枸杞胼胝质酶基因克隆及在雄性不育材料中的表达分析_李.pdf

西北植物学报，（）：文章编号：（）枸杞胼胝质酶基因克隆及在雄性不育材料中的表达分析李彦龙，樊云芳，戴国礼，秦垦，曹有龙（国家枸杞工程技术研究中心，银川 ）摘要：以雄性不育枸杞 宁杞号 和正常可育枸杞 宁杞号 为材料，提取不同发育时期枸杞花蕾，反转录合成 ，利用胼胝质酶的，葡聚糖酶属性进行同源克隆和半定量 分析。结果表明：（）所克隆的胼胝质酶基因（）属于植物糖基水解酶第 家族基因，编码 个氨基酸，有个氨基酸保守区在种植物的花药，葡聚糖酶基因中都存在。（）在正常可育枸杞花药中高量表达，在雄性不育枸杞花药中表达沉默，但基因序列并没有发生突变。（）经苯胺蓝染色观察，雄性不育枸杞花药四分体分解受阻与 基因表达沉默同步。研究结果提示，基因是受不育基因调控的下游基因，参与了枸杞花粉的败育过程，基因沉默是雄性不育枸杞花粉败育的一个重要原因。关键词：枸杞；雄性不育；胼胝质酶；半定量 ；苯胺蓝染色中图分类号：文献标志码：，（，）：，（），（），：（），（），（），：；雄性不育和不育机理的研究一直是植物育种研究的重点内容之一。枸杞（）作为中收稿日期：；修改稿收到日期：基金项目：国家自然科学基金（，）；宁夏自然科学基金（）；宁夏农林科学院自主研发项目作者简介：李彦龙（），男，硕士，助理研究员，主要从事枸杞种质资源与分子生物学研究。：通信作者：曹有龙，博士，研究员，主要从事枸杞研究工作。：国传统的名贵药食同源植物，其不育系 宁杞号（以前称 ）于 年由宁夏农林科学院研究人员在考察主栽品种 宁杞号 枸杞园时发现，该不育系雄蕊不散花粉，单一种植不结果，受周边枸杞树的自然传粉而结实，平均单果重是主栽品种 宁杞号 的 倍，干果优级率高，生长旺盛，萌芽和盛果期比 宁杞号 早一周时间，具有良好的研究利用价值。采用细胞切片技术，对枸杞不育系和可育系的花药发育的观察研究表明，不育枸杞花药在四分体形成之前的各个时期发育均正常，但在四分体形成之后，四分体无法正常释放单核花粉粒，初步判断雄性不育枸杞的花粉败育可能与四分体外围的胼胝质不分解有密切关系。胼胝质是植物有性生殖过程的重要特征之一，特别是即将进行分裂的性细胞，如大小孢子母细胞壁和合子壁等，起到机械隔离、化学屏障或者分子筛等保护作用，防止小孢子在释放前细胞间发生凝聚和融合，保护发育中的小孢子不受周边二倍体组织的影响，以及过早膨胀和破裂，给花粉外壁纹饰的发育成形起到“模具”的作用。植物花药四分体外壁的胼胝质对于小孢子的发育成熟起着非常重要的作用，按照发育规律适时分解更是关键，分解过早小孢子发育不全，不分解或者延迟分解，小孢子难以正常释放，两种情况均可导致花粉败育。因此解析枸杞雄性不育的分子机理的首要任务是克隆和研究控制胼胝质分解的酶基因。对胼胝质的研究表明，胼胝质的主要成分是，葡聚糖，由 基因负责合成 ，葡聚糖酶即胼胝质酶负责分解。植物花药胼胝质酶基因目前仅在拟南芥（基因）、甘蓝型油菜（基因）、烟草（基因）和水稻（基因）中获得克隆，定位于绒毡层细胞中 。胼胝质酶基因在四分体解体前夕高量表达，随后迅速消失。这说明胼胝质酶在植物花药发育过程中起着非常重要的作用，与雄配子的发育和成熟关系密切。本研究根据雄性不育枸杞花药四分体难以分解的细胞学特性，对枸杞的胼胝质酶基因进行克隆和表达分析研究，以此探讨枸杞的雄性不育机理。材料和方法 材料雄性不育枸杞 宁杞号（也称 ）和正常可育枸杞 宁杞号，均为宁夏枸杞（）品种，来源于国家枸杞工程技术研究中心的枸杞种质资源圃。