A-i di,YU Yang,CAI Qing(T heFirst Af f iliated Hosp ital,Nanchang University,Nanchang,Jiangxi 330006,China)Abstract:OBJECTIVE T o discuss the situation of mecA gene and drug-resistance in staphylocci in our hospital in2006,which might be offer guidance for drug-resistant supervision and clinical treatment.METHODS T he strainswere identified using Microscan-Autoscan-4 and PC21 multiplex-board.T he oxacillin MIC of staphylococci weredetected by E-test and using PCR to detect mecA gene.RESULTS Among total of 472 strains,196 strains wereStaphylococcus aureus(M RSA 133 strains,M SSA 63 strains)and 276 CNS strains(MRCNS 233 strains,MSCNS 43 strains);M RSA and MRCNS had mecA gene by PCR detection;these strains which had high drug-resistance to amoxicillin(91.3%),ampicillin(95.6%),penicillin(99.2%)and cefazolin(93.5%),low drug-resistance to rifampicin(22.9%),gentamicin(21.7%)and vancomycin(0%).CONCLUSIONS Drug-resistanceof staphylococci is severe in our hospital.There is a good relation between mecA gene and oxacillin MIC.Key words:Staphyloccocci;Oxacillin;mecA;Drug sensitivity test收稿日期:2008-05-19;修回日期:2008-08-15 葡萄球菌属是临床上最为常见的革兰阳性球菌,其引起的致病性和耐药性一直是治疗和预防中难题之一。笔者对我院 2006 年临床分离的葡萄球菌属 mecA 基因与苯唑西林的最低抑菌浓度(MIC)值相关性及耐药性进行统计分析,现报道如下。1 材料与方法1.1 菌株来源 2006 年 1-12 月从我院住院患者的临床各类标本中分离的 472 株葡萄球菌属,其中金黄色葡萄球菌 196 株,其他葡萄球菌 276 株。来源科室有呼吸内科、儿科、肾内科、内分泌科、ICU、血液科、泌尿外科、普外科等。其中来自痰 272 株、尿 85 株、胆汁 11 株、伤口拭子 28 株、血液 51株、分泌物 17 株、胸水 5 株、腹水 3 株。1.2 质控菌株 金黄色葡萄球菌 ATCC25923 和AT CC29213,购于中国药品生物制品检定所。1.3 常规试验方法 分离培养按5全国临床检验操作规程6(第 2版)进行。鉴定及药敏试验采用美国DADE 公司生产的 Microscan-Autoscan-4 及配套试剂 PC12 卡完成。1.4 血浆凝固酶试验 参照5临床微生物学和微生物检验实验指导6 1(第 2 版)有关内容进行操作。1.5 E-test 法检测对苯唑西林的 MIC 值 E-test试纸条为 AB Biodisk 公司(瑞典)产品。MIC:#21#中华医院感染学杂志 2009 年第 19 卷第 1 期0.016 256 Lg/ml。试验方法参照说明书进行。MIC 2 Lg/ml 表 示 未产 生 mecA 基 因,MIC4 Lg/ml表示产生 mecA 基因。质控菌株为金黄色葡萄球菌 ATCC29213。