生物技术与人类生活(6)--蛋白质工程.ppt

8-02 8-02 蛋白质工程蛋白质工程学习目的学习目的 初步了解蛋白质结构，以及蛋白质分子初步了解蛋白质结构，以及蛋白质分子设计和蛋白质修饰和表达等的基本原理。设计和蛋白质修饰和表达等的基本原理。了解如何利用蛋白质工程技术和其他相关了解如何利用蛋白质工程技术和其他相关技术获得更加符合人类需求且比天然蛋白技术获得更加符合人类需求且比天然蛋白质更优良的蛋白质。质更优良的蛋白质。8-02 8-02 蛋白质工程蛋白质工程8-02.1 8-02.1 蛋白质结构基础蛋白质结构基础8-02.1.1 8-02.1.1 蛋白质结构的基本构件蛋白质结构的基本构件 蛋白质、核酸蛋白质、核酸 、多糖和脂类等生物大分子的结构、多糖和脂类等生物大分子的结构与功能。与功能。蛋白质工程8-02.1.1 8-02.1.1 蛋白质结构的基本构建蛋白质结构的基本构建8-02.1.1.18-02.1.1.1蛋白质的化学组成蛋白质的化学组成基本元素基本元素:有机元素有机元素:碳、氢、氧和氮碳、氢、氧和氮 无机元素无机元素:碱金属、碱土金属碱金属、碱土金属 和重金属和重金属 蛋白质蛋白质:、胨、肽、胨、肽氨基酸分类氨基酸分类:非极性非极性R R基氨基酸基氨基酸、不带电荷的不带电荷的 极性极性R R基氨基酸基氨基酸 、带正电荷的带正电荷的R R 基氨基酸基氨基酸 、带负电荷的带负电荷的R R基酸性氨基酸性氨 基酸基酸 蛋白质工程8-02.1.1 8-02.1.1 蛋白质结构的基本构建蛋白质结构的基本构建8-02.1.1.2 氨基酸的物理性质氨基酸的物理性质 无色结晶无色结晶 特殊晶型特殊晶型 溶点极高溶点极高 两性离子形式存在两性离子形式存在 氨基和羧基氨基和羧基 接受质子和释放质子接受质子和释放质子 两性电解质两性电解质蛋白质工程 8-02.1.1.3 8-02.1.1.3 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构 各种氨基酸的简写符号各种氨基酸的简写符号 名称 三字母符号 单字母符号 名称 三字母符号 单字母符号 丙氨酸 Ala A 异亮氨酸 Ile I 精氨酸 Arg R 亮氨酸 Leu L天冬酰胺 Asn N 赖氨酸 Lys K天冬氨酸 Asp D 蛋氨酸 Met MAsn或Asp Asx B 苯丙氨酸 Phe F 半胱氨酸 Cys C 脯氨酸 Pro P 谷氨酰胺 Gln Q 丝氨酸 Ser S 谷氨酸 Glu E 苏氨酸 Thr T Gln或Glu Glx Z 色氨酸 Trp W 甘氨酸 Gly G 酪氨酸 Tyr Y 组氨酸 His H 缬氨酸 Val V8-02.1.1 8-02.1.1 蛋白质结构的基本构建蛋白质结构的基本构建蛋白质工程8-02.1.1.3 8-02.1.1.3 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构多肽链多肽链:由许多氨基酸按一定的排列顺序通由许多氨基酸按一定的排列顺序通 过肽键相连而成。过肽键相连而成。酰胺键酰胺键 :一个氨基酸的氨基与另一氨基酸的一个氨基酸的氨基与另一氨基酸的 羧基缩合失去一分子水。羧基缩合失去一分子水。肽键结构肽键结构 蛋白质工程8-02.1.1.3 8-02.1.1.3 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构 X Y Z 人人 Thr Thr Ile 猪猪 Ala Thr Ile 牛牛 Ala Ala Val 图图6-2 猪、牛和人的胰岛素的一级结构猪、牛和人的胰岛素的一级结构蛋白质工程8-02.1 8-02.1 蛋白质结构基础蛋白质结构基础6-02.1.2 6-02.1.2 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构u分子结构分子结构:一级结构、二级结构、三级结构一级结构、二级结构、三级结构 和四级结构。