样品采集枸杞花期持续时间较长，在盛花期采集个不同发育时期的枸杞花蕾，花蕾长宽大小分别为第时期 、第时期 、第时期 和第时期 。去掉花梗，液氮中速冻，保存。雄性不育枸杞和正常可育枸杞各采集份。和 的提取 的提取采用 公司的 试剂法：从超低温冰箱中取出枸杞花蕾，液氮研磨，取约 粉末加入 试剂（公司）于 离心管中，混匀后室温条件下裂解 ，再加入 氯仿，剧烈混匀，室温放置 ，条件下 离心 ，上清液用等体积的异丙醇室温静置沉淀 ，条件下 离心 ，沉淀用 乙醇清洗遍，、离心 ，沉淀在超净工作台内吹风干燥，水溶解，保存备用。提取采用常规 溶液法，参照 精编分子生物学实验指南 进行提取，提取液中含 ，巯基乙醇。提取的总 和 分别用和 的琼脂糖凝胶电泳检测。克隆根据，葡聚糖酶（，）基因的 同源序列设计兼并引物 和（表），以 为模板，进行 首先获得片段，即基因中间片段；再由 、引物进行一次 获得片段，即基因 端；用特异引物 和 进行 扩增获得片段，即基因 端。最后以 、特异引物 扩增分别获得基因 全长和 全长。聚合酶为 公司的 高保真 聚合酶。引物序列见表。产物经的琼脂糖凝胶电泳分离，琼脂糖凝胶试剂盒（北京天根生物公司）回收，连接至 载体，热激转化 感受态细胞，用蓝白斑筛选和菌液 鉴定阳性克隆，每一个转化子挑取两个阳性克隆送测序公司测序。半定量分析总 用 （，公司）处理 ，去掉其中的 污染，紫外分光光度计（，）检测浓度，西北植物学报 卷表 引物 片段 正向引物 名称 序列 （）反向引物 名称 序列 （）取 用于反转录。反应体系为模板，锚定 （浓度 ，序列 ），反转录酶（浓 度 ，公 司），（浓度 ），（浓度），处理水加至反应总体积。模板 与反转录引物 的变性和退火条件为 ，冰浴冷却 。反转录条件为 水浴 。合成的 第一链倍稀释后作为 扩增的模板，保存。半定量 反应体系为 模板范围调整，浓度为 的正、反向引物各，普通 聚合酶（浓度），（浓度 ），超纯水加至总反应体积。反应条件 ，（，个循环，其中 用 个循环），。枸杞骨架蛋白 作半定量的内参基因，琼脂糖凝胶电泳检测样品间的基因表达差异。半定量 引物，使用 和，使用 和 （表）。序列比对与基因结构作图单克隆测序后，提交 网站进行 序列比对，对其同源基因序列及氨基酸序列进行下载整理。序列分析和拼接使用 ，氨基酸序列多重比对以及 树状图使用 软 件，产 生 的 格 式 树 状 图 利 用 软件编辑。基因结构作图使用 软件（：）。染色压片与显微镜观察取第时期（见 样品采集和图的、）的 宁杞号 和 宁杞号 枸杞花蕾，卡诺固定液固定，小心剥出花药，参考刘晓瑞等 方法，在载玻片上用 水溶性苯胺蓝溶液（的 缓冲液配置）染色压片，荧光显微镜观察花药胼胝质的变化，并照相记录。结果与分析 基因的克隆与基因结构分析片段大小为 （图，），该片段与植物，葡聚糖酶（，）基因具有很高的一致性；片段为基因的 端，大小为 （图，），其中基因编码区 ，区 。片段、与 烟 草 的 基 因（注 册 号 ）一致性达到，根据 基因的 端设计含起始密码子 在内的 引物（表）进行 ，成功得到目的基因的 端片段，长度为 （图，）。以枸杞花蕾 和叶片 为模板进行 扩增，获得基因 全长 （图，），全长 （图，），提交 分别注册为 和 ，基因名称为（，）。基因结构作图显示，枸杞 基因 由个外显子（、）和个内含子（）组成（图），其中外显子较小，大小为 ，外显子较大，大小为 ，中间的内含子大小为 。