参术胶囊调控脾虚胃癌转移鼠动物模型细胞外基质降解相.pdf

成都中医药大学硕士学位论文参术胶囊调控脾虚胃癌转移鼠动物模型细胞外基质降解相关基因表达的研究姓名：叶冰申请学位级别：硕士专业：方剂学指导教师：彭成20040401成都中医药大学硕士学位论文中文摘要目的：研究参术胶囊对脾虚胃癌转移鼠动物模型的细胞分化及细胞外基质降解相关基因表达的作用，探讨参术胶囊对脾虚胃癌转移的作用机理，从而拓展实验肿瘤学研究的新领域，为肿瘤的发生发展变化规律及抗癌中药复方作用机理的研究提供新思路。方法：取B A L B o-n u n u 小鼠，采用偏食法建立脾气虚证动物模型，用外科原位移植方法(S O I)将经传代(四代)培育后生长的S G C 7 9 0 1 胃癌组织块植入B A L B c-n u n u 小鼠胃浆膜下，建立脾虚胃癌转移鼠病证结合动物模型。采用腿染色及免疫组织化学的方法研究参术胶囊对脾虚胃癌转移鼠动物模型的细胞分化及细胞外基质降解相关基因汹舻2、M 卿9、T I M P I、T I M P 2、u P A 及P A l 1)表达的调控。结果：脾虚胃癌转移鼠动物模型稳定可靠，参术胶囊对胃癌细胞分化以及对细胞外基质降解相关基因(M M P 2、l 嘲网、T I M P I、T I M P 2、u P A 及P A I 1)的表达有明显调控作用。结论：用本文所述方法可复制出稳定的病证结合的脾虚胃癌转移鼠动物模型：参术胶囊能抑制脾虚胃癌转移鼠的肿瘤转移，其机制可能是诱导肿瘤细胞的重新分化及调节细胞外基质降解相关基因的表达。关键词：参术胶囊脾虚胃癌转移鼠动物模型细胞外基质基因成都中医药大学硕士学位论文A B S T R A C TO b j e c t i v e：R e s e a r c h i n gt h er e l e v a n tf u n c t i o n so ng e n ee x p r e s s i o na b o u tc e l l u l a rp o l a r i z a t i o na n d t h ed e g r a d a t i o no fe x t r a c e l l u l a rm a t r i x(E C M)u p o nS p l e e nD e f i c i e n c y S t o m a c hC a n c e rm e t a m o u s ea n i m a lm o d e lw i t hS h e n z h uc a p s u l e s W i t hi tt od i s c u s st h ef u n c t i o n a lm e c h a n i s mo fS h e n z h uc a p s u l et oS p l e e nD e f i c i e n c y S t o m a c hC a n c e rm e t a m o u s ea n i m a lm o d e l T h u sd e v e l o p i n gt h en e wf i e l do fe x p e r i m e n t a lo n c o l o g yr e s e a r c ha n dw a n t i n gt oo f f e rn e wr e s e a r c hc o n c e p t i o no ft h eo c c u r r e n c e，d e v e l o p m e n ta n dv a r i a t i o nf o rt u m o ra n dt h ef u n c t i o n a lm e c h a n i s mo fa n t i t u m o rC h i n e s eM e d i c i n ec o m p o u n dp r e s c r i p t i o n s M e t h o d s：E s t a b l i s h e dt h ea n i m a lm o d e lo fS p l e e n Q iD e f i c i e n c yw i t hf e e d i n ge x c e s s i v es o u r n e s si n 剖L 叫c-n u n um ic e o nt h eb a s iso ft h isf o u n d a t i o n，t r a n s p