刺参微卫星标记与生长性状体重_体长的相关分析.pdf

第 35 卷第 4 期2011 年 4 月水产学报JOURNAL OF FISHERIES OF CHINAVol 35，No 4Apr，2011文章编号:1000 0615(2011)04 0501 08DOI:10 3724/SP J 1231 2011 17204收稿日期:2010 11 05修回日期:2011 01 17资助项目:山东省良种工程项目(20082011);山东省优秀中青年科学家奖励基金(博士基金)项目(2008BS06004);山东省科技攻关项目(2008GG10005023)通讯作者:杨建敏，E-mail:ladderup126 com刺参微卫星标记与生长性状体重、体长的相关分析孙国华1，杨建敏1*，孙孝德1，3，宋志乐2，王卫军1，刘小静1(1 山东省海洋水产研究所，山东 烟台264006;2 山东烟台市芝罘区渔业技术推广站，山东 烟台264001;3 上海海洋大学水产与生命学院，上海201306)摘要:运用单标记分析法分析了 10 个微卫星位点与控制体重、体长数量性状的 QTL 的连锁关系。10 对微卫星引物在 8 月龄具有生长性状差异的 60 个刺参个体基因组 DNA 中扩增得到50 个等位基因，每个微卫星位点等位基因数 3 7 个，平均有效等位基因个数 5 0。10 个微卫星位点的多态信息含量为 0 268 0 0 825 6 不等，观测杂合度为 0 083 3 0 666 7。采用SPSS 软件对刺参的体重、体长生长性状和微卫星位点相关性进行分析，结果显示，微卫星位点AjSSR02 基因型 AB、AD、CD 与体重和体长相关，AjSSR04 标记中等位基因 A 对生长性状有正面影响，位点 AjSSR06 基因型 FF 个体仅平均体重与其他基因型个体显著差异，AjSSR09 标记的 A 和 B 等位基因分别对生长性状具有正面和负面不同影响。关键词:刺参;微卫星;遗传多样性;生长性状;相关分析中图分类号:Q 958 1;S 968 9文献标识码:A海参产业作为我国渔业中一个新兴产业，已成为我国水产养殖业内产值、利润最高的产业之一，目前年产值已超 200 亿元。作为海参主要养殖品种的刺参(Apostichopus japonicus)，在分类上隶属棘皮动物门(Holothuroidea)、海参纲(Echinodermata)、楯手目(Aspidochirotida)，其养殖规模近几年发展迅速，但目前刺参养殖所用的亲参由于没有进行系统的品种选育和改良，刺参苗种质量参差不齐，生长性状差异显著，刺参种质问题成为阻碍刺参养殖业健康持续发展的首要因素。研究表明控制经济性状的数量性状基因座(quantitative trait locus，QTL)存在主效基因1，一或两个主效基因可反映一个数量性状表型变异的10%50%以上。利用分子遗传标记进行标记辅助选择(marker assisted selection，MAS)，找到与这些数量性状位点相连锁的分子遗传标记，实现缩短世代间隔、早期选种及提高选种准确性，并加快新品种的培育，是当今动物遗传育种研究的热点之一。微卫星又称简单序列重复(simple sequencerepeats，SSR)，广泛而随机分布于真核生物的基因组中2 3。作为第二代分子标记手段，微卫星标记具有等位基因突变快、多态性高、杂合度大、信息含量丰富、呈共显性等显著优点4 5，在水产动物的种质鉴定、遗传进化、连锁图谱构建、QTL 定位等方面得到广泛应用6 9。作为分析与重要经济性状的遗传连锁关系最理想的标记，国内已有鲤(Cyprinuscarpio)、大 菱 鲆(Scophthalmusmaximus)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)等与生长性状相关微卫星标记的研究10 12。本实验以 10 个微卫星座位的多态性为基础，分析其与刺参体重、体长的相关性，采用单标记分析法筛选与刺参生长性状相关分子标记，为刺参体重和体长的间接选择提供参考数据，同时也为刺参经济性状的 QTL 定位和进一步分子标记辅助育种奠定基础。水产学报35 卷1材料与方法1 1材料实验所用的刺参群体来自蓬莱刺参养殖场。同批次亲本刺参亲本繁育后代，随机选取同一养殖池中 8 月龄刺参 60 头，个体编号，测量体长体重生长数据，剖取纵肌，液氮保存。1 2实验方法生长表型性状度量由于不同条件下刺参体形变化差异巨大，为保证测量数据的有效性和一致性，所有受试个体每 10 头暂养于 80 cm 45 cm 60 cm 玻璃缸中，在无刺激自然伸展状态下测量刺参头至尾全长为体长;刺参捞出海水 10min(期间排出腹腔大量海水)后，以吸水滤纸除去表面水分，测量刺参体重。基因组 DNA 的提取刺参纵肌100 mg，液氮研磨，加入 700 mL CTAB 提取缓冲液(100mmol/L Tris-HCl pH 8 0，20 mmol/L EDTA-Na2，1 4 mol/L NaCl，2%CTAB，0 1%巯基乙醇)和终浓度为 100 g/mL 蛋白酶 K，55 消化 3 h或 37 过夜，等体积酚氯仿(酚 氯仿=1 1)、氯仿抽提，二倍体积乙醇沉淀，TE 溶解，紫外分光光度计定量，20 保存备用。微卫星引物的设计及筛选实验所用微卫星引 物 序 列 来 自 刺 参 基 因 组 磁 珠 法 富 集 及GeneBank 刺参 EST 序列筛选所得微卫星位点设计13，引物在上海生工生物技术公司合成，筛选出 10 对多态性较高的引物用于后续研究(表 1)。