和四级结构。u分子构象分子构象:空间结构、高级结构、立体结构、空间结构、高级结构、立体结构、三维结构。三维结构。u二级结构二级结构:指多肽链主链骨架中的若干肽段，各指多肽链主链骨架中的若干肽段，各 自沿着某个轴盘旋或折叠，并以氢键自沿着某个轴盘旋或折叠，并以氢键 维系，从而形成有规则的构象。维系，从而形成有规则的构象。螺旋、螺旋、折叠和折叠和转角转角蛋白质工程8-02.1.2 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构 螺旋结构螺旋结构 折叠结构折叠结构 蛋白质工程8-02.1.2 8-02.1.2 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构u三级结构三级结构:在三维空间中沿着多方向进行卷在三维空间中沿着多方向进行卷 曲、折叠、盘绕而成的近似球形的曲、折叠、盘绕而成的近似球形的 结构。结构。u蛋白质构象作用力蛋白质构象作用力:R R基之间的氢键基之间的氢键 非极性非极性R R基之间的疏水基相互作用基之间的疏水基相互作用螺旋和螺旋和折叠中的肽链内或肽链间的氢键折叠中的肽链内或肽链间的氢键带正负电荷的带正负电荷的R R基之间的离子键基之间的离子键 蛋白质工程8-02.1.2 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构u亚基亚基 (三级结构三级结构)一条多肽链组成。一条多肽链组成。数条多肽链组成，这些多肽链通常以数条多肽链组成，这些多肽链通常以二硫键相连接成为亚基。二硫键相连接成为亚基。u四级结构四级结构 亚基聚合而成亚基聚合而成 亚基之间亚基之间非共价键结合非共价键结合 均一四级结构均一四级结构 非均一四级结构非均一四级结构 蛋白质工程8-02.1.2 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构u维持四级结构的主要力维持四级结构的主要力:疏水键、氢键、离子键和范德华引力疏水键、氢键、离子键和范德华引力 u常见的聚合体常见的聚合体:二聚体、三聚体、四聚体、五聚体，最二聚体、三聚体、四聚体、五聚体，最多可聚合成六十聚体多可聚合成六十聚体 蛋白质工程8-02.1 蛋白质结构基础蛋白质结构基础8-02.1.3 8-02.1.3 蛋白质分子之间的相互作用蛋白质分子之间的相互作用 蛋白质工程8-02.1.3 蛋白质分子之间的相互作用蛋白质分子之间的相互作用钼铁蛋白和铁蛋白相互作用示意图钼铁蛋白和铁蛋白相互作用示意图(引自引自Schlessman et al.)铁蛋白铁蛋白钼铁蛋白钼铁蛋白蛋白质工程8-02.1 蛋白质结构基础蛋白质结构基础8-02.1.4 8-02.1.4 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系蛋白质必须具备特定的结构，才能表现特定蛋白质必须具备特定的结构，才能表现特定的功能，在蛋白质肽链中有一些基团对特的功能，在蛋白质肽链中有一些基团对特定功能而言是必需基团，另一些是非必需定功能而言是必需基团，另一些是非必需基团。基团。在体内，蛋白质分子是如何利用它的特定结在体内，蛋白质分子是如何利用它的特定结构执行特定的生物功能的。构执行特定的生物功能的。蛋白质工程8-02.1.4 8-02.1.4 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系u同源蛋白质同源蛋白质 指在不同的有机体中实现同一功能的蛋指在不同的有机体中实现同一功能的蛋白质，但这些同源蛋白质中的氨基酸序列存白质，但这些同源蛋白质中的氨基酸序列存在着种属的差异性。在着种属的差异性。