l a n tS G c 7 9 0 1s t o m a c hc a n c e rt i s s u eb l o c k sv i ec u lt i v a t i n ga f t e rf o u rg e n e r a t i o n su n d e rs t o m a c hc h o r i o no fB A L B c-n u n um i c ew i t hS O Ie s t a b l i s h e dS p l e e nD e f i c i e n c y s t o m a c hc a n c e rm e t a m o u s ea n i m a lm o d e l U s e d 脏a n dt h em e t h o do fi m m u n e t i s s u ec h e m i s t r ys t u d i e dt h er e g u l a t i o na n dc o n t r o l l i n go fr e l e v a n t l yg e n e t i ce x p r e s s e s(m 口2、加旧9、T I 肝l、T I 肝2、u P A 及P A I 1)o fS h e n z h uc a p s u l e st oc e I i 黼藿Fp o l a r i z a t i o na n dt h ed e g r a d a t i o no fE 例o fS p l e e nd e f i c i e n c y S t o m a c hC a n c e rm e t a m o u s ea n i m a lm o d e l s R e s u l t s：S p I e e nD e f i c i e n c y S t o m a c hC a n c e rm e t a m o u s ea n i m a lm o d e lw a ss u c c e s s f u l l ye s t a b l i s h e d S h a n z h uc a p s u l ec o u l dp r o h i b i tc a n c e rc e l lp o l a r i z a t i o na n da d j u s tt h ed e g r a d a t i o no fE c Io at h ec h a n g eo fr e l e v a n t l yg e n e t i ce x p r e s s(M M P 2、M M P 9、T I M P l、T I M P 2、u P A 及P A I-I)C o n c l u s i o n s：T h eS p l e e nD e f i c i e n c y S t o m a c hC a n c e rm e t a m o u s ea n i m a lm o d e lc a nb ed u p li c a t e db yu s i n gt h em e t h o d st h a th a sb e e nd e s c r i b e di nt h ec o n t e x t：S h e n z h uc a p s u l ec a r lp r o h i b i tt h ek n u b b l yt r a n s p l a n t a t i o no fS p l e a nD e f i c i e n c y S t o m a c hC a n c e rm e t a m o u s e a n di t sm e c h a n i s mm a y b ei n d u c tt h er e-p o l a r i z a t i o no ft u m o rc e l la n da d j u s tt h er e l e v a n t l yg e n e t i ce x p r e s s e so ft h ed e g r a d a t i o no fE C M K e yW o r d s：S h e n z h uC a p s u l e，S p l e e nD e f i c i e n c y，S t o m a c hC a n c e r，M e t a m o u s e，A n i m a lM o d e l，E x t r a-c e l l u l a rM a t r i x，G e n e2成都中医药大学硕士学位论文引言癌症是影响人类健康的重大疾病，而胃癌是常见的恶性肿瘤。