核酸提取方ǖ慕[兼容模式].pdf

Sample&Assay Technologies-1-核酸提取方法的进展核酸提取方法的进展从经典方法到硅膜吸附法、硅胶磁珠分离法从经典方法到硅膜吸附法、硅胶磁珠分离法从手工提取到自动化提取从手工提取到自动化提取凯杰生物凯杰生物陈永亮陈永亮Sample&Assay Technologies-2-核酸提取方法的分类：核酸提取方法的分类：按照提取原理分：按照提取原理分：经典方法有煮沸裂解法、酚经典方法有煮沸裂解法、酚-氯仿提取法，新方法氯仿提取法，新方法有硅膜吸附法、磁珠分离法等有硅膜吸附法、磁珠分离法等 按照提取方式分：按照提取方式分：手工提取和自动化提取手工提取和自动化提取Sample&Assay Technologies-3-1953DNA structure determined&publishedDNA结构被发现Purification of DNA with ultracentrifuge超高速离心法提取DNAPhenol ChloroformExtractions酚-氯仿提取法1993QIAGEN introduces the spin column凯杰引入硅胶膜柱技术核酸纯化方法的发展Sample&Assay Technologies-4-经典手工提取方法：经典手工提取方法：煮沸裂解法：一般用于DNA的手工提取，分为一步法和两步法，一步法得到的DNA含有较多小分子抑制物。两步法是第一步在样本中加入沉淀剂后离心弃上清，以去除小分子抑制物并沉淀病毒颗粒；第二步加入裂解液后煮沸，以释放DNA及沉淀残留蛋白等大分子抑制物，离心取上清即为得到的DNA。酚-氯仿提取法：一般用于RNA的手工提取，先在样本中加入裂解液，再加入氯仿后离心，以释放RNA并使之与蛋白层分离，再将上清液加入到异丙醇中以萃取RNA，离心后弃上清，加入乙醇洗涤后即为得到的RNA。Sample&Assay Technologies-5-硅胶膜法硅胶磁珠法QIAGEN Solutions（凯杰的解决方案（凯杰的解决方案）核酸提取的新方法核酸提取的新方法Sample&Assay Technologies-6-离液盐的作用离液盐的作用溶解多聚糖胶溶解多聚糖胶改变水的结构，帮助核酸结合到硅胶膜上改变水的结构，帮助核酸结合到硅胶膜上变性蛋白和核酸变性蛋白和核酸Sample&Assay Technologies-7-Carrier RNA的作用的作用确保对低滴度病毒RNA的回收效率保护病毒RNA，降低其被RNase的概率减少管壁对病毒RNA的吸附Sample&Assay Technologies-8-二氧化硅分离核酸二氧化硅分离核酸DNA水分子水分子Sample&Assay Technologies-9-Chaotropic Salt二氧化硅分离核酸二氧化硅分离核酸Sample&Assay Technologies-10-Silica二氧化硅分离核酸二氧化硅分离核酸Sample&Assay Technologies-11-二氧化硅对核酸的吸附和洗脱二氧化硅对核酸的吸附和洗脱核酸(水相)核酸(水相)核酸核酸(吸附于硅胶膜)(吸附于硅胶膜)吸附吸附离液盐乙醇低PH洗脱洗脱无离液盐低盐高PHSample&Assay Technologies-12-硅胶膜法：可用于手工提取，也可用于自动化提取硅胶膜法：可用于手工提取，也可用于自动化提取结合洗涤纯化的核酸备用纯化的核酸备用洗脱裂解样品Lysis（裂解）（裂解）n破坏蛋白质外壳，释放核酸Bind（结合）（结合）n核酸被二氧化硅捕获Wash（洗涤）（洗涤）n通过用不同的缓冲液洗涤，去除蛋白质等不需要的杂质Elute（洗脱）（洗脱）n将结合在二氧化硅上的核酸洗脱Sample&Assay