1.6 mecA-PCR 检测 TaqDNA 聚合酶、dNTPs、5 T BE 液为上海生工生物工程有限公司产品,mecA 基因扩增引物 1:5-AAAATCGAT GGT AAAG-GTTGGC-3,引物 2:5-AGTTCTGCAGTACCGGATTTG-3,由上海生工生物工程有限公司合成,低溶点琼脂糖为加拿大 BBI 公司产品,DNA 梯度扩增仪(TP600型)为 TaKaRa 公司产品,直径为 90 mm 的一次性无菌培养皿购自江苏扬州医疗器械有限公司。1.7 mecA-PCR 方法 挑取血平板上 2 3 个菌落(24 h)于 2 3 ml 生理盐水中制成菌悬液,使其浓度约为2.5 106CFU/ml。PCB 反应体系共501 d:10 缓冲液 5 Ll,15 mmol/L MgCl 2.5 Ll,菌液5 Ll,dNT Pl.5 Ll,引物各 1 Ll,Taq 酶 0.5 U,H2030.5 Ll。循环参数为:94 e 预变性 5 min;94 e1 min、50 e 1 min、72 e 1.5 min,循环 35 次,最后72 e 延伸 8 min。反应结束后取产物 10 Ll,以 2%琼脂糖进行电泳,120 V 电压下电泳 30 min 后,以凝胶成像系统成像分析。2 结 果2.1 一般资料 472 株临床株中,男性 216 株,女性 256 株,男女比例 1 B1.23;其中年龄最小的只有3岁,最大 92 岁,平均(46.1?24.3)岁;10 岁有66 株、20 30 岁有 27 株、31 40 岁有 31 株、4150 岁有 49 株、60 70 岁有 106 株、70 岁有 193株。从入院到标本采集时间看,72 h 分离出 107 株。2.2 葡萄球菌属对苯唑西林 MIC 值情况 凝固酶阳性葡萄球菌(CPS)对苯唑西林的耐药性主要集中在 MIC=0.5 Lg/ml 及 MIC 128 Lg/ml,分别为38、129 株;而凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)对苯唑西林耐药性主要集中在 MIC 2 Lg/ml 和 256 Lg/ml,分别为 33、133 株,但分布规律无 CPS 明显,表现为具有一定的浓度梯度。MRSA 对苯唑西林耐药率(MIC 4 Lg/ml)为 67.8%,MRCNS 对苯唑西林耐药率(MIC 4 Lg/ml)为 84.4%。经统计学处理,两者差异有统计学意义(V2=11.2,P 90.0%的药物有阿莫西林、氨苄西林、青霉素、头孢唑林,临床上对葡萄球菌属感染原则上不使用这些抗菌药物;耐药率介于 80.0%90.0%的药物有复方新诺明、头孢唑肟、氧氟沙星,对这些抗菌药物应该根据药敏结果有选择性地使用;耐药率较低的是利福平(22.9%)和庆大霉素(21.7%),与潘复亮 2报 道 不 同,耐 药 率 较 低的 药 物 为 利福 平(24.5%)、呋喃妥因(8.7%)、万古霉素(0)。这可能是地区用药习惯不同有关。本研究未发现耐万古霉素的菌株,万古霉素仍是目前国内治疗 MRS 全身感染的首选药物 3;但发现敏感性有降低的趋势,与余方友等 4报道相似。金黄色葡萄球菌对万古霉素的敏感性下降机制尚不清楚,可能与细胞壁增厚、细胞壁成分改变,导致万古霉素与细胞壁亲和力下降,从而阻断万古霉素的作用。但目前,临床上过多依赖万古霉素的抗菌作用,必然造成药物选择性压力增大,可能会加快耐药菌株的出现。另一方面,肠球菌属可编码VanA基因,该基因不但可以耐万古霉#22#Chin J Nosocomiol Vol.19 No.1 2009表 2 472 株葡萄球菌属对抗菌药物的药敏率(%)抗菌药物CPSRSCNSRSV2值MRSARSMRCNSRSV2值复方新诺明82.117.989.310.73.5480.719.385.214.82.68阿莫西林82.018.095.64.46.10#100.00.0100.00.0,苯唑西林71.628.497.32.714.90*100.00.0100.00.0,四环素64.435.635.364.311.60*68.231.872.817.21.68氨苄西林96.13.999.40.60.61,青霉素98.61.499.10.90.42,利福平31.568.514.086.010.80*37.262.813.186.912.60*万古霉素0.0100.00.0100.0,0.0100.00.0100.0,红霉素82.617.470.829.25.80#88.111.9100.00