全世晃死于癌症的6 3 0 万人中，7 7 6 万为胃癌，仅次于肺癌，占第2 位。在我国，胃癌为农村癌症发病率之首，城市仅次于肺癌位居第2。面对这一严峻的现实，使得肿瘤工作者更积极地探索多学科综合治疗，特别是中西医结合治疗I l J。胃癌的发病机理至今未明，目前认为可能与饮食、环境因素、以及幽门螺旋杆菌感染的因素有关口】。其临床表现在早期一般为消瘦、食欲不振、上腹不适、腹泻、乏力等症状，到了中晚期则发展为呕血和黑便等症状，同时以出现腹部肿块或转移灶的症状为主。纵观胃癌的症状，无不包含着正虚邪实两个方面，所以中医认为胃癌之生系饮食失节，忧思过度，脾胃受损，运化失常，气滞痰凝，气、痰、瘀、毒至结而成。即脾胃虚弱导致胃癌的形成，而胃癌的发生发展又加重了脾虚症状。导师彭成研究员通过大量的理论分析与实验研究得出“脾虚是胃癌发生和转移的内在因素”这一论点。目前脾虚与胃癌的关系已得到广大学者的认同，根据中医理论及治疗原则，稿床对于脾虚胃癌的病证多从调理脾胃入手，在治则治法上采用益气健脾，扶正培本之法，具体方药上多用具有益气健脾作用的参术膏、四君子汤、参苓白术散等复方取得较好的治疗效果。其中，参术膏(现为参术胶囊)是最基本的代表方剂。但未见中药复方治疗脾虚胃癌的作用机理研究，。未见中药复方调控脾虚胃癌基因表达的研究。要进行中药复方作用机理的研究，就必须复制相对稳定的动物模型3 H 引。脾虚证动物模型目前有以下几种类型 9 1：泻下法、偏食法、饮食失节法、综合法、现代医学的病理模型。胃癌动物模型主要有以下三类：一是早期的以黄曲霉素【1 0】和甲基胆蒽(3-M C)【】为代表的碳氢化含物，以及现在广泛使用的以2 一乙基亚硝胺(D E N A)l 引，N _ 甲基硝基亚硝基胍(M N N G)1 3 q 4 1 为代表的亚硝基化合物等的单因素或多因素联合攻击化学诱癌法【”。6 1 建立的胃癌及胃癌癌前病变模型；二是同种或异种胃癌的非原位移植法和原位移植法等移植性胃癌模型；三是胃癌转移模型，包括自发性转移和实验性转移1 刀模型。但未见脾虚胃癌转移鼠动物模。1成都中医药大学硕士学位论文型的研究报道。现代分子生物学研究表明，人类基因的表达决定了机体整个生命过程，基因表达的变化处于控制生物学调节机制的中心位置。中医认为由脾虚发展到胃癌需要一个漫长而复杂的阶段，而在这一过程中除了我们宏观上观察到的能反映脾虚证的消瘦、食欲不振、上腹不适、腹泻、乏力等症状，以及到了中晚期的呕血、黑便、出现腹部肿块或转移灶的症状外，一定也有基因水平的变化，如目前经常检测的癌基因m e t、E G F R、e r b B 2、r a s 及a k t 2 等基因，抑癌基因有p 5 3、p 1 6、R b、A P C 和n m 2 3 等基因，其中m e t 和r i t$基因的过量表达发生在癌变早期，m e t、E G F R、e r b B 一2 及a k t-2 基因扩增与肿瘤的快速生长有关，n m 2 3 和p 1 6 基因缺失或表达水平降低与瘤细胞恶性表型密切相关，b c l。2 基因可以抑制细胞凋亡，B a x基因则促进细胞凋亡，野生性p 5 3 可促进细胞凋亡，突变型p 5 3 可抑制野生型p 5 3，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。特别是在肿瘤的侵润、转移中，肿瘤细胞要穿越组织自然屏障向身体各韶位移动，则需产生或诱导产生蛋白酶类以降解细胞外基质。因此与细胞外基质降解相关的一些基因(M M P 2、l I M P 9、T I M P l、T I M P 2、u P A及P A I-1)成为了肿瘤研究的一大热点。但未见中药复方调控胃癌细胞外基质降解相关基因表达的研究报道。因此，本课题的目的就是在建立脾虚胃癌转移鼠动物模型研究的基础上，探索参术胶囊对脾虚胃癌转移鼠的癌细胞分化以及细胞外基质降解相关基因表达的调控作用，以期从细胞、基因水平上揭示中药用于肿瘤治疗的作用机理，开辟中医药抗肿瘤转移研究的新领域。4成都中医药大学硕士学位论文实验研究参照导师彭成的偏食脾虚造模法“1 和H o f f m n n 的S O I 转移鼠造模法“8 1 建立脾虚胃癌转移鼠动物模型。通过一般状态观察、病理切片、侵润转移相关基因等研究参术胶囊对脾虚胃癌转移鼠的作用机理。