小麦抗白粉病SSH-cDNA文库中差异基因的表达模式.pdf

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008,34(12):21212125 http:/www.chinacrops.org/zwxb/ISSN 0496-3490;CODEN TSHPA9 E-mail: 基金项目:国家重点基础研究发展计划(973 计划)前期项目(2006CB708208)；国家科技支撑计划项目(2006BAD01A02)作者简介:吴金华(1978),女,山西朔州人,博士,主要从事小麦抗病育种及其分子生物学研究。E-mail:*通讯作者(Corresponding author):吉万全,男,博士,教授,博士生导师,主要从事小麦遗传育种与分子生物学研究。E-mail: Received(收稿日期):2008-03-07;Accepted(接受日期):2008-06-05.DOI:10.3724/SP.J.1006.2008.02121 小麦抗白粉病 SSH-cDNA 文库中差异基因的表达模式 吴金华1,2 胡银岗2 王新茹3 张 宏2 王长有2 王秋英2 吉万全2,*(1 河北农业大学农学院,河北保定 071001;2 西北农林科技大学农学院/陕西省农业分子生物学重点实验室/国家小麦改良中心杨凌分中心,陕西杨凌 712100;3 陕西省农药管理检定所,陕西西安 710003)摘 要:为了解白粉菌诱导下抗白粉病小麦的抗病机制,构建了白粉菌接种初期的抑制性消减杂交 cDNA(SSH-cDNA)文库。从中随机挑取 140 个阳性克隆进行测序,去除冗余序列和重复序列后,得到 94 条 EST,利用 NCBI的 BLAST 在线序列比对工具对 GenBank 的蛋白质数据库进行同源性比对及功能分类。结果表明,49 个 EST 与已知功能蛋白同源性较高,主要涉及初级代谢(2%)、能量代谢(24%)、细胞结构(2%)、转录(2%)、蛋白质合成加工与储藏(16%)、转运(4%)、信号转导(4%)和抗病与防御(30%)。经文库比较,筛选出与病程相关蛋白基因同源的 EST(Z25-1)和与谷胱甘肽硫转移酶同源的 EST(Z440-1),GenBank 登录号为 EX567369 和 EX567360。以其 EST 序列为依据设计引物,通过 RT-PCR 分析它们在白粉菌诱导下的表达模式,结果该 2 基因表达存在明显差异。其中,Z25-1 在未接种白粉菌时具有一定的表达量,白粉菌侵染后表达量开始上升,侵染 72 h 时表达量最高,然后下降;Z440-1 在未接种时也具有一定的表达量,但在接种初期表达微弱,甚至不表达,24 h 后表达开始上升,到 72 h 时达最高,然后下降。本研究表明,病程相关蛋白和谷胱甘肽硫转移酶属于诱导型表达基因,且参与白粉病抗病反应,在白粉菌诱导 72 h 时表达量最高。关键词:小麦;白粉病;抑制性消减杂交(SSH);反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)Expression Pattern of Special Genes Resistant to Powdery Mildew(Blumeria graminis f.sp.tritici)in SSH-cDNA Library of Wheat WU Jin-Hua1,2,HU Yin-Gang2,WANG Xin-Ru3,ZHANG Hong2,WANG Chang-You2,WANG Qiu-Ying2,and JI Wan-Quan2,*(1 College of Agronomy,Agricultural University of Hebei,Baoding 071001,Hebei;2 College of Agronomy,Northwest A&F University/Yangling Branch of China Wheat Improvement Center/Shaanxi Provincial Key Laboratory of Molecular Biology for Agriculture,Yangling 712100,Shaanxi;3 Institute for Control of Agrochemicals of Shaanxi Province,Xian 710003,Shaanxi,China)Abstract:Powdery mildew,caused by Blumeria graminis f.sp.tritici,is one of the most important fungal diseases of common wheat(Triticum aestivum L.)worldwide and causes severe yield losses.Wheat germplasm N9436,developed by our research group,is a resistant material to powdery mildew.In the present study,a suppression subtraction hybridization(SSH)cDNA