.06.20#头孢唑肟83.416.691.58.52.40100.00.0100.00.0,头孢唑林90.99.195.14.91.90100.00.0100.00.0,克林霉素78.721.353.946.112.40*78.221.872.028.01.67庆大霉素24.975.113.186.92.9023.176.926.273.80.40氧氟沙星82.917.178.621.42.0698.21.878.121.96.10#环丙沙星84.715.361.638.411.60*99.01.077.222.88.20*亚胺培南69.530.583.216.810.40*72.327.70.0100.019.60*注:1.药敏结果中介归于耐药;2.#表示 P 0.05,*表示 P 128 Lg/ml,而 MRCNS 分 布 在 4 Lg/ml的各个区域(表 1)。葡萄球菌属对苯唑西林低水平耐药,是由于细菌产生过量的 B-内酰胺酶或青霉素结合蛋(PBP)过量表达,或 PBP 与苯唑西林亲和力下降所致。葡萄球菌属对苯唑西林高水平耐药,原因之一是产生一种新的 PBP,即 PBP2a,PBP2a 与 B-内酰胺类抗菌药物亲和力极低,很少或不被 B-内酰胺类抗菌药物结合。当其他 PBP 与 B-内酰胺酶结合而活性受到抑制时,PBP2a 就可替代它们起到合成细胞壁的作用,从而产生耐药性。MRSA比 MRCNS 对苯唑西林耐药性更为集中,有文献认 为,这 可能 是 MRSA 的 PBP 结 合 力与MRCNS不同 5。mecA 基因是耐甲氧西林葡萄球菌的主要耐药因子,该基因高度保守,约含 2456 bp。CNS 与金黄色葡萄球菌的 mecA 基因 DNA 序列同源率为 99.0%,故可以通过 PCR 法检测 mecA 来了解是否是 MRS 6。PBP2a 被 mecA 基因特异编码,故检测 mecA 和其表达的青霉素结合蛋 2a(PBP2a)是预报对苯唑西林耐药的准确方法,它也被用于证实从严重感染患者分离的葡萄球菌属纸片扩散法药敏试验结果。携带 mecA 基因或产 PBP2a(mecA基因表达产物)的葡萄球菌属分离株,应报告对苯唑西林耐药;不携带 mecA 基因或不产 PBP2a 菌株应报告对苯唑西林敏感。但变异性 MRSA 中,可出现mecA 基因和 PBP 2a 检测为阴性,纸片扩散法确定为苯唑西林耐药,这时应加测苯唑西林 MIC,若MIC4 Lg/ml,应报苯唑西林耐药,可能与罕见非 mecA基因介导的苯唑西林耐药机制有关 7。参考文献:1 洪秀华.临床微生物学和微生物检验实验指导 M .第 2 版.北京:人民卫生出版社,2004.17-24.2 潘复亮.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌阳性率及耐药性 J.中华医院感染学杂志,2006,16(3):273.3 刘靳波,林燕英,陈红英,等.37 例新生儿耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌败血症研究 J.中国感染控制杂志,2004,3(1):43-44.4 余方友,李美兰,林晓酶,等.万古霉素对金黄色葡萄球菌体外抗菌活性研究 J.中国微生态学杂志,2006,18(3):240-242.5 Wei Q,Ender M,OcBrien F,et al.Molecular epidemiology ofmethicillin-resistant Stap hy lococcus aureus in Zurich,Switzer-land J.J Clin Microbiol,2005,43(11):5164-5170.6 朱以军.耐甲氧西林金黄葡萄球菌的耐药机制及检测 J.国外医学临床生物化学与检验学分册,2005,26(1):26-31.7 Skov R,Smyth R,Larsen AD,et al.Phenotypic detection ofmethicillin resistance in Stap hy lococcus aureus by disk diffu-sion testing and Etest on Mueller-Hinton agar J.J Clin M-icrobiol,2006,44(12):4395-4399.#23#中华医院感染学杂志 2009 年第 19 卷第 1 期