高通量测序技术简介.pptx

高通量测序技术简介 高通量测序技术简介 高通量测序技术又称高通量测序技术又称“下一代下一代”测序测序技术技术，以能一次并行对几十万到几百万条以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。目前用于微生物群落多样性研究为标志。目前用于微生物群落多样性研究的高通量测序平台主要有来自罗氏公司的的高通量测序平台主要有来自罗氏公司的454法法、Illumina公司公司Solexa法和法和ABI的的SOLiD法法罗氏454法测序原理 GS FLX GS FLX系统的测序原理是基于焦磷酸系统的测序原理是基于焦磷酸测序法，依靠生物发光对测序法，依靠生物发光对DNADNA序列进行检测。序列进行检测。在在DNADNA聚合酶，聚合酶，ATPATP硫酸化酶，荧光素酶和硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，双磷酸酶的协同作用下，GSFLXGSFLX系统将引物系统将引物上每一个上每一个dNTPdNTP的聚合与一次荧光信号释放的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。通过检测荧光信号释放的有无偶联起来。通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定和强度，就可以达到实时测定DNADNA序列的目序列的目的。的。罗氏454法测序流程样品样品DNADNA打断：样品如基因组打断：样品如基因组DNADNA或或BACBAC等被打断成等被打断成300300到到800bp800bp的片段的片段加接头：借助一系列标准的分子生物学技术，将加接头：借助一系列标准的分子生物学技术，将33端和端和55端有特异性的端有特异性的A A和和B B接头连接到接头连接到DNADNA片段上。接头也将在片段上。接头也将在后继的纯化，扩增和测序步骤中用到后继的纯化，扩增和测序步骤中用到一条一条DNADNA片段片段=一个磁珠：接头使成百上千条一个磁珠：接头使成百上千条DNADNA片段分别片段分别结合到一个磁珠上，磁珠被单个油水混合小滴包被后，在结合到一个磁珠上，磁珠被单个油水混合小滴包被后，在这个小滴里进行独立的扩增，从而实现了所有这个小滴里进行独立的扩增，从而实现了所有DNADNA片段进片段进行平行扩增（行平行扩增（emPCRemPCR）。）。一个磁珠一个磁珠=一条读长：经过一条读长：经过emPCRemPCR扩增后富集，这些片段仍扩增后富集，这些片段仍然和磁珠结合在一起，随后就可以放入到然和磁珠结合在一起，随后就可以放入到Pico Titer Pico Titer PlatePlate板中供后继测序使用了。板中供后继测序使用了。Solexa测序法原理Solexa测序技术其的核心思想感是边合测序技术其的核心思想感是边合成边测序。即生成新成边测序。即生成新DNA互补链时，要么互补链时，要么加入的加入的dNTP通过酶促级联反应崔化底物激通过酶促级联反应崔化底物激发出荧光，要么直接加入被荧光标记的发出荧光，要么直接加入被荧光标记的dNTP或半简并引物，在合成或连接生成互或半简并引物，在合成或连接生成互补链时，释放出荧光信号。通过捕获光信补链时，释放出荧光信号。通过捕获光信号并转化为一个测序峰值，获得互补链序号并转化为一个测序峰值，获得互补链序列信息。列信息。Solexa测序法测序流程1.添加接头：利用添加接头：利用物理方法将待测样物理方法将待测样品品DNA打碎，在单打碎，在单链链DNA碎片两端加碎片两端加上接头上接头表面结合：表面结合：Solexa的的测序时利用微注射系测序时利用微注射系统将已经加过接头和统将已经加过接头和待测片断随机添加到待测片断随机添加到玻璃玻璃FlowCell内，每内，每一个一个FlowCell又补分又补分成成8条条Lane，每条，每条Lane的内表面上能与的内表面上能与共价键的形式随机固共价键的形式随机固定单链接头序列和带定单链接头序列和带接头的单链待测接头的单链待测DNA片断片断 3.3.桥型扩增循环获桥型扩增循环获得多拷贝待测得多拷贝待测DNADNA片片断断:在在Flow cellFlow cell内加内加入未被标记的入未被标记的dNTPdNTP和和酶起始固相桥型扩增。酶起始固相桥型扩增。所有单链桥型待测片所有单链桥型待测片段被扩增成双链桥片段被扩增成双链桥片断，通过变性，释放断，通过变性，释放出互补的单链，锚定出互补的单链，锚定到附近的固相表面。到附近的固相表面。通过不断循环，将会通过不断循环，将会在在Flow cellFlow cell的固相的固相表面上获得上百万条表面上获得上百万条成簇分布的双链待测成簇分布的双链待测片断。片断。四种荧光标记的染料应用边合成边测序（四种荧光标记的染料应用边合成边测序（SequencingBySynthesis）的原理，在每个循）的原理，在每个循环过程里，荧光标记的核苷和聚合酶被加入到环过程里，荧光标记的核苷和聚合酶被加入到单分子阵列中。互补的核苷和核苷酸片断的第单分子阵列中。互补的核苷和核苷酸片断的第一个一个碱基配对碱基配对，通过酶加入到引物上。多余的，通过酶加入到引物上。多余的核苷被移走。这样每个单链核苷被移走。这样每个单链DNA分子通过分子通过互互补碱基补碱基的配对被延伸，利用的配对被延伸，利用生物发光生物发光蛋白，比蛋白，比如如萤火虫萤火虫的的荧光素酶荧光素酶，可通过，可通过碱基碱基加到引物后加到引物后端时所释放出的端时所释放出的焦磷酸盐焦磷酸盐来提供检测信号。针来提供检测信号。针对每种碱基的特定波长的激光激发结合上的核对每种碱基的特定波长的激光激发结合上的核苷的标记，这个标记会释放出荧光。荧光信号苷的标记，这个标记会释放出荧光。荧光信号被被CCD采集，采集，CCD快速扫描整个阵列检测特快速扫描整个阵列检测特定的结合到每个片断上的碱基。通过上述的结定的结合到每个片断上的碱基。通过上述的结合，检测可以重复几十个循环，这样就有可能合，检测可以重复几十个循环，这样就有可能决定核苷酸片断中的几十个碱基。决定核苷酸片断中的几十个碱基。SOLiD测序法简介SOLiD全称为全称为supportedoligoligationdetetion，它的独特之处在于以四色荧光标记，它的独特之处在于以四色荧光标记寡核苷酸的连续连接合成为基础，取代了传统寡核苷酸的连续连接合成为基础，取代了传统的聚合酶连接反应，可对单拷贝的聚合酶连接反应，可对单拷贝DNA片段进行片段进行大规模扩增和高通量并行测序。大规模扩增和高通量并行测序。三种测序法比较 3 3 个平台的测序方法虽然各具特点，但在原理上有个平台的测序方法虽然各具特点，但在原理上有很多的共同之处主要表现为很多的共同之处主要表现为:可将目标可将目标 DNADNA剪切为小片剪切为小片段段;单个小片段单个小片段 DNA DNA 分子结合到固相表面分子结合到固相表面;进行单分子进行单分子独立扩增独立扩增;每次只复制一次并检测信号每次只复制一次并检测信号;具有高分辨率具有高分辨率的成像系统的成像系统;高的输出量和高解析度。高的输出量和高解析度。高通量测序技术在宏基因组学中的应用基于基于 16S rRNA 16S rRNA 的微生物群落分析的微生物群落分析基于宏基因组的功能基因分析基于宏基因组的功能基因分析基于宏转录组的群落转录调控规律分析基于宏转录组的群落转录调控规律分析单细胞分离及宏基因组研究单细胞分离及宏基因组研究Thank you!