library was constructed with cDNA from N9436 leaf inoculated by Blumeria graminis as the tester and cDNA from N9436 healthy leaf as the driver.A total of 140 positive clones were randomly chosen from the SSH-cDNA library and were amplified with sp6 and t7 primers to examine the insert size,which ranged from 200 to 1 000 bp with an average of 238 bp.After screening repeat and re-dundancy sequences,94 expressed sequence tags(ESTs)were acquired.Protein homology search in nr-protein database revealed that 49 ESTs were highly homologous with known proteins functioning in primary metabolism(2%),energy metabolism(24%),cell structure(2%),transcription(2%),protein synthesis and processing(16%),transport(4%),signal transduction(4%),and dis-ease resistance and defenses(30%).Compared with the EST sequences among the SSH-cDNA library,two ESTs(GenBank ac-cession numbers:EX567369 and EX567360)were highly similar to pathogenesis-related protein(Z25-1)and glu-tathione-S-transferase(Z440-1),respectively.On the basis of the EST sequences,two pairs of primers were designed and used to 2122 作 物 学 报 第 34 卷 detect the expression differences of the two genes when inoculating with powdery mildew by Reverse Transcriptase PCR(RT-PCR).Z25-1 and Z440-1 were both expressed under inoculation.Their expression amounts were the largest in 72 h after inoculation with powdery mildew.But their expression trends were different.At early stage of inoculation(24 h after inoculation),the expression amount of Z440-1 was very a little,then increased in 72 h,and finally decreased in 96 h.The expression amount of Z25-1 increased from 24 h to 72 h after inoculation and decreased after 96 h.It suggests that pathogenesis-related protein and glutathione-S-transferase belong to inducible expression genes and are involved in the resistance to powdery mildew.Keywords:Wheat;Powdery mildew;Suppression subtraction hybridization(SSH);Reverse transcriptase PCR 白粉病是由 Blumeria graminis f.sp.tritici 引起的世界性小麦真菌病害之一,也是目前危害我国小麦生产的一个主要病害。该病是大区性气传病害,传播远,流行广,危害重。白粉病原菌的生理小种多,毒性变异速度快,很容易造成品种抗病性的丧失。因此加强抗病反应机制研究、延长抗病品种的“寿命”和拓宽抗病品种的抗病谱非常重要1。培育抗病新品种的基本途径,一是发现与利用新的抗病基因,二是诱导防御基因的表达。抗病基因的产物决定抗病系统能否打开或打开的程度,而真正起抗病作用的是防御基因2。由于系统获得性抗性(SAR)具有系统性、持久性、广谱性的特点,研究其作用机制不仅有理论价值,也有实际意义。