1 实验材料1 1 实验动物B A L B c n u n u 裸鼠1 0 8 只，S P F 动物，雌雄均有，8 周龄。由成都中医药大学实验动物研究中心提供。生产许可证号；第0 4 1 2 号，检疫后备用。1 2 造模瘤源人胃癌细胞株S G C 一7 9 0 1 悬液(3 1 0 6)由华西肿瘤研究所提供。1 3 实验药物山西白醋，由山西老陈醋集团有限公司生产，酸度3 5 9 l O O m l，标准代号G B l 8 1 8 7 2 0 0 0 液态发酵。5 一氟尿嘧啶，规格：0 2 5 9 l O m l，由天津金耀氨基酸有限公司生产，批号0 3 0 7 0 1 2，配制：1 2 m 1 5-F u 加无菌水至l O O m l(1 0 0 m 1：3 0 0 m g)。胃复春胶囊，规格：0 3 7 9 片，由杭州胡庆余堂药业有限公司生产，批号0 3 0 7 1 7，配制：2 9 片(1 0 7 3 9)碾为细末加无菌水溶解为7 2 5 m l。参术胶囊，由成都中医药大学药学院提供，淡黄色颗粒，每克提取物含l O g原生药，批号2 0 0 1 0 9 0 1，配制：低剂量为3 3 9 加无菌水溶解为l O O m l：中剂量为6 6 9 加无菌水溶解为l O O m l；高剂量为1 3 2 9 加无菌水溶解为l O O m l。1 4 实验试剂T I M P I(H 一1 5 0)，r a b b i tp o l y c l o n a lI g G，购自S a n t aC r u z 公司。T I M P 2(I -1 4 0)，r a b b i tp o l y e l o n a lI g G，购自S a n t aC r u z 公司。成都中医药大学硕士学位论文M m P 2(C-1 9)，g o a tp o l y c l o n a I g G，购自S a n t aC r u Z 公司。u P A(M 一2 0)，g o a tp o l y c l o n a lI g G，购自S a n t aC r u z 公司。P A I 一1(H-1 3 5)，r a b b i tp o l y c l o n a lI g G，购自S a n t aC r u z 公司。M M P 9，r a b b i ta n t il i 穗I P-9(A b l)，B A 0 5 7 3，购自武汉博士德生物手投术有限公司。相应二抗及试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。1 5 仪器设备C B 3 2 0 1 数字描记式小动物活动观测仪中国J|I 北电子工业公司电子天平P A 2 0 0 3上海天平仪器厂O l y m p u sB X 5 0 光学显微镜日本M I A S-2 0 0 0 型图像分析系统四川大学图像图形研究所1 6 实验设施S P F(s p e c i f i cp a t h o g e nf r e ec o n d m o l l)实验动物屏障系统，由成都中医药大学实验动物研究中心提供，实验动物设施环境符合S P F 级标准，使用许可证号：第0 4-0 5 0 号。2 实验方法2 1 脾虚胃癌转移鼠动物模型的建立及分组处理取B A L B c-n u n u 裸鼠1 0 8 只。实验第ld 将S G C 7 9 0 1 悬液接种于2 只裸鼠腋下(O 2 n：l l R)，培育胃癌组织块，待胃癌组织块长成l c m X1 c m 大后将此胃癌组织块传代培育至实体瘤，本次实验传至第四代时待其长成l c m X i c m 大备用(8 周)。其余自由摄食无菌全价颗粒饲料，第9 周开始将其余1 0 0 只裸鼠造脾虚证动物模型，实验前禁食3 6h 后，首次灌胃以山西白醋按1 5 m l k g d，以后按1 0 m l k g d 灌胃6d；第l O 周时，在严格无菌操作条件下进行手术造胃癌转移动物模型，即在手术第1 天用戊巴比妥钠4 0 m g k g 腹腔麻醉下，手术视野皮肤消毒，并在裸鼠剑6成都中医药大学硕士学位论文突下开0,7 c m 1 c m 长纵向切口，找到胃，在腺胃处切开浆膜并用荷包缝合法缝入 1 9 1 前述传至第四代的胃癌组织块01 0 1 c m 后，关闭腹腔。