微卫星 DNA 的扩增以 60 头刺参个体基因组 DNA 为模板，每个 PCR 反应体系总体积为25 L，其中含约 100 ng 的基因组 DNA，10 pmol的引物，2 5 mol MgCl2，0 2 mol dNTP，TaqDNA 聚合酶 1 U。PCR 反应条件为:94 预变性4 min，94 变性 40 s，按每对引物的退火温度反应 40 s，72 延伸 40 s，30 个循环;之后 72 10min，4 保温。PCR 产物1%琼脂糖凝胶电泳，对明确有扩增产物的引物对通过 8%(W/V)聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色检测其多态性。表 1刺参所选微卫星引物的名称、序列及 PCR 反应条件Tab 1Microsatellite loci，primer sequence and conditions of PCR in A japonicus位点locusGeneBank 索引号GeneBank accession no中心重复序列core sequence扩增片段长度(bp)fragment length引物序列(5-3)primer sequences(53)退火温度()annealing temperatureAjSSR01AB106631(ca)15286ACTAAAAAGTCATGGACACCCAATCATAGCCCATTTTTCTGT53AjSSR02AB106637(ca)11(at)6305GCAGGAGGATCTAAAATACATATCGAACACAACACACTTATC53AjSSR03AB106628(ca)9398CAAACGCATACAATTACACACGATCGATAGTCCTCAATC54AjSSR04AB106638(ca)8322GCTGAAGGCAAAAGGAATCTGTAGCAAATGTGGCAAGGAT52AjSSR05GH550573(gat)8305GTTGTAGGGTTGTTTGACAACCACTGCCACAAATCG55AjSSR06GH550563(gtat)13315CCAGCCTTGCATGTACTGCTGGTCTGACCTTCCCTTCT55AjSSR07GO270691(tat)9279TTGGTGCCCTGCGGACATATCGCTCCGTGCCACAAACA55AjSSR08FJ863049(gat)14231CTGAGGCACGGTGTCTTTACTCCTGTCCTGGGCAAT53AjSSR09FJ863087(ta)19(ta)14340AGTTTCAAGTAGAGGCAATGGTTCGGACTGACATTTGG53AjSSR10FJ863053(at)8245GCCAGAGTTTCTACAGGGGGCAATACGGCACAGTTA54数据统计与分析将电泳谱带中的每一条DNA 片段作为该座位的一个等位基因来处理，每个座位扩增的等位基因按其迁移率的不同，从小到大依次定义为:A、B、C、Z。统计各群体样本2054 期孙国华，等:刺参微卫星标记与生长性状体重、体长的相关分析基因型，用 Popgen32 计算各位点在 60 个个体中的等位基因数(a)、有效等位基因数(ae)、多态信息含量(PIC)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、Hardy-weinberg 遗传偏离指数(d)。有效等位基因数14:ae=1/p2i式中，pi为第 i 个等位基因的频率。多态信息含量的计算方法15:PIC=1 ki=1p2ik1i=1kj=i+12p2ip2j=2k1i=1kj=i+1pipj(1 pipj)式中，k 为等位基因数目，pi和 pj分别为第 i 和第 j个等位基因的频率。平均杂合度观测值:Ho=观察到的杂合个体总数/观察到的个体总数;期望杂合度16:He=1 p2i;固定指数(Fis):Fis=1 (Ho/He)。标记相关性分析采用 SPSS 软件对实验数据进行统计分析，应用一般线性模型(GLM)过程对刺参生长性状与微卫星位点的关联性进行最小二乘分析，对不同标记基因型之间生产性状指标差异显著性进行检验并进行多重比较(LSD)，进而分析等位基因的效应。采用 yij=+ai+eij线性模型公式，进行最小二乘法分析。式中 yij为某性状第 i 个标记第 j 个个体的观测值;为实验观测所有个体的平均值(即总体平均值);ai为第 i个标记的效应值;eij为随机误差。2结果2 1刺参 DNA 的提取刺参基因组 DNA 提取部分个体电泳结果显示(图 1)，基因组条带清晰无拖尾降解情况，OD260/OD280的比值均在 1 6 1 9，基本上没有蛋白质和 RNA 污染，提取的基因组 DNA 质量较好，适于 PCR 反应。图 1部分刺参个体基因组 DNAFig 1Genome DNA of some individuals of A japonicus2 2PCR 扩增结果及各位点多态信息运用 10 对微卫星引物对刺参群体 60 头个体进行了 PCR 扩增，其中 SSR10 位点的微卫星检测图谱见图2。