T∕GDSF 0011-2022 南海岛礁海域石斑鱼生态增殖技术规范.pdf

ICS 65.150 CCS GDSF B 50 广东水产学会团体标准 T/GDSF 00112022 南海岛礁海域石斑鱼生态增殖技术规范 Technical specifications for ecological enhancement of reef-inhabiting groupers in the South China Sea 2022-11-30 发布 2022-12-1 实施 广东水产学会 发 布 T/GDSF 00112022 I 目次 前言.III 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 海域及容量选择.1 海域自然条件.1 增殖容量.2 5 种类选择.2 6 苗种培育、规格及适应性驯化.2 苗种培育.2 规格.2 适应性驯化.2 7 苗种检验检疫.2 检验资质机构要求.2 抽检原则与数量要求.2 检验内容与方法.2 苗种原生性鉴定.3 8 生态增殖.3 原位增殖.3 定点增殖.3 9 标志放流与回捕.3 标志前处理.3 标志方法.3 标志后处理.4 放流.4 回捕.4 10 增殖效果评估.4 标志回捕评估.4 环境 DNA 调查.4 分子标记监测.4 11 管理.4 附录A （规范性）石斑鱼生态增殖放流情况记录表.5 A.1 石斑鱼生态增殖放流情况记录表.5 附录B （资料性）环境 DNA 的调查方法.6 B.1 抽样.6 B.2 运输.6 T/GDSF 00112022 II B.3 保藏.6 B.4 DNA 提取.6 B.5 鱼类物种鉴定条形码（12S rRNA 基因；163bp185bp)分析.6 附录C （资料性）基于微卫星分子标记的石斑鱼放流回捕占比率计算.8 C.1 样本采集.8 C.2 样本保存.8 C.3 样本 DNA 提取.8 C.4 微卫星基因分型.8 C.5 特定种类石斑鱼回捕抽样样本的遗传区分.8 C.6 石斑鱼放流回捕占比率计算.8 T/GDSF 00112022 III 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由广东水产学会提出并归口。本文件起草单位：中国科学院南海海洋研究所、中山大学、广东海洋大学、海南大学、广西科学院、广西精工海洋科技有限公司、湛江市东海岛东方实业有限公司。本文件主要起草人：胡超群、王学锋、李广丽、夏军红、周永灿、陈廷、吴小易、李文笙、孙彩云、陈偿、罗鹏、柯志新、田昌绪、李建龙、姜发军、朱宗贤、宋建强、陈文林。T/GDSF 00112022 1 南海岛礁海域石斑鱼生态增殖技术规范 1 范围 本文件规定了南海岛礁海域石斑鱼生态增殖的海域及容量选择、种类选择和苗种选择及检验检疫要求，描述了生态增殖效果的监测和评估方法，提供了石斑鱼生态增殖管理的指导意见。本文件适用于南海岛礁海域石斑鱼的生态增殖。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 11607.3 渔业水质标准 第3部分：渔业水质要求 GB/T 18654.2 养殖鱼类种质检验 第2部分：抽样方法 GB/T 20361 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 高效液相色谱荧光检测法 GB/T 34748.7 水产种质资源基因组DNA的微卫星分析 第7部分：分析步骤 NY 5070 无公害食品 水产品中渔药残留限量 SC/T 3018 水产品中氯霉素残留量的测定 气相色谱法 SC/T 9401.4 水生生物增殖放流技术规程 第4部分：水域条件 SC/T 9401.7 水生生物增殖放流技术规程 第7部分：检验 DB33/T 2102.9 海洋生物增殖放流技术规范 岩礁性鱼类 第9部分：放流苗种检验检疫 DB34/T 3650 水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 酶联免疫吸附法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。原生种 Original species 在无人为干预的野生环境下自然演化而来的物种。生态增殖 Ecological enhancement 采用放流、移植或栽培、底播等人工方式，在生态系统承载力范围内，利用天然生产力增加生物种群产量的过程。适应性驯化 Adaptive domestication 增殖放流苗种适应野外海域环境的人工培育和处理过程。原位增殖 In-situ stock enhancement 在放流物种原本栖息的生境中，通过生态增殖手段，利用天然生产力增加放流种群产量的过程。