u结构域结构域 多肽链之间以共价键方式连接多肽链之间以共价键方式连接 功能区域功能区域 蛋白质工程8-02.1.4 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系 铁蛋白的分子结构是由铁核和蛋白质壳铁蛋白的分子结构是由铁核和蛋白质壳组成的。组成的。铁蛋白的隧道可分为电子隧道和物质交铁蛋白的隧道可分为电子隧道和物质交换隧道，前者起着传递电子的作用，后者起换隧道，前者起着传递电子的作用，后者起着物质交换的通道作用。着物质交换的通道作用。铁蛋白蛋白质壳通过柔性调节产生电子铁蛋白蛋白质壳通过柔性调节产生电子传递现象。传递现象。蛋白质工程8-02.1.4 8-02.1.4 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系 铁蛋白分子结构图铁蛋白分子结构图 A：蛋白质壳；：蛋白质壳；B：铁核；铁核；C：三相物质交换隧道：三相物质交换隧道 A蛋白质工程8-02.1.4 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系proteaseinhibitor-proteasecomplexinhibitor 丝氨酸蛋白酶抑制剂丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpins)抑制蛋白酶活性的途径与机理抑制蛋白酶活性的途径与机理蛋白质工程8-02.1.4 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系 模拟核小体分子模拟核小体分子 蛋白质工程8-02 8-02 蛋白质工程蛋白质工程8-02.2 8-02.2 蛋白质工程的研究方法蛋白质工程的研究方法8-02.2.1 8-02.2.1 蛋白质工程的研究策略蛋白质工程的研究策略 蛋白质工程的基本途径：蛋白质工程的基本途径：从预期功能出发，设计期望的结构，合从预期功能出发，设计期望的结构，合成目的基因且有效克隆表达或通过诱变、定成目的基因且有效克隆表达或通过诱变、定向修饰和改造等一系列工序，合成新型优良向修饰和改造等一系列工序，合成新型优良蛋白质。蛋白质。蛋白质工程8-02.2.1 蛋白质工程的研究策略蛋白质工程的研究策略 蛋白质工程的主要研究手段蛋白质工程的主要研究手段:利用所谓的反向生物学技术，其基本利用所谓的反向生物学技术，其基本思路是按期望的结构寻找最适合的氨基酸思路是按期望的结构寻找最适合的氨基酸序列，通过计算机设计，进而模拟特定的序列，通过计算机设计，进而模拟特定的氨基酸序列在细胞内或在体内环境中进行氨基酸序列在细胞内或在体内环境中进行多肽折叠而成三维结构的全过程，并预测多肽折叠而成三维结构的全过程，并预测蛋白质的空间结构和表达出生物学功能的蛋白质的空间结构和表达出生物学功能的可能及其高低程度。可能及其高低程度。蛋白质工程8-02.2.1 8-02.2.1 蛋白质工程的研究策略蛋白质工程的研究策略蛋白质工程8-02.2 8-02.2 蛋白质工程的研究方法蛋白质工程的研究方法8-02.2.2 蛋白质的全新设计蛋白质的全新设计8-02.2.2.1 设计目标的选择设计目标的选择蛋白质全新设计蛋白质全新设计 功能设计、结构设计。功能设计、结构设计。研究重点和难点研究重点和难点 从结构设计出发，从蛋白质的二级结构从结构设计出发，从蛋白质的二级结构开始，以摸索蛋白质结构的稳定性。开始，以摸索蛋白质结构的稳定性。蛋白质工程8-02.2.2 8-02.2.2 蛋白质的全新设计蛋白质的全新设计8-02.2.2.2 蛋白质设计技术与方法蛋白质设计技术与方法 常用的蛋白质设计思路常用的蛋白质设计思路 是否存在蛋白质多聚体状态；二级结构与预是否存在蛋白质多聚体状态；二级结构与预期目标是否吻合。期目标是否吻合。是否具有预定的三级结构。圆二色谱和核磁是否具有预定的三级结构。圆二色谱和核磁共振技术可用于研究蛋白质。