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DNA DNA BarcodingBarcoding在药用植物在药用植物鉴定中的应用鉴定中的应用DNA Barcoding in the identification of medicinal plants刘 滨 李宏富n nDNADNADNADNA条形码技术条形码技术条形码技术条形码技术(DNA(DNA(DNA(DNA barcodingbarcodingbarcodingbarcoding)是利用标准是利用标准是利用标准是利用标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的的、有足够变异的、易扩增且相对较短的的、有足够变异的、易扩增且相对较短的的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNADNADNADNA片段片段片段片段(DNA barcode)(DNA barcode)(DNA barcode)(DNA barcode)自身在物种种内的特自身在物种种内的特自身在物种种内的特自身在物种种内的特异性和种间的多样性而创建的一种新的生物异性和种间的多样性而创建的一种新的生物异性和种间的多样性而创建的一种新的生物异性和种间的多样性而创建的一种新的生物身份识别系统身份识别系统身份识别系统身份识别系统,它可以对物种进行快速的自它可以对物种进行快速的自它可以对物种进行快速的自它可以对物种进行快速的自动鉴定。动鉴定。动鉴定。动鉴定。n nDNA DNA DNA DNA BarcodingBarcodingBarcodingBarcoding的概念由加拿大动物学家的概念由加拿大动物学家的概念由加拿大动物学家的概念由加拿大动物学家Paul HebertPaul HebertPaul HebertPaul Hebert首次提出。首次提出。首次提出。首次提出。n nPaul HebertPaul HebertPaul HebertPaul Hebert等对等对等对等对动物界包括脊椎动物和无动物界包括脊椎动物和无动物界包括脊椎动物和无动物界包括脊椎动物和无脊椎动物共脊椎动物共脊椎动物共脊椎动物共11111111门门门门13 32013 32013 32013 320个物种的线粒体细胞个物种的线粒体细胞个物种的线粒体细胞个物种的线粒体细胞色素色素色素色素c c c c氧化酶亚基氧化酶亚基氧化酶亚基氧化酶亚基1 1 1 1（CytochromeCytochromeCytochromeCytochrome coxdasecoxdasecoxdasecoxdase I I I I，CO ICO ICO ICO I）基因序列）基因序列）基因序列）基因序列比较分析，除腔肠动物比较分析，除腔肠动物比较分析，除腔肠动物比较分析，除腔肠动物CnidariaCnidariaCnidariaCnidaria外，外，外，外，98%98%98%98%的物种遗传距离差异在种的物种遗传距离差异在种的物种遗传距离差异在种的物种遗传距离差异在种内内内内0%-2%0%-2%0%-2%0%-2%，种间平均可达到，种间平均可达到，种间平均可达到，种间平均可达到11.3%11.3%11.3%11.3%，据此提出，据此提出，据此提出，据此提出可以用单一的小片段基因来代表物种；他们可以用单一的小片段基因来代表物种；他们可以用单一的小片段基因来代表物种；他们可以用单一的小片段基因来代表物种；他们将超市用以区分成千上万种不同商品的条形将超市用以区分成千上万种不同商品的条形将超市用以区分成千上万种不同商品的条形将超市用以区分成千上万种不同商品的条形码概念引入，把这种小片段基因序列称作物码概念引入，把这种小片段基因序列称作物码概念引入，把这种小片段基因序列称作物码概念引入，把这种小片段基因序列称作物种的种的种的种的DNADNADNADNA条形码（条形码（条形码（条形码（DNA barcodesDNA barcodesDNA barcodesDNA barcodes）并提出）并提出）并提出）并提出为为为为全球生物编码全球生物编码全球生物编码全球生物编码的计划。的计划。的计划。的计划。DNA条形码的原理n nDNADNADNADNA是生物的遗传信息载体。遗传基础的不是生物的遗传信息载体。遗传基础的不是生物的遗传信息载体。遗传基础的不是生物的遗传信息载体。遗传基础的不同，决定了生物的多样性。