抑制性消减杂交(SSH)揭示不同条件下差异基因的表达状况,为相关候选基因的分离和克隆提供理论基础。利用该技术,Wang 等3分析了大豆疫霉(Phytophthora sojae)侵染初期基因表达差异;Chen等4电子克隆了编码小麦抗坏血酸过氧化物酶的全长cDNA;Wong等5在红树植物上鉴定并分离了126个盐胁迫cDNA;Yang等6根据微阵列结果鉴定了番茄(Solanum lycopersicum)盐胁迫应激基因;Lin 等7鉴定了竹(Bambusa edulis)中白化突变体的差异表达基因;Chen等8在含 Pm21的小麦(Yangmai 5)近等基因系中分离了抗性基因。反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)是一种直观、简单易行的基因表达验证方法,对实验条件要求不高,理论上有一个单拷贝 cDNA 模板即可完成扩增,具有较高灵敏度9。董宏平等10用半定量 RT-PCR方法研究了 18 个信号传导调控基因的表达及其可信度,表明该方法能够准确检测不同基因表达的相对水平。孙晓红等11应用半定量 PCR 分析了 4 个冷诱导相关基因的表达差异。张丽娜等12利用半定量技术研究了与白粉病有关的小麦 TaMlo-A1c 基因的表达。本研究通过构建抗白粉病小麦在白粉菌接种前后的抑制消减杂交文库,并对文库中部分差异基因进行 RT-PCR 分析,为系统揭示小麦抗白粉病的分子机制,发现小麦抗白粉病的关键基因,明确差异基因的表达模式奠定了基础。1 材料与方法 1.1 材料 以本研究室培育的小麦种质 N9436(多小穗,高抗白粉病)为试材,将幼苗在温室内培养 3 周后,采用涂抹法接种陕西关中地区白粉菌优势小种关中 4号,以不接种为对照。接种后植株罩以透明塑料桶,保湿保温以利于病原菌侵染。接种后 24、48、72 和96 h 分别剪取对照和接种材料的叶片约 0.2 g,置于液氮中研磨,提取总 RNA。1.2 消减文库的构建 采用 BIOZOL 总 RNA 提取试剂(BIOZOL 公司,杭州)提取叶片总 RNA,并用 DNase I(TaKaRa 公司,大连)去除残留的痕量 DNA。采用 AMV 反转录酶(Promega 公司,美国),以Oligo(dT)18为引物将总 RNA 反转录合成 cDNA,以接种叶片的 cDNA 为 tester,对照叶片的 cDNA 为driver,依 照PCR Select cDNA Subtraction Kit(Clontech 公司,美国)的说明书进行 SSH。对经 2 次消减杂交的产物再进行 2 次巢式 PCR扩增,扩增得到的产物经纯化后,与 pGEM-T easy 载体(Promega,美国)连接,转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5感受态细胞,转化细胞经含 100 g mL1氨苄青霉素的 LB/IPTG/X-gal 平板的筛选培养,挑选白色克隆进行以Sp6和T7启动子序列引物的菌落PCR,筛选阳性克隆并检测插入片段的大小。1.3 序列测定及生物信息学分析 将阳性克隆过夜培养,采用 HQ&Q 质粒微量抽提试剂盒(优晶公司,安徽)提取质粒 DNA,送上海生工生物工程公司测序。测序所得序列去除载体和接头序列,利用 DNAstar 及 CAP3 软件去除冗余序列和重复序列以及小于 100 bp 的序列,提交GenBank 数据库。所得EST,经NCBI的非冗余蛋白数据库BLASTx比对后进行功能分类13-14。第12期 吴金华等:小麦抗白粉病 SSH-cDNA 文库中差异基因的表达模式 2123 1.4 RT-PCR 中所用引物、反应体系及程序 以文库中部分 EST为模板,利用 Primer Premier 5 进行引物设计(序列见表 1),由上海生工生物工程公司合成。以 18S rRNA 为内参基因,在内参基因 PCR 产物进入平台期前结束 PCR,根据 PCR 的指数增长曲线,选择产量高而又位于平台期前的循环次数。对反转录后的 cDNA,用 18S rRNA 作为内参基因调整模板浓度。反应体系包括经内参调整的适宜体积的 cDNA模板,10PCR buffer 2 L,2 mmol L1 dNTP 2 L,10 mmol L1正向和反向引物各 0.5 L,5 U L1 Taq DNA 聚合酶 0.2 L,以 ddH2O 补齐至 20 L。通过梯度 PCR 确定每对引物的最适退火温度(表 1)。PCR程序为 95预变性 2 min;95 40 s,5057(依引物而异)45 s,72 40 s,共 33 个循环;72延伸 10 min。反应后于 4保温,扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测。