实验过程在S P F 动物实验室内进行，术后将此1 0 0 只裸鼠随机分为6 组，即脾虚胃癌模型组1 7 只，西药对照组1 6 只，中药对照组1 6 只，参术胶囊低剂量组1 7 只，参术胶囊中剂量组1 7 只，参术胶囊高剂量组1 7 只，手术第2 天开始除脾虚胃癌模型组自由饮用无菌水外，西药组灌胃给予5 氟尿嘧啶3 0 m g k g d 2，中药对照组灌胃给予胃复春14 8 9 k g d，参术胶囊低剂量组灌胃给予参术胶囊药液3 3 0 m g k g d，参术胶囊中剂量组灌胃给予参术胶囊药液6 6 0 m g k g d，参术胶囊高弃 量组灌胃给予参术胶囊药液1 3 2 0 m g k g d，除模型组外均按此法治疗2 l 天(3 周)，到术后第2 3 d 脱颈椎处死，处死前禁食2 4 小时，取出胃，沿胃大弯侧级向削开，用生理盐水洗净食物残渣后，将胃组织用1 0 的中性福尔马林液固定待测。实验中每周电子天平称一次体重、小动物活动观测仪测定l o 分钟内的自发活动、电子天平称2 4h 动物的摄食量，观察大便性状、腹形及体表的其他表现。2 2 病理组织学染色步骤及胃癌细胞的形态观察将前述胃组织1 0 中性福尔马林液固定4 8 小时，逐级酒精脱水，二甲苯透明、浸腊，石蜡包埋，常规切片4 u r n，髓染色每个标本在1 0)(4 0 高倍镜下，随机观察2 0个癌细胞核形态，并在M I A S-2 0 0 0 型图像分析系统下测量细胞核及相应核仁的面积(截面的面积等于落在截面内的像素点计数乘以每个测试像素点所代表的测试面积(a=d 2 k。P c)、周长(指围绕被测试物体周边的长度)、最大直径、最小直径(平面图形的卡规直径是指正切该图形的两条平行线之闯的距离，它可用最大直径、最小直径和平均卡规直径来描述)及形状因子(一般指二维形状因子，综合反映二维形态结构的变化，无量纲参数(即无单位)，当被测物体为园时，形状因子等于1，当物体不规则或呈椭圆时，形状因子小于l，反映被测物体截面的不规则程度)5 种形态参数“。7成都中医药大学硕士学位论文2 3 胃癌侵润、转移相关基因表达的裣测免疫组织化学染色步骤(s P 法)：。6。1 采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素混合液来测定细胞和组织中的待测抗原。染色的主要过程如下：1 石蜡切片脱蜡至水，用P B S 液(O O l m o l LP H 7 4)冲洗3 次5 m i n 2 3 H 2 仉室温孵育l O 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育1 0m i n 3 蒸馏水冲洗，P B S 浸泡5 分钟。4 1 0 的正常山羊血清(P B S 稀释)封闭，室温孵育l O 分钟。倾去血清，勿洗，滴加I：1 0 0 比例稀释的一抗，3 7 C 孵育1 小时。5 P B S 冲洗，5 分钟X 3 次。6 滴加第二代生物索标记二抗工作液，3 7 c 或室温孵育3 0 分钟。7 P B S 冲洗，5 分钟3 次。8 滴加第二代辣根酶标记链霉卵自素工作液，3 7 C 孵育3 0 分钟。9 P B S 冲洗，5 分钟3 次。1 0。D A B 显色。1 1 自来水充分冲洗，苏木精复染，封片。阳性结果判定：M M P 2、1 6 1 P 9、T I M P I、T I M P 2、u P A 及P A I 一1 阳性物质棕褐色至淡黄色啪1，呈细丝状或者细颗粒状，瑚腰2、M M P 9、T I M P I、T I M P 2 主要表达部位在肿瘤细胞胞浆，部分表达在肿瘤间质细胞(包括血管内皮细胞)胞浆及基质；u P A 及P A I-I 表达部位主要在血管内皮细胞胞浆，部分在肿瘤细胞胞浆及基质。l 胁L 0 2、脚9、T I M P I、T I M P 2、u P A 及P A I l 基因表达的检测：首先将S P 法染色切片在1 0 Xi 0 低倍视野下进行全面观察，寻找肿瘤内M M P 2、M M P 9、T I M P I、T I M P 2、u P 及P A I l 阳性物质最丰富区域(即“热点”区，染色颜色最深伴或者染色面积最多)，然后在1 0 X 2 0 中倍视野下选择2 0 个热点区，采用M I A S-2 0 0 0 型图像分析系统测量各个指标阳性物质的面积、平均光密度、积分光密度、平均黑度，成都中医药大学硕士学位论文表示它们的含量。统计学处理：所有计量资料以均数标准差表示(彳鲫)，采用S P S S l l 0统计软件包处理，组间比较用L S D(方差齐)和s N 或T a m h a n e(方差不齐)，3 实验结果3 1 脾虚表现用山西白醋灌胃6d 后，实验裸鼠的一般情况都发生了变化。