由于每种生物物同，决定了生物的多样性。由于每种生物物同，决定了生物的多样性。由于每种生物物同，决定了生物的多样性。由于每种生物物种的种的种的种的DNADNADNADNA序列都是唯一的，就给序列都是唯一的，就给序列都是唯一的，就给序列都是唯一的，就给DNADNADNADNA条形码提条形码提条形码提条形码提供了物质基础，每个位点上都有供了物质基础，每个位点上都有供了物质基础，每个位点上都有供了物质基础，每个位点上都有A A A A、T T T T、G G G G、C C C C 4 4 4 4种选择。种选择。种选择。种选择。n n由于部分碱基的保守性，几十个碱基的长度由于部分碱基的保守性，几十个碱基的长度由于部分碱基的保守性，几十个碱基的长度由于部分碱基的保守性，几十个碱基的长度不能提供足够的编码信息，因此不能提供足够的编码信息，因此不能提供足够的编码信息，因此不能提供足够的编码信息，因此目前的目前的目前的目前的DNADNADNADNA条形码分析都是基于几百个碱基长度的条形码分析都是基于几百个碱基长度的条形码分析都是基于几百个碱基长度的条形码分析都是基于几百个碱基长度的DNADNADNADNA序列。序列。序列。序列。DNA条形码的标准n nKressKressKressKress等等等等(2005)(2005)(2005)(2005)和和和和TaberletTaberletTaberletTaberlet等等等等(2007)(2007)(2007)(2007)提出了提出了提出了提出了理想的理想的理想的理想的DNADNADNADNA条形码标准条形码标准条形码标准条形码标准：n n(1)(1)(1)(1)具有可以区分物种的足够变异和分化，具有可以区分物种的足够变异和分化，具有可以区分物种的足够变异和分化，具有可以区分物种的足够变异和分化，同时种内变异必须足够小；同时种内变异必须足够小；同时种内变异必须足够小；同时种内变异必须足够小；n n(2)(2)(2)(2)有高度保守的引物设计区以便于设计通有高度保守的引物设计区以便于设计通有高度保守的引物设计区以便于设计通有高度保守的引物设计区以便于设计通用引物；用引物；用引物；用引物；n n(3)(3)(3)(3)片段足够短，以便于片段足够短，以便于片段足够短，以便于片段足够短，以便于DNADNADNADNA提取和提取和提取和提取和PCRPCRPCRPCR扩增，扩增，扩增，扩增，尤其是对部分降解的尤其是对部分降解的尤其是对部分降解的尤其是对部分降解的DNADNADNADNA的扩增。的扩增。的扩增。的扩增。DNADNA条形码的优点条形码的优点n n生命条形码联盟生命条形码联盟生命条形码联盟生命条形码联盟(consortium for the barcode(consortium for the barcode(consortium for the barcode(consortium for the barcode oflifeoflifeoflifeoflife,CBOL),CBOL),CBOL),CBOL)阐述了阐述了阐述了阐述了DNADNADNADNA条形码的优点：条形码的优点：条形码的优点：条形码的优点：n n(1)(1)(1)(1)以以以以DNADNADNADNA序列为检测对象，其在个体发育过程中不序列为检测对象，其在个体发育过程中不序列为检测对象，其在个体发育过程中不序列为检测对象，其在个体发育过程中不会改变。同种生物不同生长时期的会改变。同种生物不同生长时期的会改变。同种生物不同生长时期的会改变。同种生物不同生长时期的DNADNADNADNA序列信息是相序列信息是相序列信息是相序列信息是相同的，即使经过加工，形态发生变化，而同的，即使经过加工，形态发生变化，而同的，即使经过加工，形态发生变化，而同的，即使经过加工，形态发生变化，而DNADNADNADNA序列信序列信序列信序列信息不会改变，较之传统的方法，扩大了检测样本范息不会改变，较之传统的方法，扩大了检测样本范息不会改变，较之传统的方法，扩大了检测样本范息不会改变，较之传统的方法，扩大了检测样本范围；同时样本部分受损也不会影响识别结果。围；同时样本部分受损也不会影响识别结果。围；同时样本部分受损也不会影响识别结果。围；同时样本部分受损也不会影响识别结果。n n(2)(2)(2)(2)可进行非专家物种鉴定。该技术是可机械重复的，可进行非专家物种鉴定。该技术是可机械重复的，可进行非专家物种鉴定。该技术是可机械重复的，可进行非专家物种鉴定。