表 1 RT-PCR 分析所用的引物序列及反应温度 Table 1 Primers sequence and Tm values of RT-PCR 引物 Primer 假定基因 Putative gene 引物序列 Primer sequence(5 3)退火温度 Annealing temperature()L：ACCAGGGAGTAATGGAGACG Z25-1 Pathogenisis-related protein R：GTTGCAGGTGATGAAGACG 56 L：ACTACTCCCTCCATGCCTAT Z440-1 Glutathione-S-transferase R：CATCCCGTTCACCTTCTACT 50 L：CTTCTTAGAGGGACTATGGC 18S rRNA R：TACGGAAACCTTGTTACGAC 53 2 结果与分析 2.1 SSH-cDNA 文库的构建 经 Biozol 提取的小麦叶片总 RNA 中 25S rRNA是 18S rRNA 的 2 倍(图 1)。经检测,A260/A280值介于1.82.0,A260/A230值大于 2.0 表明提取的总 RNA 质量良好,达到建库要求。图 1 接种白粉菌后不同时间的小麦叶片总 RNA Fig.1 Total RNA extracted from wheat leaf at different time after inoculating with powdery mildew CK:no inoculation with powdery mildew.RNA 经 AMV 反转录酶合成的双链 cDNA 后运用 SSH 技术进行正向差减杂交,2 次巢式 PCR 扩增的 cDNA片段采用 T/A克隆法构建 SSH-cDNA 文库,文库中随机挑取阳性克隆进行 PCR 扩增,琼脂糖电泳检测结果表明,片段大小介于 2001 000 bp 之间(图 2),平均插入片段大小为 238 bp,说明构建的文库质量较好。2.2 EST 序列的比对分析 在经菌落 PCR 鉴定的克隆中,随机选取 140 个克隆进行测序,去除冗余序列和重复序列以及小于100 bp 的序列后,将获得的的 94 个非重复序列提交 图 2 消减文库部分克隆的 PCR 检测 Fig.2 PCR identification of inserted fragments in the SSH-cDNA library M:DL2000;116:16 clones selected randomly.GenBank。GenBank 序列号为 EX567357EX567450,dbEST-Id 为 5007332150073414。该 94 个 EST 在 NCBI 的非冗余蛋白数据库的Blastx比对结果表明,其中49个(占52.1%)与已知功能蛋白同源性较高,主要涉及初级代谢(2%)、能量代谢(24%)、细胞结构(2%)、转录(2%)、蛋白质的合成加工及储藏(16%)、转运(4%)、信号转导(4%)和抗病与防御(30%);此外,未知功能的 EST 占 16%。2.3 cDNA 模板浓度的确定 以 18S rRNA 为内参基因,经过 PCR 扩增确定PCR 的循环数为 34 时进入平台期,因此 PCR 取 33个循环。用 18S rRNA 调整模板用量,当扩增产物的亮度基本一致时,可确定模板浓度一致(图 3),以用于特异性扩增。2.4 表达模式分析 在内标基因表达一致的情况下,Z25-1(病程相关蛋白)RT-PCR 扩增结果表明,未接种白粉菌时具2124 作 物 学 报 第 34 卷 有一定的表达量,白粉菌侵染 24 h 后表达量开始上升,一直到72 h表达量达到最高,96 h时又开始减少(图 4)。Z440-1(谷胱甘肽硫转移酶)RT-PCR 扩增结果表明,未接种时具有一定的表达量,接种白粉菌初期表达微弱甚至不表达,24 h 后表达量开始上升,72 h 时表达量达到最高,96 h 时又开始下降(图 5)。进一步表明,病程相关蛋白和谷胱甘肽硫转移酶是白粉菌诱导型相关基因,参与抗白粉病反应。图 3 不同接种时间调整后的模板浓度 Fig.3 Template concentration after adjustment at different time after inoculation M:DL2000;CK:no inoculation with powdery mildew.图 4 Z25-1 在白粉菌不同处理时间的表达模式 Fig.4 Expression profile of Z25-1 at different time after inocula-tion with powdery mildew M:DL2000;CK:no inoculation with powdery mildew.图 5 Z440-1 在白粉菌不同处理时间的表达模式 Fig.5 Expression profile of Z440-1 at different time after inocula-tion with powdery mildew M:DL2000;CK:no inoculation with powdery mildew.3 讨论 3.1 植物与白粉菌互作机制 植物抗白粉病是一个复杂系统的过程,涉及生理、生化途径的多个方面,体现了生命活动在整体上的协调性。因此,抗病过程不仅仅是抗病基因的识别和开启,更重要的是这一过程中抗病相关基因的表达以及抗病信号的传递。在病菌与寄主互作中,植物主要是通过防卫基因的表达、过敏反应和系统获得性抗性等来抵抗病菌的入侵,如谷胱甘肽硫转移酶以及病程相关蛋白等都与植物抗病性的表达密切相关。