基因的 剪切位点和剪切方式非常符合真核生物的 规律（图）。基因推导氨基酸比对分析根据基因碱基序列推导，枸杞 基因编码 个 氨 基 酸，（）查询结果显示，基因属于糖 基 水 解 酶第 家族（）蛋白，与其他植物，葡聚糖酶（，）基因具有很高的一致性（）。基于氨基酸序列的，葡聚糖酶基因矩形树状图结果显示（图），枸杞 基因（）与烟草 基因（）一致性最高（），聚为一支，聚类结果基本符合植物的传统划分。期李彦龙，等：枸杞胼胝质酶基因克隆及在雄性不育材料中的表达分析图枸杞 基因片段的 扩增以 宁杞号 花蕾 为模板的 基因片段、和全长的 电泳；以枸杞 为模板的 基因全长 电泳：宁杞号；宁杞号；分子量标准 ，；图 基因 结构 参与比对的 种植物的，葡聚糖酶基因当中，烟 草 基 因、水 稻 基 因、拟 南 芥 基因和甘蓝型油菜 基因都是在花药中表达且与胼胝质分解有关的功能基因（图，标记），枸杞 基因与这个基因的氨基酸序列一致性并不高，但却存在着个明显的相同区域（图，分 别 是 、和 区），片段的 引物就处在和区，这一结果提示个共同氨基酸区域似乎与植物花药发育或者胼胝质代谢有着密切关系。基因的半定量表达分析半定量 表达分析结果显示，并非组成性表达基因，在枸杞花蕾发育个时期中的第时期有最大表达，其他个时期未见明显表达（图，），表现出明显时序表达特征；在可育枸杞 宁杞号 与雄性不育枸杞 宁杞号 之间，基因表达出现明显差异，在 宁杞号 枸杞花蕾的第时期 基因高量表达，而在 宁杞号 枸杞花蕾中没有表达（图，、）。对雄性不育枸杞 基因的 测序结果表明，雄性不育枸杞的 基因与正常可育枸杞完全相同，没有发生基因突变，说明雄性不育枸杞中 基因的表达发生了沉默。图基于 氨基酸序列的，葡聚糖酶基因树状图花药表达基因；标尺表示遗传距离 ，；基因差异表达时期枸杞花药细胞的胼胝质荧光显微观察雄性不育枸杞胼胝质酶基因（）表达异常出现在花蕾发育的第时期（图，、），本研究对这一时期的花药细胞进行了胼胝质荧光染色试验。荧光显微观察结果显示，在这一时期，可育性枸杞和雄性不育枸杞小孢子母细胞外壁的胼胝质含量表现出明显差异（图）。此时可育枸杞 宁杞号 花药西北植物学报 卷图花药四分体胼胝质分解相关基因氨基酸序列多重比对 图枸杞胼胝质酶基因（）转录表达的半定量 分析可育枸杞 宁杞号；不育枸杞 宁杞号；枸杞花蕾个不同发育时期 ；荧光微弱，胼胝质含量明显较少，形态模糊，已经看不出四分体的基本轮廓（图，），而雄性不育枸杞 宁杞号 的花药四分体结构基本完整，形态清晰，中空的小孢子外围包裹着较厚的胼胝质（图，），图枸杞花蕾发育第时期的小孢子母细胞胼胝质壁染色图 可育枸杞 宁杞号；不育枸杞 宁杞号 ；期李彦龙，等：枸杞胼胝质酶基因克隆及在雄性不育材料中的表达分析可以看出 宁杞号 的花药四分体已经在分解，而雄性不育枸杞的花药四分体没有发生明显变化。由此表明，雄性不育枸杞花药在发育的第个时期四分体的胼胝质分解出现了问题。讨论本研究利用半定量 对所克隆的枸杞胼胝质酶基因（）进行了分析，结果显示，枸杞胼胝质酶基因非组成型表达基因，而是在花药发育的特定时期高量表达，这与矮牵牛（）的花药胼胝质酶活力测定结果相符合，矮牵牛花药在四分体小孢子释放至未成熟小孢子时期胼胝质酶活力最高，在四分体之前各个时期及成熟花粉粒时期检测不到胼胝质酶的酶活性。此外，检测结果表明，在四分体解体前夕，烟草花药中的 基因曾出 现 一 个 很 高 的 蛋 白 表 达 峰，。将 油 菜 基因的启动子融合 标签进行表达，也发现了与 基因相同的表达模式，随后迅速降低。