10 对引物在60 头个体中表现出较高的多态性(表2)，共获得了 50 个等位基因;每个位点获得的等位基因从 3 到 7 个不等，SSR02 和SSR07 最多，均有7 个;每个位点平均获得 5 000 0个等位基因，平均有效等位基因个数为 3 445 5。实验中发现个别位点出现了无效等位基因(nullallele)现象，这种情况在本实验统计分析中按照纯合个体来计算杂合度的观测值。10 个微卫星位点的多态信息含量从 0 268 0 0 825 6 不等，观测杂合度最小值为 SSR07 位点的0 083 3，最大观测杂合度为 SSR10 位点的0 666 7，观测杂合度普遍小于期望杂合度。反应杂合子缺乏或过量固定指数 Fis显示，除位点 SSR07 之外，其他位点均存在杂合子缺失现象。2 3微卫星座位与体重、体长的相关分析利用 SPSS 软件包中广义线性模型(GLM)对60 头 8 月龄刺参的体重、体长生长性状和 10 对微卫星标记进行相关分析(表 4)，在 10 个微卫星位点中，AjSSR02、AjSSR04、AjSSR09 与体重、体长具有显著相关(P 0 05)，AjSSR06 位点仅与体长显著相关(P 0 05)，对差异显著的标记进行不同基因型间的不同性状的多重比较。由于一些位点中某些基因型出现太少，缺少分析价值，在实际统计分析中，每种基因型样本至少有 4 次观察值才被考虑。305水产学报35 卷在微卫星位点 AjSSR02 上，60 头个体检测到9 个基因型，其中基因型 AC 观察值少于 4 而舍去分析，基因型 AB、AD、CD 个体体重均值显著高于其他基因型个体，同时其体长也大于其他基因型。在标记 AjSSR04 中，含有等位基因 A 的基因型AA 和 AC 体长和体重均显著高于其他基因型个体，可以推测等位基因 A 对体重和体长两种生长性状有重要正面影响。位点 AjSSR06 基因型 FF平均体重与其他各基因型个体有显著差异，但各基因型个体平均体长间无显著差异。在微卫星位点 AjSSR09，除去观察值小于 4 的基因型只有AA、AB 和 BB 三个基因型。AA 基因型体重均值最大，且与其他两个基因型差异显著;BB 基因型体重均值最小，且与其他两基因型差异显著，AB基因型居中;据此可以推测等位基因 A 与体重正相关而等位基因 B 正好相反。AA 基因型体长均值与 BB 基因型体长均值之间也具有显著差异。图 260 个刺参个体 SSR10 位点的微卫星检测图谱Fig 2Demonstration of microsatellite locus amplified by primer SSR10 in60 individuals of A japonicus表 260 个刺参个体中 10 个微卫星位点的遗传参数Tab 2Genetic diversity parameters at the 10 microsatellite loci in60 individuals of A japonicus座位loucs等位基因数(a)allele有效等位基因数(ae)effectivenumbersof allele多态信息含量(PIC)polymorphicinformationcontent观测杂合度(Ho)observedheterozygosity期望杂合度(He)expectedheterozygosity固定指数(Fis)fixationindexAjSSR0153 527 70 678 70283 30722 50604 6AjSSR0276 040 30 825 60366 70841 50560 6AjSSR0343 073 00 658 70566 70680 30160 0AjSSR0443 740 30 702 80300 00738 80590 5AjSSR0541 369 10 268 00283 30271 80051 0AjSSR0675 787 80 819 40350 00834 20576 9AjSSR0742 470 80 544 70083 30600 30860 0AjSSR0853 456 60 685 60450 00716 70366 8AjSSR0942 207 20 445 10300 00551 50451 5AjSSR1063 765 70 724 40666 70740 60092 3平均值 mean5 003 445 50 635 30365 00669 80421 24054 期孙国华，等:刺参微卫星标记与生长性状体重、体长的相关分析表 310 个微卫星位点不同基因型与体重、体长的多重比较Tab 3Multiple comparisons of body weight and length in 10 microsatellite loci座位loucs基因型genotype个体数number ofindividuals体重body weight体长body length座位loucs基因型genotype个体数number ofindividuals体重body weight体长body lengthAjSSR01BB13890 332528 115CC161106 471649 184BD41068 422567 221DD141383 173640 149AjSSR02AB42440 364d830 154bBB61337 103abc735 196abCC8778 160ab498 101aAD51711 239bcd798 085bCD42004 421cd840 212bDD81075 