曹爱忠等15研究表明,白粉菌诱导后簇毛麦中的防卫反应基因细胞色素、热激蛋白、乙醛酸脱氢酶等,病程相关蛋白类甜蛋白、-1,3-葡聚糖酶等,活性氧清除基因谷胱甘肽硫转移酶、过氧化物酶等,信号传导因子丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶等表达量增加超过 2 倍。骆蒙等16在所构建的白粉菌混合文库中,出现大量抗病相关蛋白。本文所构建的 SSH-cDNA 文库中,抗病与防御基因所占比例最高,说明小麦经白粉菌诱导 72 h 后其抗病及防御机制明显加强,在植物体内积累一套病程相关基因,诱导植物的全面防卫反应,有效抑制病原生长、繁殖和扩散。3.2 抗性相关基因 骆蒙等16为了获得 SAR 启动与持续发挥作用相关基因,特别是相关信号传导途径,构建了接种24、48 和 72 h 的混合文库。曹爱忠等15利用大麦基因芯片,将接种白粉菌 24、48 和 72 h 的簇毛麦叶片提取 RNA 后等量混合,筛选簇毛麦抗白粉病相关基因。何道一等17以接种白粉菌的小麦长穗偃麦草异代换系山农551为材料,利用代表性cDNA库的扩增(cDNA RDA)和快速 cDNA 末端扩增法(RACE)技术克隆了 2 个相关的新基因 WRP1 和 RPW2。马金彪等18构建的小麦条锈菌 cDNA 文库中有谷胱甘肽硫转移酶的表达。谷胱甘肽硫转移酶是系统获得性抗性体系诱导防卫蛋白,在细胞质中能清除植物抗病过程中积累的还原性氧类(ROS),减少 ROS 的毒性和破坏性作用,参与毒素的分解代谢,从而保护植物细胞19。Enayati 等20证明 GST 与昆虫抗药性有关,可作为杀虫剂的三大解毒代谢酶系之一。本研究通过半定量 RT-PCR 分析,表明谷胱甘肽硫转移酶和病程相关蛋白均属白粉病抗病相关蛋白,其作用机制有待进一步研究。4 结论 采用抑制性消减杂交技术构建了白粉菌接种初期小麦抗性种质 N9436 的 SSH-cDNA 文库,并对文库中部分差异基因进行了 RT-PCR 分析,明确了其表达模式。病程相关蛋白和谷胱甘肽硫转移酶属于诱导型表达基因,在白粉菌诱导 72 h 表达量最高。References 1 Liao Y(廖勇),Zhang Z-Y(张增艳),Du L-P(杜丽璞),Xu H-J(徐惠君),Yao W-L(姚乌兰),Shi J-Y(石建业),Ren Z-L(任正隆),Xin Z-Y(辛志勇).Isolation of RAR1 gene from Thinopyrum in-termedium and analysis of its function in wheat background.Sci 第12期 吴金华等:小麦抗白粉病 SSH-cDNA 文库中差异基因的表达模式 2125 Agric 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T,Pohl T M,Terryn N,Gielen J,Villarroel R,De Clerck R,Van Montagu M,Lecharny A,Auborg S,Gy I,Kreis M,Lao N,Kavanagh T,Hempel S,Kotter P,Entian K D,Rieger M,Schaeffer M,Funk B,Mueller-Auer S,Silvey M,James R,Montfort A,Pons A,Puigdomenech P,Douka A,Voukelatou E,Milioni D,Hatzopoulos P,Piravandi E,Obermaier B,Hilbert H,Dsterhft A,Moores T,Jones J D G,Eneva T,Palme K,Benes V,Rechman S,Ansorge W,Cooke R,Berger C,Delseny M,Voet M,Volckaert G,Mewes H W,Klosterman S,Schueller C,Chalwatzis N.Analysis of 1.9 Mb of contiguous sequence from chromosome 4 of Arabidopsis thaliana.Nature,1998,391:485488 15 Cao A-Z(曹爱忠),Li Q(李巧),Chen Y-P(陈雅平),Zou X-W(邹晓文),Wang X-E(王秀娥),Chen P-D(陈佩度).Screening resis-tance-related gene to powdery mildew in Haynaldia villosa using barly genechip and studying its mechanism of resistance.Acta Agron Sin(作物学报),2006,32(10):14441452(in Chinese with English abstract)16 Luo M(骆蒙),Kong X-Y(孔秀英),Huo N-X(霍纳新),Zhou R-H(周荣华),Jia J-Z(贾继增).Analysis of gene resistant to powdery mildew 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