、基因定位在绒毡层细胞中，绒毡层是合成和分泌胼胝质酶的主要细胞组织，因此绒毡层细胞的正常发育对于胼胝质酶基因的表达起着至关重要的作用，表达早了，四分体提早分解，这时的小孢子发育不成熟；表达延后了，小孢子则无法及时释放到药隔中继续发育形成成熟的单核花粉粒。因此，本研究结果提示枸杞 基因受花药内部环境机制的时序控制，雄性不育枸杞胼胝质酶基因没有按时表达导致四分体外壁胼胝质无法分解，是造成最终不育的一个重要原因。雄性不育枸杞胼胝质分解受阻这一生物学现象与水稻 基因 干扰抑制后的不育表型及细胞学特征十分相似。水稻 基因在水稻小花中表达量最多，尤其是减数分裂完成至小孢子形成这一时期的花药当中。利用 技术对 基因实施表达干扰，受到干扰的 植株结实率严重下降，花药发白发皱变形，几乎完全败育，植株花药的染色显微观察显示，四分体形成后细胞内出现胼胝质分解延迟的现象，这与雄性不育枸杞第时期的胼胝质荧光显微观察结果几乎相同。但也有研究报道，烟草 基因在 受到 干扰后并没有表现出不育的表型结果。雄性不育枸杞的胼胝质酶 基因在基因组即 水平上，与正常可育枸杞相比核苷酸序列完整无误，编码个外显子，中间夹个内含子，与可育枸杞 基因完全相同，既没有终止子突变也没有插入和缺失，基因功能区完好，说明雄性不育枸杞 的表达沉默可能与基因顺式元件或反式因子的调控有关，有研究报道拟南芥 转录因子和 转录因子的突变对花药 基因的表达有一定负调控作用 ，因此要揭示枸杞雄性不育机理还需要对胼胝质酶基因 的转录调控进一步深入研究。参考文献：（秦垦），（李云翔），（洪凤英）（宁夏农林科技），：（）（秦垦），（田英），（李云翔），（西北植物学报），（）：（）（田英），（李云翔），（秦垦），（西北植物学报），（）：（）（郝建华），（强胜）（植物生理学通讯），（）：（），（）：，（，），：，（）：，（）：，（）：西北植物学报 卷 ，（）（），（）：，（）：，（）：，（），（）：，（）：，（）：，（）：，（），（）：，精编分子生物学实验指南 颜子颖，王海森，译北京：科学出版社，：（刘晓瑞），（陈祖铿），（刘家熙）（植物学通报），（）：（），（）：，（）：（宋垚），（李晖），（石其龙），（）（上海师范大学学报自然科学版），（）：（）西北植物学报 年刊载论文基金项目统计与分析 西北植物学报 年第 期共发表论文 篇（含英文 篇），论文共获得 个各类研究基金项目的支持，平均每篇论文获基金项目达 个。有 篇论文均获得各类研究基金的支持，占刊载论文总数的 。其中，篇论文有项基金的支持，占论文总数的 ；篇论文有项基金的支持，占论文总数的 ；篇论文获项以上基金的支持，占论文总数的 。西北植物学报 年刊载论文的基金论文比为 。论文基金的具体来源统计结果如下：国家级基金：项，占基金项目总数的 。其中：国家自然科学基金 项，国家重点基础研究发展计划即国家“”基金 项，国家“”计划基金 项，国家“”基金 项，国家博士后基金项，国家其它项目基金 项。中国科学院基金：项，占基金项目总数的 。其中：知识创新工程基金项，西部之光基金项，其它基金 项。各部委基金：项，占基金项目总数的 。其中：科技部基金项，教育部基金 项，农业部基金 项，国家林业局基金 项，其它部委基金 项。中外合作基金：项，占基金项目总数的 大学基金：项，占基金项目总数的 省（市）各类研究基金：项，占基金项目总数的 （裴阿卫供稿）期李彦龙，等：枸杞胼胝质酶基因克隆及在雄性不育材料中的表达分析