环境 DNA Environmental DNA 是指从环境样本中提取的所有DNA的集合，包括环境微生物以及从生物体上脱落下来的活细胞DNA和因生物死亡后细胞破碎而游离出的胞外DNA。4 海域及容量选择 海域自然条件 T/GDSF 00112022 2 应符合SC/T 9401.4的规定，且满足下述条件：a)岛礁为天然珊瑚礁、岩礁或人工鱼礁区，水流较缓且附近底质起伏而又多石砾；b)水深 1m100m，溶解氧5mg/L，盐度 1036，水温 2233。增殖容量 增殖容量不超过拟增殖海域历史上最大捕捞产量的2倍。5 种类选择 选择来自南海海域，生活史大部分时间主要栖息于珊瑚礁、岩礁和人工鱼礁区且活动范围较小的石斑鱼原生种。禁止采用外来种、杂交种、转基因种以及其他不符合生态要求的石斑鱼物种进行生态增殖。适合南海岛礁海域生态增殖的主要石斑鱼种类有棕点石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus）、斜带石斑鱼（E.coioides）和豹纹鳃棘鲈（Plectropomus leopardus）。6 苗种培育、规格及适应性驯化 苗种培育 培育过程中水质应符合GB 11607.3规定的要求，病害检测按照SC/T 9401.7规定的方法进行，培育期间应做好培育过程的实验记录，主要包括水质（水温、溶解氧、pH、盐度、氨氮和有机质等）参数、投喂的饲料类型（或活饵种类）、饲料粒径（饲料号数）、苗种数量、鱼苗活力、规格及体形外观等。规格 增殖放流的石斑鱼全长宜在5cm以上。适应性驯化 宜满足以下内容：a)苗种放流前 2 周4 周宜模拟增殖海域的水温、盐度等环境条件对苗种进行驯化；b)在有条件的情况下，开展行为驯化，增强放流苗种的野外适应能力（不限于捕食和躲避敌害生物等行为驯化）；c)有条件的情况下，进行石斑鱼苗种音响驯化，并在放流海域继续进行音响驯化，以提高增殖效果。7 苗种检验检疫 检验资质机构要求 由具备相应检验资质的单位进行检验，并出具正式报告。抽检原则与数量要求 随机取样，常规质量检验每次取样尾数不少于50尾。检验内容与方法 按照DB33/T 2102.9规定的要求进行检验检疫（参见表1），具体检验检疫内容包括：感官质量、可数指标、病害和药残等。表1 苗种质量的检验检疫 序号 检验内容 检验方法与要求 1 感官质量 规格整齐、活力强，外观完整，体表光洁 2 可数指标 规格合格率90%以上，死亡个体比例、伤残率、畸形率之和5%T/GDSF 00112022 3 序号 检验内容 检验方法与要求 3 病害 参照DB33/T 2102.9方法检测 4 药残 孔雀石绿、氯霉素、硝基呋喃类代谢物分别参照GB/T 20361，NY 5070，SC/T 3018及DB34/T 3650方法检测 5 其它 对于苗种的特发病、易发病及新型药残，依照最新标准所规定的方法进行检测 苗种原生性鉴定 基于微卫星标记技术分析待检苗种群体和本地种群的遗传多样性和群体遗传结构，分析群体间遗传分化程度，鉴定苗种群体的原生种属性。7.4.1 用于微卫星标记检测的样品采集 7.4.1.1 原生种：在放流物种地理分布范围内随机抽样，数量为 50 尾60 尾。7.4.1.2 待检苗种群体：随机抽样，每批次取样 50 尾60 尾。7.4.2 样品采集、运输与保藏条件 现场取1cm1cm的鳍条样品，保存于盛有5ml无水乙醇的10ml离心管中，常温运回实验室后，将10ml离心管中的无水乙醇更换一次，放入-80或-20低温冰箱长期保存。7.4.3 DNA 提取 按常规酚-氯仿方法提取总DNA，放入-80或-20低温冰箱长期保存。7.4.4 微卫星基因分型方法 按照GB/T 34748.7规定的方法进行。7.4.5 统计分析 利用微卫星分子标记分析软件（如：GeneMapper、Cervus）进行遗传多样性和基因流分析。7.4.6 原生性判定 当待检苗种群体与原生种群体间不存在显著遗传差异（P0.05），可判定待检苗种群体与本地群体存在明显基因交流，属于同一种群来源。8 生态增殖 原位增殖 根据岛礁自然形态和生物资源、生态环境现状以及拟增殖种类的栖息习性等基础数据，直接将规模化培育的大规格苗种在石斑鱼关键栖息生境开展原位增殖，包括但不限于梯级式原位增殖、自适应式渐进放流和关键增殖点密集放流等方式。定点增殖 根据增殖目标和岛礁水域生境特征，将石斑鱼苗种运到预设的站位放流，进行定点增殖。9 标志放流与回捕 标志前处理 标志前将石斑鱼个体转移至暂养池中暂养3d7d，暂养期间投喂活饵进行野性驯化；根据拟增殖放流海域的温度、盐度逐步调节水质，直至温度差3，盐度差3。标志前测量待标志石斑鱼的体长和体重。标志方法 T/GDSF 00112022 4 将石斑鱼个体麻醉、消毒后，采用挂牌、金属线码、被动式整合雷达标志、超声波标志和无线电标志的方法对石斑鱼个体进行标志。