正相模式反相模式的二维液相色谱系统的构建与应用.pdf
2008年5月M ay2008色谱Chinese J ournal of Chrom atographyVol.26N o.3374377收稿日期:2008201220第一作者:兰 韬,硕士研究生.E2m ail:.通讯联系人:张维冰,博士,教授.E2m ail:w .基金项目:国家自然科学基金资助项目(No.20605083).正相模式/反相模式的二维液相色谱系统的构建与应用兰 韬1,2,焦丰龙3,唐 涛1,2,王风云1,李 彤2,张维冰4(1.南京理工大学化工学院,江苏 南京210094;2.大连依利特分析仪器有限公司,辽宁 大连116023;3.吉林大学畜牧兽医学院,吉林 长春130012;4.中国科学院大连化学物理研究所,辽宁 大连116023)摘要:以50mm416mm的Hypersil SiO2正相色谱柱为第一维色谱系统,250mm416mm的Krom asil C18反相色谱柱为第二维色谱系统,通过升高第二维色谱温度增加两维色谱流动相间互溶性的方法构建了定量环 2 阀切换接口的二维液相色谱系统(N PLCRPLC)。根据有机溶剂的特征,在第一维正相色谱流动相中加入二氧六环,第二维反相色谱流动相中加入异丙醇,由此改善流动相兼容性的同时,有效地调整了分离选择性。采用此系统对中成药正天丸样品进行分离分析,峰容量达到1 220的色谱系统。关键词:二维液相色谱系统;正相液相色谱/反相液相色谱联用;定量环 2 阀切换接口;正天丸;中成药中图分类号:O658 文献标识码:A 文章编号:100028713(2008)0320374204 栏目类别:研究论文Estab lishm en t and app lica tion of a tw o2d im ensiona l liqu idch rom a tograp h ic system(N PLCRPLC)LAN Tao1,2,J IAO Fenglong3,TANG Tao1,2,WANG Fengyun1,LI Tong2,ZHANG W eibing4(1.Chem ica l Engineering Institu te,Nan jing Un iversity of Science and Technology,Nan jing 210094,China;2.Da lian Elite Ana lytica l Instrum en ts Co.,L td.,Da lian 116023,China;3.An im a l Science andVeterina ry Institu te,J ilin Un iversity,Changchun 130012,China;4.Da lian Institu te ofChem ica l Physics,the Chinese Academ y of Sciences,Da lian 116023,China)A bstract:A tw o2dim ensional liquid chrom atographic system(N PLCRPLC)has been devel2oped.N orm al phase liquid chrom atography(N PLC)w ith a Hypersil Si O2colum n(50mm416mm)w as used as the first dim ension,and reversed2phase liquid chrom atography(RPLC)w itha Krom asil C18colum n(250mm416mm)w as used as the second dim ension.The interfacew as a ten2port,tw o2position valve w ith tw o storage loops.As to im p rove the com patibility ofthe tw o dim ensional m obile phase and be good for adjusting the selectivity of separation,1,42dioxane w as used in the m obile phase of the first di m ension,and isop ropyl alcoholw as used inthe m obile phase of the second dim ension based on the characters of the organic solvents.B yraising the tem perature of the second dim ension,the incom patibility of the tw o dim ensionalm obile phases w as avoided.A Chinese potent m edicine,Zhengtian W an,w as analyzed by thissystem.The total peak capacity reached1 220.Key w o rds:tw o2dim ensional liquid chrom atography;norm al phaseliquid chrom atography/reversed2phase liquid chrom atography(N PLCRPLC);sam p le loops2valve interface;Zheng2tian W an;Chinese patent m edicines 多维分离具有更高的峰容量和分离能力,因而近年来得到较大的发展,尤其在环境样品的分析方法发展1、蛋白质组学研究2、中药研究3,4、生物制药5、石油分析6及烟草分析7等方面得到广泛的应用。