实验十 酵母核糖核酸的分离及组.ppt
实验十实验十 酵母核糖核酸的提取酵母核糖核酸的提取及及RNA的含量测定（苔黑酚法）的含量测定（苔黑酚法）实验目的：实验目的：v 了解核酸的组分了解核酸的组分v掌握提取核酸和鉴定核酸组分的方法掌握提取核酸和鉴定核酸组分的方法v掌掌握握 苔苔黑黑酚酚法法测测定定RNA含含量量的的原原理理和和方法。方法。实验原理：实验原理：酵酵母母中中RNARNA含含量量较较多多,含含量量可可达达2.672.6710.0%10.0%，DNADNA很很少少（0.030.030.5160.516），提提取取RNARNA以酵母最为理想。以酵母最为理想。RNARNA可可溶溶于于碱碱性性溶溶液液，研研磨磨后后离离心心去去除除沉沉淀淀（细细胞胞碎碎片片），当当碱碱被被中中和和后后，上上清清液液中中加加入入乙乙醇醇可可以以使使解解聚聚的的核核糖糖核核酸酸沉沉淀淀，离离心弃上清液，可得到心弃上清液，可得到RNARNA的粗制品。的粗制品。RNA versus DNA-Stability issues 一、核酸的水解核酸的水解 1.碱水解lRNA的磷酯键易被碱水碱、DNA的磷酯键不易被碱水解。例如，在0.1 mol/L NaOH溶液中，RNA几乎可以完全水解，生成2-或3-磷酸核苷；DNA在同样条件下则不受影响。这种水解性能上的差别，与RNA核糖基上2-OH的邻基参与作用有很大的关系。在RNA水解时，2-OH首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。一、核酸的水解核酸的水解 2.酸水解 核酸分子中的糖苷键和磷酸二酯键在酸性条件下水解切断。其中糖苷键比磷酸二酯键更容易遭到水解。核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。从水解液中可以测出上述组分的存在。（1 1）核糖）核糖 糠醛糠醛糠醛糠醛+甲基苯二酚（地衣酚、苔黑酚）甲基苯二酚（地衣酚、苔黑酚）鲜绿色的复合物（鲜绿色的复合物（670670nm nm）Fe3+H+（2 2）嘌呤碱）嘌呤碱+AgNOAgNO3 3 嘌呤碱的银化物嘌呤碱的银化物（3 3）（NHNH4 4)2 2MoOMoO4 4+H+H2 2SOSO4 4 H H2 2MoOMoO4 4+(NH+(NH4 4)2 2SOSO4 4 H H3 3POPO4 4+12H+12H2 2MoOMoO4 4 H H3 3P(MoP(Mo3 3O O1010)4 4+12H+12H2 2O O +抗坏血酸抗坏血酸 钼蓝钼蓝 （660660nmnm）浓浓氨水氨水器材和试剂器材和试剂器器材材：乳乳钵钵、150ml锥锥形形瓶瓶、水水浴浴锅锅、量量筒筒、吸吸管管、滴滴管管、试试管管及及试试管管架架、烧烧杯、杯、离心机离心机、漏斗、漏斗试剂：试剂：0.2%氢氧化钠氢氧化钠溶液、溶液、5%硝酸银硝酸银溶液溶液冰醋酸、干冰醋酸、干酵母、酵母、95%乙醇乙醇、10%硫酸硫酸溶液、溶液、浓氨水浓氨水 苔黑酚三氯化铁溶液苔黑酚三氯化铁溶液定磷试剂定磷试剂 （1）17%硫硫酸酸溶溶液液 将将17ml浓浓硫硫酸酸（比比重重1.84）缓缓缓缓加加入入到到83ml水中。水中。（2）2.5%钼酸铵溶液钼酸铵溶液 将将2.5g钼酸铵溶于钼酸铵溶于100ml水中。水中。（3）10%抗抗坏坏血血酸酸溶溶液液 10g抗抗坏坏血血酸酸溶溶于于100ml水水中中，贮贮棕棕色色瓶瓶保保存存。溶溶液液呈呈淡淡黄黄色色时时可可用用，如如呈深黄或棕色则失败，需纯化抗坏血酸。呈深黄或棕色则失败，需纯化抗坏血酸。临用时将上述临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合。种溶液与水按如下比例混合。17%硫硫酸酸溶溶液液：2.5%钼钼酸酸铵铵溶溶液液：10%抗抗坏坏血血酸酸溶液：水溶液：水=1:1:1:2(V/V)操作操作 1 1、提取核糖核酸、提取核糖核酸5g5g酵母酵母+30ml0.2%+30ml0.2%氢氧化钠氢氧化钠 研磨均匀研磨均匀 锥形瓶，微波加热锥形瓶，微波加热5 5分钟，冷却，离心分钟，冷却，离心（4000r/min4000r/min）1010分钟，取上清液，滴加分钟，取上清液，滴加冰醋酸使提取液呈酸性（冰醋酸使提取液呈酸性（pH56pH56，石蕊试，石蕊试纸试之），加纸试之），加30ml95%30ml95%乙醇溶液。乙醇溶液。注意要注意要一边搅拌一边缓缓倾入一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀。待核糖核酸沉淀完全，离心（完全，离心（3000r/min3000r/min）3 3分钟，分钟，95%95%乙乙醇（每次约醇（每次约10ml10ml）洗涤沉淀两次（即离心）洗涤沉淀两次（即离心）。2 2、组组分分鉴鉴定定 提提取取核核酸酸+10%+10%硫硫酸酸溶溶液液5ml 5ml 1010分钟分钟 水解液水解液组分鉴定：组分鉴定：1 1）嘌嘌呤呤碱碱:硝硝酸酸银银溶溶液液1ml 1ml+过过量量浓浓氨氨水水,出出现现沉沉淀淀到到沉沉淀淀消消失失，再再滴滴加加1ml1ml水水解解液液，观观察察有有无无嘌嘌呤呤碱碱的的银银化化合合物物沉沉淀淀。（注注意意先后顺序）先后顺序）2 2）核核糖糖 水水解解液液0.5ml+0.5ml+苔苔黑黑酚酚三三氯氯化化铁铁溶溶液液1ml1ml，加加热热至至沸沸1 1分分钟钟，观观察察溶溶液液颜颜色色变化。变化。沸水浴沸水浴 3 3）磷酸）磷酸 水解液水解液1 1ml+ml+定磷试剂定磷试剂1 1mlml 观察现象观察现象实验结果：实验结果：水浴水浴苔黑酚法测RNA的含量n1、标准曲线的绘制012345RNA标准液ml00.40.81.21.62.0蒸馏水ml2.01.61.20.80.40苔黑酚试剂ml2.02.02.02.02.02.0混匀，沸水浴2545min,冷却，测各管A670nm,以A670nm为纵坐标，RNA量（ug）为横坐标作图。n2、样品的测定 1.0ml样液+1.0ml蒸馏水+2.0ml苔黑酚试剂，混匀，沸水浴2545min,测A670nm，根据标准曲线求得RNA的质量（ug）.