该技术是可机械重复的，只要设计一套简单的实验方案，经过简单培训的技只要设计一套简单的实验方案，经过简单培训的技只要设计一套简单的实验方案，经过简单培训的技只要设计一套简单的实验方案，经过简单培训的技术员即可操作。术员即可操作。术员即可操作。术员即可操作。DNADNA条形码的优点条形码的优点n n(3)(3)(3)(3)准确性高。特定的物种具有特定的准确性高。特定的物种具有特定的准确性高。特定的物种具有特定的准确性高。特定的物种具有特定的DNADNADNADNA序序序序列信息，而形态学鉴别特征会因趋同和变异列信息，而形态学鉴别特征会因趋同和变异列信息，而形态学鉴别特征会因趋同和变异列信息，而形态学鉴别特征会因趋同和变异导致物种的鉴定误差导致物种的鉴定误差导致物种的鉴定误差导致物种的鉴定误差n n(4)(4)(4)(4)通过建立通过建立通过建立通过建立DNADNADNADNA条形码数据库，可一次性快条形码数据库，可一次性快条形码数据库，可一次性快条形码数据库，可一次性快速鉴定大量样本。分类学家新的研究成果将速鉴定大量样本。分类学家新的研究成果将速鉴定大量样本。分类学家新的研究成果将速鉴定大量样本。分类学家新的研究成果将不断地加入数据库，成为永久性资料，从而不断地加入数据库，成为永久性资料，从而不断地加入数据库，成为永久性资料，从而不断地加入数据库，成为永久性资料，从而推动分类学科更加快速深入地发展。推动分类学科更加快速深入地发展。推动分类学科更加快速深入地发展。推动分类学科更加快速深入地发展。操作及分析方法1.提取目的基因 2.PCR3.电泳4.结果分析植物DNA的提取1.2g1.2g新鲜植物叶片，液氮中研磨尽量越细越好；新鲜植物叶片，液氮中研磨尽量越细越好；2.2.至至50ml50ml离心管中，加离心管中，加8ml8ml细胞提取液，混匀，细胞提取液，混匀，6565水浴水浴保温保温20min20min；3.3.取出离心管，加入取出离心管，加入2.5ml 5mol/L 2.5ml 5mol/L KClKCl溶液，混匀，冰浴溶液，混匀，冰浴20min20min；4.4000r/min4.4000r/min 20min20min，并转移上清至另一，并转移上清至另一50ml50ml离心管；离心管；5.5.加等体积酚加等体积酚/氯仿混匀，氯仿混匀，12000r/min12000r/min 5min5min，取上清；，取上清；6.6.加等体积氯仿，混匀，加等体积氯仿，混匀，12000r/min12000r/min 5min5min，取，取上清；上清；7.7.加入加入0.6-10.6-1倍体积的异丙醇（沉淀倍体积的异丙醇（沉淀DNADNA），混匀），混匀8.8.离心获得沉淀，离心获得沉淀，70%70%乙醇洗乙醇洗3 3次。干燥沉淀（不次。干燥沉淀（不要太干，否则要太干，否则DNADNA不易溶解）。不易溶解）。9.9.加入加入200L TE200L TE缓冲液，溶解缓冲液，溶解DNADNA；10.10.上清液就是所需的目的基因上清液就是所需的目的基因DNADNA。参考：参考：分子生物学实验指导分子生物学实验指导（第二版）（第二版）高等教育出版社高等教育出版社 主编：魏群主编：魏群聚合酶链式反应（PCR）1.PCR技术的创建2.PCR的原理3.PCR的反应体系和方法4.PCR技术的近现代运用基因组基因组DNADNA引物引物DNADNA聚合酶聚合酶DNA片段体外扩增PCRPCR技术的创建技术的创建KaryKary B.Mullis B.Mullis（穆利斯（美）（穆利斯（美）Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。Kary B.Mullis（1944）http:/三篇重要论文The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction(Scientific American,1990,262(4):56-61,64-5)Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase(Science,1988,239(4839):487-91)Specific Synthesis of DNA In Vitro via a Polymerase Catalyzed Chain Reaction(Methods in