Technologies-13-磁珠分离法：一般用于自动化提取磁珠分离法：一般用于自动化提取 裂解裂解 Lysis（释放核酸）结合结合 Bind（核酸特异性的吸附到磁珠外包被的硅胶模上）洗涤洗涤 Wash（磁珠被移液枪头外的磁铁固定，洗涤去除杂质）洗脱洗脱 Elute（通过改变PH值、离液盐等条件将核酸从磁珠外包被的硅胶模上洗脱下来）Sample&Assay Technologies-14-裂解结合洗涤洗脱Sample&Assay Technologies-15-硅胶吸附技术的优点硅胶吸附技术的优点n 彻底去除抑制物：无乙醇、有机物等彻底去除抑制物：无乙醇、有机物等n 灵活使用：离心、真空抽滤均可灵活使用：离心、真空抽滤均可n 简单稳定：裂解、结合、洗涤、洗脱四步，对操作要求简单稳定：裂解、结合、洗涤、洗脱四步，对操作要求低，低，重复性重复性好好n 易于实现自动化易于实现自动化n 高效：95%以上的核酸得率高效：95%以上的核酸得率Sample&Assay Technologies-16-HCV-HCV-核酸提取核酸提取v 硅胶膜柱核酸极大地降低了实验操作的技巧要求结果重复性更好纯化产物纯度更高，稳定性更好 纯化产物的量（60ul）可用于多次PCR 扩增检测，无需重新提取核酸。Sample&Assay Technologies-17-手工离心真空抽滤（QIAvac 系统）全自动核酸纯化（QIAcube）一种一种核酸核酸纯纯化化试剂试剂，三种三种操作方操作方式式Sample&Assay Technologies-18-QIAvac 系统组成系统组成+QIAvac 24 PlusVacuum PumpQIAvac Connecting SystemSample&Assay Technologies-19-QIAvac 系统工系统工作作示意图示意图VacConnectorVacValveColumnq 操作简便，与手工离心方式相比，节省了大量繁琐的手工操作q 省时，减少离心时的等待时间q 真空抽滤与手工操作在实验结果上有很好的一致性Sample&Assay Technologies-20-硅胶膜（离心法）自动核酸提取仪硅胶膜（离心法）自动核酸提取仪QIACUBE:一次可提取一次可提取112个样本，使用的试剂个样本，使用的试剂与手工提取的试剂通与手工提取的试剂通用用全球第一台全球第一台离心离心式式的的全自动纯全自动纯化化设备设备Sample&Assay Technologies-21-硅胶膜（负压法）自动核酸提取仪硅胶膜（负压法）自动核酸提取仪精巧精巧(smart)简洁简洁(compact)经济经济(affordable)QIAxtractor一次可提取一次可提取96个样本，高性价比个样本，高性价比Sample&Assay Technologies-22-硅胶膜（负压）自动核酸提取仪硅胶膜（负压）自动核酸提取仪MDX：高端自动纯化系统高端自动纯化系统，一次可提取一次可提取96个样本个样本Sample&Assay Technologies-23-主要特色主要特色 全过程自动化；使用创新的预装试剂盒，最少化设置时间；每每次可次可处处理理1-96个样本个样本，满足不同通量的要求；全自动纯化DNA，RNA，病毒核酸和蛋白；可可处处理高理高达达1ml大体积大体积样本，样本，实现更实现更高的高的灵敏度灵敏度和和产量；产量；灵活的系统，可在操作过程中装载样本；条形码扫描，实现样本和试剂的全程追踪与记录；单单次次运行中运行中可使用可使用2种不同种不同的试剂的试剂盒盒和和程序；程序；功能扩功能扩展的展的无限无限可可能能.应用范围应用范围 基因表达分析 基因分型 蛋白组学 常规分子生物学 测序项目硅胶磁珠分离式自动核酸提取仪硅胶磁珠分离式自动核酸提取仪QIAsymphony