摄食量、自发活动减少，体重下降，腹部胀大、大便变溏或呈小干颗粒状，与造脾虚模型前有极显著差异。(见表1、袭2)表1造脾虚模型前后裸鼠摄食量、自发活动、体重的变化(Z S D)注：与造模前比较：-p 0 0 1表2 造脾虚模型前后裸鼠大便、腹形的变化注：与造模前比较：-p 0 0 13 2 病理组织学观察f i E 染色切片下观察脾虚胃癌模型组癌组织结构紊乱，呈浸润性生长，与周围组织分界不清，癌细胞中等偏大，呈圆形、椭圆形、多边形及不规则形，胞浆较9成都中医药大学硕士学位论文少，核染色较深，呈椭圆形、三角形及不规则形，多数呈空泡状，核分裂像较多，核仁粗大，位于核中央或偏位，多数具有个核仁，少数有两个或者以上，染色深。5 个治疗组癌细胞大小与模型组相似，但形状以圆形、椭圆形居多，多边形及不规则形减少，尤其是核的面积减小、形状明显变得规则、核仁数目和面积均较模型组减少。在核面积上，西药组有显著性差异，其余4 个组差异无显著性；核周长和核最大直径较模型组减小，西药组和参术高剂量组有显著性差异，其余3 组差异无显著性；核最小直径较模型组减小，但均无显著性差异：代表核形状的核形状因子较模型组增大，其中西药组和中药对照组有显著性差异，参术低、中、高剂量组有极显著性差异：核仨面积、核仁与核面积之比较模型组减小，且5 个治疗组均有极显著性差异；核仁形状因子较模型组增大，除参术高剂量组有显著性差异外，其余各组均差异无显著性。结果详见表3、表4、图l 6。实验过程中共死亡2 8 只动物，其中在食醋灌胃及手术双重打击下有1 5 只动物死亡，后在灌胃治疗中又死亡1 3 只，特别是西药组由于5 f I l 的副作用大，动物消瘦死亡多达7 只，尸检无特殊。表3B A L B c-n u n u 裸小鼠胃癌组织内癌细胞核仁形态变化(膏S D)注；与脾虚胃癌模型组比较：00 5。P 0 0 1。1 0成都中医药大学硕士学位论文表4B A L B c-n u n U 裸小鼠胃癌组织内癌细胞核形态变化(g+s o)蝈剐动物药糖攘面积挂胀拄最大直径接最小直径投形状因子砸”(只)t k)(u r)蚺)f 蛐)删)一H-_ _ _ 一簋鸯翱睥虚胃癌组1 3一9 7 7，3 6 士1 9 7 2 01 1 7 5 5+1 1 9 64 32 2 4-4 5 22 6 6 5+3 0 60 8 6 9 4 0+0 3 0西药对照组t l0 0 37 4 0 4 5 j：2 1 2,9 1 t 0 0 5 3 1 5 7 3 7 士5 I F2 4-0 9：i：4 n0 盼6 O 0 1 9中药对照组1 31 4 09 1 7 9 5+1 8 0 O l1 1 2 5 6+9 9 94 1 1 7+3 6 62 6 3 3+2 7 708 9 5 士0 0 1 9参术 臣刺量1 20 3 39 4 4 3 2+2 5 4 1 5I t 2 9 0：1：1 4 7 54 0 3 0+5 6 52 7 4 0 3 3 1o 9 0 6 0 0 1 9。参术中剂量l O0 6 68 2 5 3 3+1 0 5 昭1 0 6 5 5+7 0 33 9 2 3 士3 2 92 5 4 4：1 7 70，9 0 5+0 0 3 2”参术高荆量1 31 3 28 1 4 8 2 1 4 9 0 21 0 5 1 1+9 0 7 3 83 7+2 8 2 2 5 7 士3 3 00 9 1 3 0 0 2 0“注l 与脾虚1 1 1 癌模型组比较：0 0 5，0 0 1 3 3 胃癌侵润、转移相关基因的表达3 3 1T I M P l 基因的表达T I M P l 基因在参术胶囊低中高三剂量组的表达较脾虚胃癌模型组、西药对照组及中药对照组有所增强，但差异无显著性。结果详见表5、图7 1 2。表5B A L B c-n u n u 裸小鼠胃癌组织细胞内T I M P I 含量变化(f 锄成都中医药大学硕士学位论文3 3 2T I M P 2 基因的表达T I M P 2 基因在五个治疗组的表达均较脾虚胃癌模型组增强，其中胃复春组、参术胶囊高、中、低剂量组与脾虚胃癌组比较有显著性0 0 0 5)或极显著性差异(p 0 0 1)。结果详见表6、图1 3 1 8。