Enzymology,1987,155:335-50)生物样品生物样品生物样品生物样品DNADNA片段片段基基基基因因因因诊诊诊诊断断断断基基基基因因因因治治治治疗疗疗疗基基基基因因因因工工工工程程程程产产产产品品品品法法法法医医医医学学学学检检检检测测测测人人人人类类类类学学学学研研研研究究究究PCR技术诞生所依赖的社会需求和研究需要基因组基因组基因组基因组DNADNA获取特定获取特定获取特定获取特定DNADNA片段片段片段片段扩扩扩扩增增增增特特特特定定定定D DNNA A片片片片段段段段引物引物引物引物Mullis的构思DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶特定特定特定特定DNADNA片段片段片段片段1983年94949494变性变性变性变性50-6550-65退火退火退火退火XX延伸延伸延伸延伸9494949455553737Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)酶酶酶酶活活活活性性性性(%)温度温度温度温度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 207272949494945555PCRPCR循环循环循环循环TaqDNA聚合酶的发现，使整个PCR过程更加的简单化，让整个反应省事、省力、省财。不用在关键环节（变性-褪火-延伸重复）不断的加入反应底物。PCR技术的原理1 PCR技术的基本原理 无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;扩增了特异区段的DNA带。加热加热变变 性性复复性性复温DNA的变性和复性加热或强酸、碱性作用可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性。解除变性的条件后,变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性,也叫退火。PCR扩增原理引物引物引物引物延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸5 55 53 33 3变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火2 PCR技术的特点1）高度的灵敏性30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR产物每轮循环增加一倍2）特异性引物引物 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。引物设计原则：（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40 bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3端为关键碱基；5端无严格限制。3）操作简便易行 PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1g基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。通常的DNA 扩增法是分子克隆法,首先要构建含有目的的基因的载体,然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选;这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程,操作复杂,一般需要数周时间。PCR的反应体系和方法 PCR管加热使模板变性,退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温(72),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。