275abc598 154abBE7491 143a428 057aEE6545 478a445 248aEF7512 139a462 039aAjSSR03AA6893 126597 103AB8725 207644 075AC141061 197598 168CC171275 189688 164AD41360 263590 121CD51112 153736 133AjSSR04AA91725 222b790 091bBB71278 284ab583 151abAC41693 193b708 102bBC9922 173ab599 128abCC17959 252ab578 107abCD5482 158a322 092aDD91191 310ab598 108abAjSSR05AA431006 201659 122AC7763 159580 103AD71406 152746 205AjSSR06AA51185 177a604 177AB71093 171a681 262CC91179 154a727 208DD61385 279ab608 204EE10772 175a511 160FF61584 264b727 208BC4397 144a663 184CE101065 285a538 194AjSSR07AA71320 252731 136BB151348 247711 140BC51004 180636 192CC33797 224530 152AjSSR08AB51793 246710 134BD12639 169584 155CC51263 143686 126DD101234 216636 149DE81317 244707 171EE18885 162546 106AjSSR09AA191592 356a713 193bAB23793 296c587 064abBB12418 143b429 101aAjSSR10AA101130 187738 221AE9948 116624 145BE20628 206506 126CE61541 116620 118EE51363 232688 0923讨论3 1分析方法基于标记的分析方法(marker-based analysis，MBA)17 是 QTL 定位的主要方法途径，如果某标记与 QTL 连锁，该标记与 QTL 在一定程度上共分离，不同标记基因型的表型存在差异，分析这种差异，即可推测标记与 QTL 的连锁关系，确定数量性状基因在染色体上的位置，可实现从表型到基因型 选 择 育 种 的 转 变。MBA 方 法 通 常 有 三类18，即单标记分析法，性状 标记回归法和性状 QTL 回归法(区间作图、复合区间作图)。单标记分析法就是通过方差分析、回归分析或似然比检验，比较不同标记基因型数量性状均值的差异。如存在显著差异，则说明控制该数量性状的QTL 与标记有连锁19。由于单一标记分析法不需要完整的分子标记连锁图谱，因而是目前普遍缺乏遗传图谱的水产动物中快速寻找某些数量性状关联的遗传标记的直接有效的方法，是当前分子标记技术结合到育种方案中去的基本思路之一。3 2微卫星标记与经济性状水产动物的体长、体重等经济性状属于数量性状。与质量性状不同，数量性状受多基因控制，遗传基础复杂，且易受环境影响，表现为连续变异。分子数量遗传学发展改变了传统数量遗传学将控制某个数量性状的多个基因作为一个整体研究的方法20，直接将研究目标指向各个基因位点，借助各种遗传标记，运用统计学手段将影响数量性状的多个基因剖分开来。从理论上讲，任何505水产学报35 卷一个可观察表型性状的基因座都存在与之连锁的DNA 标记，随着近年来分子标记技术的发展，人们已可将复杂的数量性状进行分解，借助连锁的分子标记，能够在育种中对有关数量性状的遗传动态进行跟踪，从而大大增强人们对数量性状的遗传操纵能力。本实验以 10 对微卫星标记对 60 头具生长差异的刺参个体进行了遗传多样性分析，并利用SPSS 软件对不同的基因型和刺参的生长性状体长和体重相关关系进行了分析。本实验 10 个微卫星多态位点中，8 个微卫星位点等位基因数大于4，可能较好地用于群体遗传多样性的评估21。根据 BOTSTEIN 等22 提出的衡量多态性信息含量(PIC)变异高低程度指标，7 个位点都为高度多态位点(PIC 0 5)，其他 2 个为中度多态位点(0 25 PIC 0 5)，平均多态性信息含量大于0 5，表明这些微卫星位点所包含的或能提供的遗传信息容量大，多态信息含量和群体杂合度高，可较好的用于下步相关分析。分析结果表明，4 个微卫星位点 AjSSR02、AjSSR04、AjSSR06、AjSSR09的差异基因型与刺参的生长性状体重、体长显著相关。其中既有对生长性状起正面作用的等位基因，也有起负面作用的等位基因;有单独对体长显著相关的基因型，也有跟体长和体重均相关的基因型;推测这些微卫星标记与影响刺参生长性状的效应基因连锁。3 3展望目前在刺参中己有不少微卫星标记的筛选及群体遗传分析的研究23 27，但是应用这些标记寻找与数量性状连锁的标记的研究甚少。刺参的遗传图谱构建及相关 QTL 定位方面的工作较其他水产重要经济品种而言还比较薄弱，已精确定位的数量形状基因座位还没有，我们的研究是刺参生长经济性状 QTL 与微卫星标记连锁关系的首次探索，是 QTL 准确定位的前提。