表6B A L B C-f l U I l L l 裸小鼠胃癌组织细胞内T I M P 2 含量的比较(j S D)注：与脾虚癌模型组比较；0 0 5，p 0 0 1 3 3 3M M P 2 基因的表达 n 俨2 基因在五个治疗组中的表达均较脾虚胃癌模型组减弱，其中中药对照组、参术胶囊中剂量组与高剂量组较脾虚胃癌模型组有极显著性差异0 0 0 1)，参术胶囊低剂量组较脾虚胃癌模型组有显著性差异如 0 0 5)，而西药组较脾虚胃癌模型组差异无显著性。结果详见表7、图1 9 2 4。成都中医药大学硕士学位论文胂虚胃癌组1 3等窑积竞蕾水3 4 3 2 2 91 6 3 士1 0 066 3 3 9 3西药对腻组1 1中药对照组1 3参朱低荆量1 2参术中剂量l OO 0 31 4 80 3 32 7 5 0 9 7L 鸲37 15 0 3 2 2 21 2 72 6 I I _ 2 Il _ l B 士0 6 7i6 7 O 7 0t，2 0 士07 324 6 L3 6 i 2 3 韩9 0 92 34 2 1 0 2 71 4 5 0 1 0 8 4 0 02 8 2+1 2 9 1 2 9 1 5+7 0 1 参木尚剂量1 31 3 21 0 2+O 5 96 7 8+O 4 3 L9 7 1 1 7 1 2 9 5 9 土8 3 2*3 3 4M M P 9 基因的表达M g P 9 基因在西药对照组中的表达较脾虚胃癌模型组有一定增强，但差异无显著性；在中药对照组、参术胶囊低中高三剂量组的表达较脾虚胃癌模型组减弱，且参术胶囊高剂量组较脾虚胃癌模型组有显著性差异0 0 0 5)。结果详见表8、图2 5 3 0。表8B A L B c-n u n u 裸小鼠胃癌组织细胞内M M P 9 含量的比较(只s 蛆剽：只?。竺，。=，平麓1 0 瓮：度蝴度只)|k I)(x l o u I)(。)c l n一脾虚癌组1 3尊容积无一水5 2 3 士4 3 40 8 6 土O 4 68 3 3：7 6 51 2 32 3 土41 7西药对照组I i0,0 36 9 士3 0 01 6 7+0 t 9 9 0 3 土53 51 2 2 4 1 士3 4 8中药对照龃1 31 柏参术低剂量1 20,3 3参术中拊量I On 晰1 6 8 1 0 70 9 3+0 4 93 3 9 土2 0 21 2 0 7 5 2 4 52 8 0-1 1 3L 1 1+0 3 85 3 5 士2 1 51 2 15 4 8 5 02 2 5 +1 髓1，t 5 土0 5 94 4 9 士4 2 91 1 86 I 9 0 5参术高剂量1 31 3 20 7 4 O 4 60 5 9 _+0 3 31 _ 6 2 0 9 5 1 2 64 5+_ 1 3B 8西面丽丽两面丽i 而面i 鬲而一成都中医药大学硕士学位论文3 3 5u P A 基因的表达u P A 基因在五个治疗组的表达均较脾虚胃癌模型组减弱，且参术胶囊中剂量组较脾虚胃癌模型组有显著性差异0(0 0 5)，参术胶囊高剂量组较脾虚胃癌模型组有极显著性差异0 0 0 1)。结果详见表9、图3 1-3 6。表9B A L B c n u n u 裸小鼠胃癌组织细胞内u P A 含量的比较(f 劝)注I 与脾虚胃癌模型组比较。c0 0 5，0 0 1 3 3 6P A I 1 基因的表达P A I 一1 基因在五个治疗组的表达均较脾虚胃癌模型组增强，其中中药对照组、参术胶囊低中高三剂量组较脾虚胃癌模型组有显著性差异(P(0 0 5)，西药对照组较脾虚胃癌模型组差异无显著性。结果详见表1 0、图3 7 4 2。1 4些塑!垦垫查堂堡主堂垡堡苎表1 0B A L B c-n u n u 裸小鼠胃癌组织细胞内P A I-I 含量的比较(彳黝)动物组别(只)药物面积平均光密度积分光密度(以g)(l o|，)川)(x l o，$冁履脾虚癌组1 3等容积无曹木t 2 3 0 5 80 9 4 士0 4 42 6 3 土t 2 8 2 3，6 6 6 4 0西药对照蛆1 lO 0 31 8 9 士1 1 01 2 2 士O 8 237 9 士2 4 21 2 6 2 3 9 4 5中药对照组1 3参术低剂量1 2参术中剂量1 0l4 82 7 7+L2 2+1 0 9 O 3 44 8 3 2：L8 5*L 2 9 0 7+1 0 9 40 _ 3 3o 6 6l-6 0 O 5 15 0 9 土1 3 6*1 2 6 2 5 士6 1 42 6 t-t 2 t 2 0 0 6 04 7 3 2 4 6*1 2 8 O l 1 0 7 6参术商舸量1 31 3 22 9 6 士I 3 0 1 0 2 士O 1 34 8 7-4-1 7 8 1 3 18 1 土4 5 4成都中医药大学硕士学位论文讨论1 脾虚是胃癌发生和转移的内在因素中医认为，脾位居中焦，与胃相表里，脾的主要生理功能是主运化水谷、水湿，输布精微而藏营，为气血生化之源，故有后天之本之称。