总体积 50-100 l Buffer 缓冲液 dNTP 原料 Primer 引物 DNA分子 模板 Taq酶 DNA聚合酶 1 反应体系PCR技术的基本过程(1)模板模板模板模板DNA DNA dNTPdNTP 引物引物引物引物BufferBuffer预变性预变性模板模板模板模板DNA DNA dNTPdNTP 引物引物引物引物BufferBufferTaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶9494oC52 基本过程PCR技术的基本过程(2)Taq Taq 酶酶酶酶模板模板模板模板DNA DNA dNTPdNTP 引物引物引物引物BufferBuffer循循环环仪仪949455 55 72 72 Taq Taq 酶酶酶酶模板模板模板模板DNA DNA dNTPdNTP 引物引物引物引物BufferBuffer72 572 57 min7 min琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳PCR技术的基本过程(3)1）PCR反应成分（1）模板 单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ng DNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。3 PCR反应条件（2）引物浓度 0.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。2）循环参数(1)变性 (2)使双链DNA解链为单链 94oC 20-30秒(2)退火 温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。（3）延伸 70-75,一般为72 延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加经典循环参数（500bp以内）94 30s 94 30s 55 45s55 45s72 1min72 1min94 5min94 5min30次72 7min72 7min42 forever42 forever全新全新4通道实时荧光定量通道实时荧光定量PCR仪仪 普通梯度普通梯度PCR仪仪PCRPCR技术的应用技术的应用1)1)基因克隆基因克隆重组重组DNADNA质粒质粒DNADNA基因片段基因片段大肠杆菌大肠杆菌胰岛素胰岛素重组体+胰岛素胰岛素基因基因基因基因基因工程产品基因工程产品55Bam H IBam H IBam H IBam H IBam H IBam H IBam H IBam H IG GT TC CC CG GG GA AC CC CC CT TG GC CA AG GG GG GT TC CC CG GG GA AC CC CC CT TG GC CA AG GG GCCTGCCTGGGACGGACGTCCGTCCCAGGCAGG质粒质粒DNADNA目的基因目的基因限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶2)基因检测A内源内源性病变基因性病变基因正常人A病 人病原微生物基因正常人 (-)病 人 (+)遗传病的诊断遗传病的诊断 基因缺失、插入或置换等基因缺失、插入或置换等地中海贫血地中海贫血珠蛋白链合成不平衡珠蛋白链合成不平衡A正常人正常人正常人正常人病病病病 人人人人正正正正常常常常病病病病人人人人ASOASO探针法探针法A A A AC C C CT T T TG G G GASOASOASOASO探针探针探针探针正常正常正常正常病人病人病人病人PCR-ASO检测基因点突变:主是利用PCR技术扩增靶基因的适当片段,然后用人工合成的含突变位点的标记寡核苷酸探针杂交探针杂交NC膜探针正常人突变纯合突变纯合子子突变杂合子突变杂合子PCR-RFLP法：限制性内切酶限制性内切酶恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）Ras基因突变限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶正常正常正常正常突变突变突变突变电电泳泳 HLA系统基因分型 PCR-RFLP法PCR-SSO法PCR-SSCPPCR-PCR-SSPSSP3)基因配型 PCR-SSP1 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 8PCRPCR1 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 8引物特异性（序列特异性引物-PCR技术）4）基因鉴定女女性性男男性性Y Y引物引物PCR男性男性 女性女性法医学分析 个体识别、亲缘鉴定方法：PCR-RFLP DNA遗传指纹 PCR-ASO PCR-VNTR多态性 PCR-SSCP 线粒体DNA测序PCR-VNTR多态性检测PCRPCR；电泳检测电泳检测（VNTRVNTR：数目可变的串联重复序列）琼脂糖凝胶电泳1.1.