二维液相色谱将两种不同的分离模式加以在线组合,样品中的不同组分基于多种物理化学性质的差异可以得到更好的分离。最近,D ugo等8对二维液相色谱的理论与应用进展做了系统的综述;在我们的前期工作9-11中也构建了多种模式的二维液相色谱系统,并应用于蛋白质、中药等复杂样品体系的研究。采用两种不同的分离模式结合构建成不同的二 第3期兰 韬,等:正相模式/反相模式的二维液相色谱系统的构建与应用维液相色谱分离系统,在理想的情况下两种分离模式完全正交,二维系统总的峰容量等于两种分离模式单独应用时峰容量的乘积12。分离小分子化合物时正相色谱与反相色谱的选择性差别最大,理论上二维液相系统中以正相液相色谱/反相液相色谱(N PLCRPLC)的组合模式分离效能最高,但由于流动相的兼容性、切换系统的复杂性等因素的影响,目前很难达到理想的效果。第一维谱峰的展宽使得进入第二维色谱的进样谱带宽度比第二维色谱柱的塔板高度高23个数量级,但又很难利用溶剂聚焦作用来压缩进样谱带,导致分离效率大大降低。D ugo等13,14构建了一套N PLCRPLC二维液相色谱系统,在第一维系统中采用细内径正相色谱柱,第二维系统中采用常规分析柱,通过切换系统使第一维色谱的流出物直接进入到第二维色谱中。由于每一次切换的第一维流出物体积很小,其中的流动相相当于第二维分离样品的一种组分,因此可以有效地避免流动相的兼容性问题。Som nefeld等15也设计了一套二维液相色谱系统,他们模仿二维气相色谱的设计,使第一维正相流动相在接口处蒸发,进一步置换成反相色谱流动相完成第二维色谱分离。关亚风等16曾用内径为0153mm的填充毛细管正相液相色谱为第一维,用内径为416mm的整体柱反相色谱为第二维,建立了定量环 2 阀切换接口的全二维液相色谱系统。中成药正天丸为黑色水丸,由羌活、川芎、钩藤、细辛、麻黄、独活、当归、桃仁、红花、地黄、白芍、防风等15味中药炮制而成。主要用于疏风活血,养血平肝,通络止痛。本文基于不同溶剂的性质,在第一维正相色谱中以正己烷和1,42 二氧六环作为流动相,在第二维反相色谱中采用含有异丙醇的流动相梯度洗脱分离模式,并通过升高第二维分离温度的方法提高两维流动相的互溶性。采用200L定量环 2 阀接口,构建了一套N PLCRPLC二维液相色谱系统,并将其应用于中成药正天丸的分离研究。1 实验部分1.1 仪器与试剂P230高压恒流泵,UV230+紫外 2 可见检测器,EC2000工作站,流动相加热冷却器,Z W柱温控制器(以上仪器均由大连依利特分析仪器有限公司生产);Rheodyne EV7502102十通切换阀,Rheodyne7725i进样阀;索氏提取器,SENCO R系列旋转蒸发仪。实验用水由M illipore纯水系统(美国M illipore公司)制备;甲醇、异丙醇、正己烷、1,42 二氧六环、乙醇(以上试剂均为色谱纯)。正天丸(深圳三九制药集团公司)。1.2 正天丸样品的制备 用研钵将正天丸药丸研细,精密称取正天丸粉末10g,放入250mL索氏提取器中,加入100mL乙醇,索氏提取15h,提取液旋转蒸干后用乙醇溶解并定容到10mL,过滤后备用。1.3 分离条件1.3.1 第一维正相色谱分离条件Hypersil SiO2色谱柱(50mm416mm,5m);流动相:1,42 二氧六环/正己烷(体积比为015/9915);流速:011mL/m in;进样量:20L;紫外检测波长:240nm。1.3.2 第二维反相色谱分离条件Krom asil C18色谱柱(250mm416mm,5m);流动相A:异丙醇/水(体积比为2/98),流动相B:甲醇;流速:1mL/m in;流动相梯度洗脱程序为:030m in,10%B90%B;3040m in,90%B;4045m in,90%B10%B;4560m in,10%B。柱温:60;进样量:20L;紫外检测波长:240nm。2 结果与讨论2.1 二维液相色谱分离分析系统的构建 采用定量环 2 阀切换作为第一维色谱与第二维色谱联用的切换接口(见图1),构建成正相模式/反相模式二维液相色谱分离系统。当切换阀在位置1(Position1)时,第一维色谱正相洗脱2m in的产物图1 二维液相色谱系统接口的示意图F ig.1Schem a tic d iagram of the in te rfaceof tw o2dim ensiona l LC被储存于定量环(Sam p le loop)中;当切换阀处于位置2(Position2)时,储存在定量环中的一维色谱573色谱第26卷分离产物被反相流动相洗脱入第二维反相色谱继续分离分析60m in。如此反复进行7次操作,使第一维色谱分离产物被第二维色谱继续分离,并最终被检测。2.2 流动相的选择 在正相液相色谱中通常采用正己烷、乙酸乙酯、丙酮等非极性或极性很弱的有机溶剂作为流动相。由于1,42 二氧六环的结构特征,使其具有一些特殊的物理化学性质。典型的性质是,尽管1,42 二氧六环为非极性分子,但其具有很好的水溶性。