“。脾虚则生化乏源，气血亏虚，临床上可出现形体消瘦，倦怠乏力，纳呆食少，大便不调，腹胀腹痛等症状。胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，其病因在西医中至今未明，目前考虑与饮食和环境因素以及幽门螺杆菌感染有关，而中医则将胃癌归属“反胃”、“噎嗝”、“积聚”以及“胃脘痛”等范畴“1，其病因病机中医多认为属忧思恼怒日久，情志不遂，或饮食不节，导致肝失疏泄，胃失和降：或久病损伤脾胃，运化失职，痰凝气滞。热毒血瘀，交结于胃，积聚成块而发病，即脾胃虚弱是胃癌发生的前提。癌肿形成之后，由于局部气血不畅，很容易损伤脾胃受纳、运化功能，故而又加重脾虚气弱，生化乏源。无力抗邪，邪毒乘而侮之，五脏病邪相互传变，复消耗气血，正气因之愈虚，而邪气因之愈盛，如此恶性循环，在临床上就表现为转移、恶病质及全身衰竭甚至死亡。故脾虚又是胃癌转移的诱导因素。古代医家对脾胃虚弱与胃癌发生和转移的关系的论述也颇多。奇效良方谓；“夫反胃者，本乎胃。多因，饮酒过伤，或积风寒，或忧思悒快，或因蓄怒抑郁，宿滞痼癣，积聚冷痰，动扰脾胃，胃弱不能消磨谷食，遂成此症。”脾为后天之本，气血生化之源。胃癌患者素来饮食不馨，腹胀腹泻，或完谷不化，脾胃损伤则正气虚弱，以致卫外之气无处以生，邪毒内侵，蓄结不除，导致癌瘤产生。李东垣在脾胃论中说：“盖胃为水谷之海，饮食入胃，丽精气先输脾归肺，上行春夏之令，以滋养周身，乃清气为天者也；升已而下输膀胱，行秋冬之令，为传化糟粕，转味而出，及浊阴为地者也。”李东垣以一年之气的升降，春夏地气升浮而生长，秋冬天气沉降而杀藏，惟长夏土气居中央，为浮沉变化的枢纽，由此认为人身精气的升降运动，亦赖脾胃居于其中为枢纽。若脾胃伤，则当升者不升，当降者不降，疾病随之而生。内经也云：“邪之所凑，其气必虚。”东汉张仲景在金匮要略1 6成都中医药大学硕士学位论文中载日：“脉弦者虚也，胃气无余，朝食暮吐，变为胃反。”以上论述无不强调脾胃虚弱的发病机制，同时脾虚不仅是胃癌发生的根本原因，而且也是胃癌发展与变化的关键。随着中医理论结合现代医学研究手段的发展，越来越多的学者从临床与实验的研究中提出了脾虚与胃癌发生发展相关的观点。邱佳信教授0 2 1 等在临床和实验研究中提出了“消化道恶性肿瘤邪实是客观存在，而脾虚则贯穿疾病的始终，治瘤应从健脾着手”的基本观点。余桂清等n 1 1 也在临床与实验的研究中得出脾虚导致的痰湿、气滞、血瘀、毒邪是胃癌形成的原因之一。赵爱光等。3 1 则主要从医学统计学角度对脾虚与胃癌形成的关系作了半定量分析，其结果在一定程度上证明中医基础理论对胃癌病因病机认识的正确性和科学性。尹光耀等。o 对脾虚证胃病患者的胃粘膜上皮细胞线粒体的超微结构、微量元素、胃粘膜肠化亚型、环磷酸腺苷(c A M P)，超氧化物歧化酶(S O D)与血清过氧化脂质(L P O)水平进行检测，发现线粒体退变及相关因素量变与脾虚证的转归、肠化生、胃的癌变有互为因果的内在联系，前者是后者产生的病理生理学基础3。沈克平等人啪3 对胃癌及其相关病变患者脾虚症状的半定量分析，发现脾虚与胃癌发生发展各阶段病变之间呈等级正相关，并且在研究中观察到早期和进展期胃癌组脾虚症状表现较重尤其是进展期胃癌组，提示脾虚在胃癌形成和转移过程中可能起至关重要的作用，这与不少学者的观察结果是一致的。还有采用反映小肠吸收功能的卜木糖吸收实验，检测脾虚肿瘤患者消化吸收功能变化，发现脾虚肿瘤患者小肠吸收功能明显低于正常人，亦有学者对脾虚肿瘤患者进行某些消化激素的检测，发现这类患者血清胃泌素、胰功肽含量均低于正常人3，这些研究结果均表明脾虚证肿瘤患者消化吸收功能和消化激素含量的改变，也进一步说明脾胃虚弱与消化道肿瘤关系密切。在导师彭成研究员多年的实验研究中也得出“脾虚是胃癌发生和转移的内在因素”之理论，同时在这一理论的直接指导下，师兄林代华在实验中成功地复制出稳定的病证结合的脾虚胃癌动物模型，这一模型同时具有脾虚的主要症状和胃癌的病理及基因的改变，从而从实验的角度证明了脾虚在胃癌的发生、发展过1 7成都中医药大学硕士学位论文程中有着重要作用，