操作简单，电泳速度快，样品不需要事先处理；操作简单，电泳速度快，样品不需要事先处理；2.2.凝胶结构均匀，含水量大，近似自由电泳，样品扩散度凝胶结构均匀，含水量大，近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳小，对样品吸附微笑，因此图谱清晰，分辨较自由电泳小，对样品吸附微笑，因此图谱清晰，分辨率高，重复性好；率高，重复性好；3.3.琼脂糖凝胶无紫外吸收，所以电泳过程和结果可以直接琼脂糖凝胶无紫外吸收，所以电泳过程和结果可以直接用紫外检测和定量分析；用紫外检测和定量分析；4.4.电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测量，制成电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测量，制成干膜可以长期保存。干膜可以长期保存。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）1.1.在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；2.2.化学性能稳定，与被分离物不起化学反应；化学性能稳定，与被分离物不起化学反应；3.3.对对PHPH值和温度变化稳定；值和温度变化稳定；4.4.几乎无电渗作用，只要几乎无电渗作用，只要AcrAcr（丙烯酰胺）纯度高，操作（丙烯酰胺）纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；条件一致，则样品分离重复性好；5.5.凝胶孔径可调节，跑胶过程更加自由；凝胶孔径可调节，跑胶过程更加自由；6.6.样品不已扩散，且用量少；样品不已扩散，且用量少；7.7.比琼脂糖凝胶电泳拥有更高的分辨率比琼脂糖凝胶电泳拥有更高的分辨率 现 嫌1 嫌2 嫌3父父父父 父父父父 子子子子 母母母母DNA条形码在植物中的研究现状n n为了寻求一种通用的植物条形许多学者进行为了寻求一种通用的植物条形许多学者进行为了寻求一种通用的植物条形许多学者进行为了寻求一种通用的植物条形许多学者进行了积极的探索，已出了多种条形码片段或组了积极的探索，已出了多种条形码片段或组了积极的探索，已出了多种条形码片段或组了积极的探索，已出了多种条形码片段或组合方但至今仍没有达成明确的共识。条形码合方但至今仍没有达成明确的共识。条形码合方但至今仍没有达成明确的共识。条形码合方但至今仍没有达成明确的共识。条形码联盟联盟联盟联盟(CBOL)(CBOL)(CBOL)(CBOL)最初建议了最初建议了最初建议了最初建议了6 6 6 6段作为候选片段：段作为候选片段：段作为候选片段：段作为候选片段：matKmatKmatKmatK、rpoC1rpoC1rpoC1rpoC1、B B B B、accDaccDaccDaccD、nhdJnhdJnhdJnhdJ和和和和YCF5YCF5YCF5YCF5。n nKressKressKressKress等等等等(2005)(2005)(2005)(2005)通过对通过对通过对通过对53535353科科科科88888888属属属属99999999个物种的个物种的个物种的个物种的9 9 9 9个质体基因片段个质体基因片段个质体基因片段个质体基因片段(trnK-rps16(trnK-rps16(trnK-rps16(trnK-rps16、trnH-psbAtrnH-psbAtrnH-psbAtrnH-psbA、rp136-rps8rp136-rps8rp136-rps8rp136-rps8、atpB-rbcLatpB-rbcLatpB-rbcLatpB-rbcL、ycf6-psbMycf6-psbMycf6-psbMycf6-psbM、trnV-atpEtrnV-atpEtrnV-atpEtrnV-atpE、trnC-ycf6trnC-ycf6trnC-ycf6trnC-ycf6、psbM-trnDpsbM-trnDpsbM-trnDpsbM-trnD和和和和trnL-trnL-trnL-trnL-trnFtrnFtrnFtrnF)和核基因和核基因和核基因和核基因ITSITSITSITS序列进行分析，提出了片序列进行分析，提出了片序列进行分析，提出了片序列进行分析，提出了片段组合方案段组合方案段组合方案段组合方案,并预测并预测并预测并预测ITS+trnH-psbAITS+trnH-psbAITS+trnH-psbAITS+trnH-psbA组合将在组合将在组合将在组合将在有花植物有花植物有花植物有花植物(flowering plants)(flowering plants)(flowering plants)(flowering plants)中有较广泛的中有较广泛的中有较广泛的中有较广泛的应用价值。