本文将其与正己烷混合作为正相色谱流动相,不仅可以有效地改善正相色谱的分离选择性,同时也可以兼顾其与第二维反相色谱流动相的兼容性。异丙醇是一种优良的反相液相色谱流动相有机调节剂,但由于其粘度较高,在一般的液相色谱中很难得到广泛的应用。在我们前期的工作17中,在采用异丙醇作为反相色谱流动相的同时,采用升高柱温的方法降低了流动相的粘度,提高了分离速度,取得了很好的效果。本文也采用异丙醇作为有机改性剂,在改善两种分离模式流动相的兼容性的同时,用以调节分离选择性。2.3 柱温的选择 提高柱温一方面可提高流动相的兼容性,另一方面能有效地提高第二维色谱分离的速度,有效地减少分析时间。2.3.1 柱温对流动相兼容性的影响 通过在不同温度下进行的空白实验可以看出,在60 柱温下二维流动相间的兼容性要好于30的情况。2.3.2 柱温对分析时间的影响 升高柱温可在降低柱压的同时缩短分析时间。在以初始浓度流动相过色谱柱时,当柱温为30时,柱压为14.6M Pa;当柱温为60 时,柱压减小至8.6M Pa,这为增加柱长、提高色谱柱的分离效能提供了空间。实验结果表明,在30 下分析正天丸样品时,最后一个色谱峰的保留时间为33.97m in,而在60 下同一峰的保留时间为32.2m in。2.4 对中成药正天丸的分析 中成药样品常含有几百种甚至上千种组分,因此采用液相色谱分离这些样品是一个十分艰巨的任务。在假定色谱峰均匀分布的条件下,采用一维液相色谱进行分离时,分离10个峰需750个理论塔板,分离50个峰需22 000个理论塔板,分离500个峰需200万个理论塔板(分离度为115),而目前的主流色谱柱最高柱效仅能达到10万理论塔板/m。即使采用1m甚至更长的色谱柱进行分离,仍远不能满足分离的要求;而且长柱的压降很高,给仪器的正常使用以及维护带来很大的不便。鉴于此,分离复杂样品需采用二维甚至多维液相色谱,以提供足够的峰容量以及高的选择性。采用“113”节的色谱条件得到的正天丸样品的正相色谱分离结果如图2所示。正天丸样品在此条件下共检出色谱峰6个,系统峰容量为10。图3中给出了正天丸样品的反相色谱分离结果。在此条件下共检出色谱峰78个,系统峰容量为122。图2 正天丸的正相液相色谱分离谱图F ig.2Ch rom a togram of N PLC sep a ra tionof Zhengtian W an图3 正天丸的反相液相色谱分离谱图F ig.3Ch rom a togram of RPLC sep a ra tionof Zhengtian W an 在上述优化的实验条件下采用构建的二维液相色谱系统对正天丸样品进行分析,共进行7次切换(总流程需时440m in),即:进样后先在正相色谱条件下运行8m in,切换十通阀,正相色谱系统停泵。将正相色谱中洗脱到定量环上的产物用反相色谱系统进行二次分离,运行60m in;切换十通阀,反相色谱系统停泵,正相色谱系统运行2m in,将正相系统分离的样品储存到定量环中。如此反复进行7次切换,所得到的二维色谱图如图4所示。采用二维系统共检出色谱峰163个,系统峰容量达到1 220。对比图2,3与图4,二维液相色谱的分离空间利用率得到较大的提高,所分离样品的色谱峰分布较均匀,谱峰重叠现象显著减少,更适合于精细分离673 第3期兰 韬,等:正相模式/反相模式的二维液相色谱系统的构建与应用图4 正天丸的N PLCRPLC分离谱图F ig.4Ch rom a togram s of N PLCRPLC sep a ra tionof Zhengtian W an(1)-(7)denote the1st to the7th valve sw itching.复杂样品的组成。同时,二维液相色谱的强大的分离能力,使得样品中大多数低含量组分与高含量组分很好的分离,避免其被高含量组分所掩盖,故能有效地提高检出灵敏度。3 小结 本文用200L定量环 2 阀接口,在第一维采用以正己烷和1,42 二氧六环作为流动相的正相色谱,第二维采用含有异丙醇的流动相梯度洗脱的反相色谱,通过升高第二维温度的方法提高两维流动相的互溶性的策略构建N PLCRPLC二维液相色谱系统,并应用此系统对中成药正天丸进行分析。通过440m in的7次切换共检测出163个峰,峰容量达到1 220。实验结果表明,采用特殊的流动相体系构建的全二维液相色谱系统能充分发挥正相色谱与反相色谱的色谱保留相关性低的特点,取得了较好的分离分析效果。参考文献:1Lu X,Cai J L,Kong H W,et al.Anal Chem,2003,75:4 4412W ang Z C,Zhang Q H,Li T.Journal of Instrum entalAnaly2sis(王智聪,张庆合,李彤.分析测试学报),2005,24(5):1303Gao H,Wen X S,M a X J,et al.Chinese Journal of Pharm a2ceutical Analysis(高辉,温学森,马小军,等.药物分析杂志),2007,27(4):6164Chen X G,Kong L,Sheng L H,et al.Chinese Journal ofChrom atography(陈学国,孔亮,盛亮洪,等.色谱),2005,23(1):465Tian J,Lu X,Yang J,et al.Chinese Journal of Chrom 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