共振技术可用于研究蛋白质。是否以单分子或多聚体形式存在。三级结构是否以单分子或多聚体形式存在。三级结构测定目前主要依靠荧光和核磁共振技术。体积排测定目前主要依靠荧光和核磁共振技术。体积排阻色谱法也可以用于判断分子体积大小、聚合体阻色谱法也可以用于判断分子体积大小、聚合体数目和蛋白质结构是处于无规则状态或三级结构数目和蛋白质结构是处于无规则状态或三级结构等生化参数。等生化参数。蛋白质工程8-02.2.2 8-02.2.2 蛋白质的全新设计蛋白质的全新设计 天然的锌指多肽天然的锌指多肽 FSD-1多肽多肽(从头设计从头设计)蛋白质工程8-02.2 8-02.2 蛋白质工程的研究方法蛋白质工程的研究方法8-02.2.3 改变现有蛋白质的结构改变现有蛋白质的结构 分离纯化目标蛋白质。分离纯化目标蛋白质。分析目标蛋白质的一级结构；分析目标蛋白质的三分析目标蛋白质的一级结构；分析目标蛋白质的三维结构以及结构与功能的关系。维结构以及结构与功能的关系。根据蛋白质的一级结构设计引物，克隆目的基因。根据蛋白质的一级结构设计引物，克隆目的基因。根据蛋白质的三维结构和结构与功能的关系以及蛋根据蛋白质的三维结构和结构与功能的关系以及蛋白质改造的目的设计改造方案。白质改造的目的设计改造方案。对目的基因进行人工定点突变。对目的基因进行人工定点突变。改造后的基因在宿主细胞中表达。改造后的基因在宿主细胞中表达。分离纯化表达的蛋白质并分析其功能，评价是否达分离纯化表达的蛋白质并分析其功能，评价是否达到设计目的。到设计目的。蛋白质工程8-02.2.3 8-02.2.3 改变现有蛋白质的结构改变现有蛋白质的结构 改变蛋白质结构的核心技术改变蛋白质结构的核心技术 基因人工定点突变技术基因人工定点突变技术M13M13载体法载体法 PCRPCR扩增法扩增法蛋白质工程8-02.2.3 8-02.2.3 改变现有蛋白质的结构改变现有蛋白质的结构8-02.2.3.1 M138-02.2.3.1 M13载体法载体法 该法的原理是利用人工合成带突变位该法的原理是利用人工合成带突变位点的寡聚核苷酸作为引物，利用点的寡聚核苷酸作为引物，利用M13M13噬菌体噬菌体载体系统合成突变基因。载体系统合成突变基因。蛋白质工程8-02.2.3.1 M138-02.2.3.1 M13载体法载体法 M13载体法基因人工定点突变示意图（引自吴乃虎，载体法基因人工定点突变示意图（引自吴乃虎，1998）蛋白质工程8-02.2.3.2 8-02.2.3.2 扩增法扩增法 该法的原理也是利用人工合成带突变该法的原理也是利用人工合成带突变位点的诱变引物，通过扩增而获得位点的诱变引物，通过扩增而获得定点突变的基因。定点突变的基因。PCRPCR定点诱变法可分为重定点诱变法可分为重组组PCRPCR定点诱变法和大引物诱变法两种。定点诱变法和大引物诱变法两种。蛋白质工程8-02.2.3 8-02.2.3 改变蛋白质的现有结构改变蛋白质的现有结构 重组重组PCR定点突变法示意图（引自吴乃虎，定点突变法示意图（引自吴乃虎，1998）蛋白质工程8-02.2.3.2 PCR8-02.2.3.2 PCR扩增法扩增法 大引物诱变法示意图（引自吴乃虎，大引物诱变法示意图（引自吴乃虎，1998）蛋白质工程8-02.2.3.2 PCR8-02.2.3.2 PCR扩增法扩增法8-02 蛋白质工程蛋白质工程 8-02.3 蛋白质工程的应用实例蛋白质工程的应用实例 8-02.3.1 胰蛋白酶胰蛋白酶 223个氨基酸残基和以异亮氨酸为个氨基酸残基和以异亮氨酸为N端的端的单肽链。单肽链。Arg117位自溶点的缺失突变，得到缺失位自溶点的缺失突变，得到缺失突变体，其结果表明该突变体的稳定性明突变体，其结果表明该突变体的稳定性明显提高。显提高。将酶分子表面的正电荷改变成负电荷，将酶分子表面的正电荷改变成负电荷，以提高胰蛋白酶催化活性中心以提高胰蛋白酶催化活性中心His57的的pKa值，在值，在pH较高的条件下显示出对精氨酸具较高的条件下显示出对精氨酸具有更高的专一性。