标志后处理 将标志后的石斑鱼暂养3d，期间及时捞出死亡的个体并做好记录。在正式放流前1d停止投喂以减少运输和放流过程对鱼体的损伤。放流 标志的石斑鱼群体与未标志群体宜在同一海域、同一站点和同一时间进行放流。标志与未标志石斑鱼的数量比在每一个放流站点应尽量保持一致。对标志石斑鱼的增殖放流情况应做好记录（参见附录A）。回捕 在码头、市场采用抽样调查和问卷调查的方式进行回捕调查；在放流后一年内在放流海域进行监测性回捕，记录回捕个体的捕捞时间、站位、数量、规格、标志码和捕捞方法。10 增殖效果评估 标志回捕评估 利用标志石斑鱼回捕率来评估石斑鱼的增殖效果。标志石斑鱼回捕率为增殖放流后一年内回捕标志石斑鱼个体数占放流标志石斑鱼总个体数的百分比，计算公式如下：=()100%(1)式中：RMH标志石斑鱼回捕率，单位为%；MCn增殖放流后一年内回捕标志石斑鱼个体数，单位为尾；MCt放流标志石斑鱼总个体数，单位为尾。环境 DNA 调查 参照附录B的环境DNA调查方法对放流海域的环境DNA样品进行分析，鉴定放流海域存在的石斑鱼种类和相对丰度，进而评价石斑鱼的增殖效果。分子标记监测 在石斑鱼增殖放流实施一年后，在放流海域进行石斑鱼群体回捕，并基于微卫星分子标记技术进行石斑鱼增殖放流群体回捕占比率的计算。利用放流群体回捕占比率来评估石斑鱼的增殖效果，石斑鱼放流回捕占比率的计算方法参见附录C。11 管理 石斑鱼增殖放流后，应定期巡查放流增殖海域，防止非法捕捞增殖放流的石斑鱼资源。定期采用水下视频监测或潜水的方式，观察增殖放流石斑鱼的活动和生长情况，为进一步优化石斑鱼生态增殖技术提供依据。T/GDSF 00112022 5 附录A （规范性）石斑鱼生态增殖放流情况记录表 A.1 石斑鱼生态增殖放流情况记录表 石斑鱼生态增殖放流情况记录表见表A.1。表A.1 石斑鱼生态增殖放流情况记录表 增殖放流单位：记录日期：石斑鱼种类 放流日期 放流人员 放流海域 气温 水温 盐度 pH 放流数量 放流规格 标志放流数量 标志放流规格 放流海域中心位点 GPS 坐标 放流海域边缘坐标 1 放流海域边缘坐标 2 放流海域边缘坐标 3 放流海域边缘坐标 4 放流海域边缘坐标 5 放流海域边缘坐标 6 放流海域边缘坐标 7 放流海域边缘坐标 8 放流海域边缘坐标 9 放流海域边缘坐标 10 放流海域边缘坐标 11 放流海域边缘坐标 12 记录人：核对人：T/GDSF 00112022 6 附录B （资料性）环境 DNA 的调查方法 B.1 抽样 按照GB/T 18654.2规定的抽样方法执行。岛礁海域每个区域至少设置三个取样点，在每个取样点贴近海底沉积物处取1L海水，重复取样三次，1L去离子水作为对照。B.2 运输 样品在运输过程中，辅以干冰或冰块，将容器内的温度控制在25以内。B.3 保藏 样品运送至实验室后，采用醋酸纤维素过滤膜（孔径0.22m）进行过滤。过滤后的滤纸可以装进试管，保存于-80，直至DNA抽提。B.4 DNA 提取 按照常规酚-氯仿或试剂盒DNA提取方法提取总DNA。DNA放入-70或-20低温冰箱长期保存。B.5 鱼类物种鉴定条形码（12S rRNA 基因；163bp185bp)分析 B.5.1 PCR引物 B.5.1.1 第 1 轮 PCR 扩增鱼类通用引物序列（Miya,et al.,2015)MiFish-U-F：5-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNGTCGGTAAAACTCGTGCCAGC-3 MiFish-U-R：5-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNCATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG-3 在上述两条引物中，前面的33个和34个核苷酸（nt）部分为高通量测序引物的结合位点，随后的6个随机引物（NNNNNN，如AAGGTT）用于增强测序平台流动池（flowcell）DNA簇的分离，最后的21个和25个碱基序列为12S rRNA基因通用引物序列。B.5.1.2 第 2 轮扩增通用引物 Forward：5-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAXXXXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3 Reverse：5-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3 在上述两条引物中，8个连续X碱基代表Illumila测序技术通用的Index序列，可以用于区分不同样本；连续X碱基前面的5 端序列允许扩增产物与测序平台流动池（flowcell）的寡核苷酸进行特异结合，连续X碱基后面的3端序列是Illumila测序引物结合位点。