应用价值。应用价值。应用价值。DNA条形码在植物中的研究现状n n现有的研究报道了在现有的研究报道了在2种组合方案中选种组合方案中选择片段的方法，分别是择片段的方法，分别是Chase等等(2005)提出的交通灯法提出的交通灯法(traffic light approach)和和Newmaster等等(2006)提提出的等级出的等级(tier)分类法分类法。DNA条形码在植物中的研究现状n n2007200720072007年年年年9 9 9 9月，在第二届国际生命条形码大会月，在第二届国际生命条形码大会月，在第二届国际生命条形码大会月，在第二届国际生命条形码大会上，总结了上，总结了上，总结了上，总结了5 5 5 5种片段组合：种片段组合：种片段组合：种片段组合：ChaseChaseChaseChase等等等等(2007)(2007)(2007)(2007)提提提提出的出的出的出的rpoC1+rpoB+matKrpoC1+rpoB+matKrpoC1+rpoB+matKrpoC1+rpoB+matK或或或或rpoC1+matK+trnH-rpoC1+matK+trnH-rpoC1+matK+trnH-rpoC1+matK+trnH-psbApsbApsbApsbA；KressKressKressKress和和和和Erickson(2007)Erickson(2007)Erickson(2007)Erickson(2007)提出的提出的提出的提出的rbcL+trnH-psbArbcL+trnH-psbArbcL+trnH-psbArbcL+trnH-psbA，其可以对陆生植物进行识，其可以对陆生植物进行识，其可以对陆生植物进行识，其可以对陆生植物进行识别和鉴定。韩国植物学家别和鉴定。韩国植物学家别和鉴定。韩国植物学家别和鉴定。韩国植物学家Ki-JoongKi-JoongKi-JoongKi-Joong Kim Kim Kim Kim等提等提等提等提出的出的出的出的matK+atpF-atpH+psbK-psbImatK+atpF-atpH+psbK-psbImatK+atpF-atpH+psbK-psbImatK+atpF-atpH+psbK-psbI或或或或matK+atpF-atpH+trnHpsbA(Pennisi,2007)matK+atpF-atpH+trnHpsbA(Pennisi,2007)matK+atpF-atpH+trnHpsbA(Pennisi,2007)matK+atpF-atpH+trnHpsbA(Pennisi,2007)DNA条形码在植物中的研究现状 DNA条形码在药用植物鉴定中的应用展望n nDNADNADNADNA条形码已经在动物中得到广泛应用，在条形码已经在动物中得到广泛应用，在条形码已经在动物中得到广泛应用，在条形码已经在动物中得到广泛应用，在植物中的研究也正在快速开展，这将有助于植物中的研究也正在快速开展，这将有助于植物中的研究也正在快速开展，这将有助于植物中的研究也正在快速开展，这将有助于非分类学专业工作者对有关材料进行快速、非分类学专业工作者对有关材料进行快速、非分类学专业工作者对有关材料进行快速、非分类学专业工作者对有关材料进行快速、准确的鉴定，尤其是对于药材的鉴定。由于准确的鉴定，尤其是对于药材的鉴定。由于准确的鉴定，尤其是对于药材的鉴定。由于准确的鉴定，尤其是对于药材的鉴定。由于各片段各片段各片段各片段(尤其是多片段的组合选择尤其是多片段的组合选择尤其是多片段的组合选择尤其是多片段的组合选择)在不同类在不同类在不同类在不同类群中的应用效果不同，群中的应用效果不同，群中的应用效果不同，群中的应用效果不同，目前尚未获得一致的目前尚未获得一致的目前尚未获得一致的目前尚未获得一致的植物条形码标准片段植物条形码标准片段植物条形码标准片段植物条形码标准片段，因此，因此，因此，因此，当前的研究热当前的研究热当前的研究热当前的研究热点仍然是选择和评价可能的条形码片段，进点仍然是选择和评价可能的条形码片段，进点仍然是选择和评价可能的条形码片段，进点仍然是选择和评价可能的条形码片段，进行更大规模的分析和整体评价。