随着刺参分子遗传研究工作的加深，更多重要经济性状分子标记的获得和高密度遗传图谱的构建，最终可实现分析 标 记 辅 助 选 择(marker assisted selection，MAS)，加快性状遗传进展，培育出具有多种优良性状的刺参新品种。参考文献:1 李宁 动物基因组研究计划及其对动物育种的影响 J 遗传，1997，19(增刊 1):7 102 HAMADA H，PETRINO M G，KAKUNAGA T Anovel repeated element with Z-DNA-forming potentialis widely found in evolutionarily diverse eukaryoticgenomes J Proc Natl Acad Sci USA，1982，79(21):6465 64693 TAUTA D，RENZ M Simple sequences are ubiquitousrepetitive components of eukaryotic genomesJ Nucleic Acids Res，1984，25(10):4127 41384 TOTH G，GASPARI Z，JURKA J Microsatellites indifferent eukaryotic genomes:survey and analysis J Genome 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in Apostichopus japonicusSUN Guo-hua1，YANG Jian-min1*，SUN Xiao-de1，3，SONG Zhi-le2，WANG Wei-jun1，LIU Xiao-jing1(1 Shandong Marine Fisheries Research Institute，Yantai264006，China;2 Zhifu Fishery Technical Extension Station，Yantai264001，China;3 College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai201306，China)Abstract:Ten microsatellite loci were selected to analyze the correlation with quantitative trait locus of bodyweight and length genomic of Apostichopus japonicus using single marker-based analysis DNA of 60 eightmonths old individuals of Apostichopus japonicus which have differences in growth traits were analyzed by 10microsatellite markers The results showed that a total of 50 different alleles were found，the number of alleles ineach locus was 3 to 7，and the number of mean valid alleles was 5 0 The polymorphism information content(PIC)of ten microsatellite loci was 0 083 3 to 0 666 7，and the value of heterozygosity was 0 236 1 to 0 7677，which proved the ten loci can be adopted to make correlation analysis SPSS program was used to analyze theeffects of these 10 microsatellites on body weight and length of Apostichopus japonicus The results showed thatAB，AD and CD genotypes of AjSSR02 had significant difference in body weight and length with other types，allele A of AjSSR04 played a positive role in both body weight and length，FF genotype of AjSSR06 had asignificant impact on weight but not on length，and A and B allele of AjSSR09 played positive and negativeroles in growth traits respectivelyKey words:Apostichopus japonicus;microsatellite;genetic diversity;growth traits;correlation analysisCorresponding author:YANG Jian-min E-mail:ladderup126 com805