该引物组合为Illumila测序建库专用引物，通过第二轮PCR扩增获得的序列文库，割胶纯化后可以直接送测序公司进行高通量测序。B.5.2 检测内容和主要方法 B.5.2.1 第一轮 PCR 扩增 PCR反应在热循环仪器（如Model 9700）中进行，PCR体系的反应体积为12L，其中包括4.6L双蒸水、6L 2HiFi HotStart ReadyMix、0.2L正反向引物（10M）和1.0L总DNA模板（50ng）。PCR热循环条件：95高温预变性3min；95变性20s，65退火15s，72延伸15s，共30个循环；72再延伸5min。B.5.2.2 第二轮 PCR 扩增 T/GDSF 00112022 7 将第一轮PCR产物稀释10倍作为第二轮PCR模板，PCR体系的反应体积为12L，包括6.0L 2 HiFi HotStart ReadyMix、0.7L正反向引物（5M）、3.6L双蒸水和1.0L模板。PCR热循环条件：95预变性3min；98变性20s，65退火15s，72延伸15s；72再延伸5min。B.5.2.3 PCR 产物检测 利用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。点样5L后，在120V恒压下电泳25min。采用DNA凝胶成像系统观察扩增情况。目标基因序列约为370bp。B.5.2.4 测序 切胶纯化PCR产物，送测序服务公司进行Illumila高通量测序。B.5.2.5 石斑鱼鉴定 B.5.2.5.1 序列聚类 采用FastQC、Cutadapt、USEARCH等生物信息学软件，对原始测序数据质量进行分析并去除低质量数据。采用QIIME2分析软件，在97%的序列相似水平下，对高质量的eDNA测序序列数据进行聚类，去除冗余序列，获得所有序列的分类单元（OTU）。B.5.2.5.2 物种注释 通过序列比对方法，将所有的分类单元数据与已知物种的核糖体RNA序列数据库进行序列比对，从而获得每个分类单元的物种注释数据。B.5.2.5.3 分类鉴定 基于物种注释数据，鉴定eDNA样本中的石斑鱼属和种。B.5.2.6 特定石斑鱼相对丰度计算 根据分类单元注释数据中石斑鱼种和属的分类情况，分别统计石斑鱼的属序列条数（Gn）和种序列条数(Sn)及其占全部鱼类序列条数(Tn)的百分比。B.5.2.6.1 特定石斑鱼属的相对丰度为特定石斑鱼属序列条数占全部鱼类序列条数的百分比，计算公式如下：=()100%(B.1)式中：Rg特定石斑鱼属相对丰度，单位为%；Gn特定石斑鱼属的序列条数，单位为条；Tn全部鱼类序列条数，单位为条。B.5.2.6.2 特定石斑鱼种的相对丰度为特定石斑鱼种序列条数占全部鱼类序列条数的百分比，计算公式如下：=()100%(B.2)式中：Rs特定石斑鱼物种相对丰度，单位为%；Sn特定石斑鱼物种的序列条数，单位为条；Tn全部鱼类序列条数，单位为条。T/GDSF 00112022 8 附录C （资料性）基于微卫星分子标记的石斑鱼放流回捕占比率计算 C.1 样本采集 对于生态增殖区的同种类石斑鱼，放流前分别采集原生种群和放流苗种群体样本各50尾60尾，回捕时随机抽取50尾60尾回捕样本。C.2 样本保存 样本采集后，用剪刀剪取1cm1cm的鳍条样品，置于含有5mL 95%乙醇的10mL离心管中，辅以干冰或冰块，将样本常温运至实验室保存。C.3 样本 DNA 提取 采用常规的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取石斑鱼样本DNA，DNA浓度50ng/L，OD260/OD280=1.82.0。C.4 微卫星基因分型 筛选出特定种类石斑鱼扩增稳定且多态性高的微卫星标记用于遗传多样性分析。按照GB/T 34748.7规定的方法进行分析，对三类样本进行基因分型。C.5 特定种类石斑鱼回捕抽样样本的遗传区分 利用本文件B.4的分型结果，通过相关软件对三个群体（原生种群、放流苗种和回捕样本）进行遗传分析，鉴定特定种类石斑鱼的回捕抽样样本与同种类放流苗种群体和原生种群间的遗传距离，如回捕抽样样本与放流苗种群体具有相似的分子遗传特征，且聚为一类时，可确定其为放流群体的回捕个体。C.6 石斑鱼放流回捕占比率计算 统计特定种类石斑鱼回捕抽样样本中放流群体的回捕个体数，并按如下公式计算石斑鱼放流回捕占比率：=（/）100%(C.1)式中：RH石斑鱼放流回捕占比率，单位为%；Cn特定种类石斑鱼回捕抽样样本中放流群体的回捕个体数，单位为尾；Ct特定种类石斑鱼回捕抽样样本的总个体数，单位为尾。