行更大规模的分析和整体评价。行更大规模的分析和整体评价。行更大规模的分析和整体评价。DNA条形码在药用植物鉴定中的应用展望n nDNADNADNADNA条形码有助于非分类学专业工作者对有条形码有助于非分类学专业工作者对有条形码有助于非分类学专业工作者对有条形码有助于非分类学专业工作者对有关材料进行快速、准确的鉴定，尤其是对于关材料进行快速、准确的鉴定，尤其是对于关材料进行快速、准确的鉴定，尤其是对于关材料进行快速、准确的鉴定，尤其是对于药材的鉴定。由于各片段药材的鉴定。由于各片段药材的鉴定。由于各片段药材的鉴定。由于各片段(尤其是多片段的尤其是多片段的尤其是多片段的尤其是多片段的组合选择组合选择组合选择组合选择)在不同类群中的应用效果不同，在不同类群中的应用效果不同，在不同类群中的应用效果不同，在不同类群中的应用效果不同，目前尚未获得一致的植物条形码标准片段目前尚未获得一致的植物条形码标准片段目前尚未获得一致的植物条形码标准片段目前尚未获得一致的植物条形码标准片段，因此，因此，因此，因此，当前的研究热点仍然是选择和评价可当前的研究热点仍然是选择和评价可当前的研究热点仍然是选择和评价可当前的研究热点仍然是选择和评价可能的条形码片段，进行更大规模的分析和整能的条形码片段，进行更大规模的分析和整能的条形码片段，进行更大规模的分析和整能的条形码片段，进行更大规模的分析和整体评价。体评价。体评价。体评价。DNA条形码在药用植物鉴定中的应用展望n n目前，目前，目前，目前，DNADNADNADNA条形码以其快速、准确和自动化，条形码以其快速、准确和自动化，条形码以其快速、准确和自动化，条形码以其快速、准确和自动化，在生物物种鉴定领域的研究方兴未艾，而在在生物物种鉴定领域的研究方兴未艾，而在在生物物种鉴定领域的研究方兴未艾，而在在生物物种鉴定领域的研究方兴未艾，而在药材鉴定中的应用尚处于萌芽状态。如能将药材鉴定中的应用尚处于萌芽状态。如能将药材鉴定中的应用尚处于萌芽状态。如能将药材鉴定中的应用尚处于萌芽状态。如能将DNADNADNADNA条形码用于市场品种混乱的多来源药材条形码用于市场品种混乱的多来源药材条形码用于市场品种混乱的多来源药材条形码用于市场品种混乱的多来源药材的鉴定，弥补其在药材质量评价方面的不足，的鉴定，弥补其在药材质量评价方面的不足，的鉴定，弥补其在药材质量评价方面的不足，的鉴定，弥补其在药材质量评价方面的不足，可形成能够全面反映生药的生物基原、质量、可形成能够全面反映生药的生物基原、质量、可形成能够全面反映生药的生物基原、质量、可形成能够全面反映生药的生物基原、质量、产地等信息的产地等信息的产地等信息的产地等信息的DNADNADNADNA条形码系统；该系统条形码系统；该系统条形码系统；该系统条形码系统；该系统不仅不仅不仅不仅能够用于药材的鉴定与质量评价，还可以探能够用于药材的鉴定与质量评价，还可以探能够用于药材的鉴定与质量评价，还可以探能够用于药材的鉴定与质量评价，还可以探讨原植物间的亲缘关系及系统发育。讨原植物间的亲缘关系及系统发育。讨原植物间的亲缘关系及系统发育。讨原植物间的亲缘关系及系统发育。DNA条形码在药用植物鉴定中的应用展望n n远景预期技术成熟后可形成供企业使用的药远景预期技术成熟后可形成供企业使用的药远景预期技术成熟后可形成供企业使用的药远景预期技术成熟后可形成供企业使用的药材生产标准，在进货时以材生产标准，在进货时以材生产标准，在进货时以材生产标准，在进货时以DNADNADNADNA条形码系统进条形码系统进条形码系统进条形码系统进行质量控制，在药材成品上标识行质量控制，在药材成品上标识行质量控制，在药材成品上标识行质量控制，在药材成品上标识DNADNADNADNA条形码，条形码，条形码，条形码，质检部门可对其进行验证判断真伪及是否符质检部门可对其进行验证判断真伪及是否符质检部门可对其进行验证判断真伪及是否符质检部门可对其进行验证判断真伪及是否符合生药质量标准。合生药质量标准。合生药质量标准。合生药质量标准。DNA条形码在药用植物鉴定中的应用展望n n随随随随着着着着DNADNADNADNA条条条条形形形形码码码码技技技技术术术术的的的的飞飞飞飞速速速速发发发发展展展展，可可可可以以以以预预预预见见见见地地地地球球球球上上上上几几几几乎乎乎乎所所所所有有有有生生生生物物物物种种种种类类类类都都都都将将将将具具具具备备备备唯唯唯唯一一一一的