有更高的专一性。蛋白质工程8-02.3 蛋白质工程的应用实例蛋白质工程的应用实例 8-02.3.2 8-02.3.2 人白细胞介素人白细胞介素-2-2 由由133133个氨基酸残基组成，共有三个半胱个氨基酸残基组成，共有三个半胱氨酸。氨酸。二硫键的错误配对将降低其生物学活性二硫键的错误配对将降低其生物学活性并对人具有抗原性。并对人具有抗原性。用基因定点突变方法可将用基因定点突变方法可将IL-2IL-2的的125125位位CysCys改为丝氨酸（改为丝氨酸（SerSer）或丙氨酸（）或丙氨酸（AlaAla），避），避免错误配对的产生，而且其热稳定性等方面免错误配对的产生，而且其热稳定性等方面也有较明显的改善。也有较明显的改善。蛋白质工程8-02.4 8-02.4 蛋白质组学蛋白质组学 针对有关基因或转录组数据库的生物体针对有关基因或转录组数据库的生物体或组织或组织/细胞，建立其蛋白质组或亚蛋白质细胞，建立其蛋白质组或亚蛋白质组及其蛋白质组连锁群，即组成性蛋白质组及其蛋白质组连锁群，即组成性蛋白质组学研究。组学研究。以重要生命过程或人类重大疾病为对象，以重要生命过程或人类重大疾病为对象，进行重要的生理进行重要的生理/病理体系或过程的局部蛋病理体系或过程的局部蛋白质研究，白质研究，即比较蛋白质组学研究即比较蛋白质组学研究。蛋白质组学支撑技术平台或生物信息学蛋白质组学支撑技术平台或生物信息学研究。研究。8-02 蛋白质工程蛋白质工程蛋白质工程8-02.4 蛋白质组学蛋白质组学 部分医学科学重点研究领域部分医学科学重点研究领域 研究细胞的增殖、分化、异常转化、肿瘤形成等方研究细胞的增殖、分化、异常转化、肿瘤形成等方面，涉及白血病、乳腺癌、结肠癌和神经母细胞瘤等重面，涉及白血病、乳腺癌、结肠癌和神经母细胞瘤等重大疾病。大疾病。蛋白质工程目前国内研究进展目前国内研究进展 重大疾病（如肝癌）、维甲酸诱导白血病细胞凋亡重大疾病（如肝癌）、维甲酸诱导白血病细胞凋亡启动模型。启动模型。维甲酸定向诱导胚胎干细胞向神经系统分化的蛋白维甲酸定向诱导胚胎干细胞向神经系统分化的蛋白质组。质组。血清中筛选诊断重大疾病的标志物血清中筛选诊断重大疾病的标志物人血清蛋白人血清蛋白质组学。质组学。各类肿瘤疾病形成过程中各类肿瘤疾病形成过程中,参与信号转导通道的蛋白参与信号转导通道的蛋白质组。质组。蛋白质工程8-02.4 8-02.4 蛋白质组学蛋白质组学复习思考题复习思考题简单叙述蛋白质结构的基本组件。简单叙述蛋白质结构的基本组件。简述氨基酸的基本理化性质。简述氨基酸的基本理化性质。简单描述反向生物学的途径。简单描述反向生物学的途径。举例说明对现有蛋白质进行改造的主要方举例说明对现有蛋白质进行改造的主要方法及其应用。法及其应用。什么是蛋白质组学？什么是蛋白质组学？8-02 蛋白质工程蛋白质工程蛋白质工程主要参考文献主要参考文献1沈同，王镜岩，赵邦悌.1980.生物化学（上，下册）.北京：高等教育出版社 2.王大成.2002.蛋白质工程.北京：化学工业出版社 3.Pennington SR，Dunn MJ.2001.Proteomics:from Protein Sequence to Funcation.New York:BIOS Scientific Publisher Limited 4.沈仁权，顾其敏，李泳裳等.1980.基础生物化学.上海：上海科学技术出版社 5.M.R.坎普等著.2000.蛋白结构分析：制备、鉴定与微量测序.施蕴渝，饶子和，陈常庆译.北京：科学出版社6.夏其昌.1997.蛋白质化学研究技术与进展.北京：科学出版社 7.何美玉.2002.现代有机与生物质谱.北京：北京大学出版社 8.T.A.B布朗.2002.基因组.袁建刚，周严，张伯勤译.北京：科学出版社 （黄河清 编写）8-02 蛋白质工程蛋白质工程蛋白质工程