HE染色不良的常见问题与对策课件.ppt
染色不良的常见问题与对策一、切片脱蜡后出现大片白色的斑点一、切片脱蜡后出现大片白色的斑点原因原因:由于烤(烘)片温度太低,玻片在脱蜡前没有充分烤(烘)干；切片在二甲苯停留时间不足,或二甲苯使用过久,造成脱蜡不尽。对策对策:如果玻片是由于没有烤(烘),先用无水乙醇处理去除玻片上的水分,然后重新用二甲苯脱去石蜡。如果烤(烘)干不足的现象比较严重,可能导致切片脱落,则无法补救。如果白色斑点是由于切片在二甲苯停留时间不足造成,或使用的二甲苯过久,切片则需退回到二甲苯停留时间相对长些,或更换二甲苯,脱色、漂白、重新染色。二、细胞核染色苍白、暗淡二、细胞核染色苍白、暗淡原因原因:即苏木精染色太淡，此类问题可能有3个影响因素,切片在苏木精染色液停留时间太短；苏木精染色液过度氧化,失去染色能力,不能再继续使用；分化步骤处理时间过长。如果是骨组织细胞核暗淡,则多数是由于脱钙过度造成。对策对策:切片重新染色。如果组织在酸性固定液如Zenker、Bouin及非中性缓冲甲醛液固定时间过长,细胞核染色能力将减弱,须增加其在苏木精染色液的时间,或用一些方法增加组织的嗜碱性,以改善细胞核的着色。三、细胞核过染三、细胞核过染原因原因:即苏木精染色太深,甚至苏木精染液的分布占据了细胞质的位置。此类问题可能有3个影响因素,即切片在苏木精染色液停留过长、切片太厚、分化步骤时间太短。对策对策:如果切片不是因为太厚(用显微镜仔细上下调节微调,只有一二层细胞核层次),脱色、漂白、重新染色,对于染色和分化时间做些适当的调整。如果确定是由于切片太厚导致的细胞核过染,则需要重新切片。四、细胞核呈红、棕色改变四、细胞核呈红、棕色改变原因原因:主要有苏木精染色液过度氧化和切片在苏木精染液染色后返蓝不足。对策对策:首先,每次染色之前检查苏木精染色液的染色能力,发现氧化过度应及时更换。其次,可用流水、温水或弱碱性溶液如稀氨水、0.2%碳酸氢钠等,在苏木精染色后,给切片以足够的蓝化时间。五、伊红着色淡五、伊红着色淡原因原因:伊红染液的pH值可能大于5；也可能是蓝化液残留过多；切片太薄；或切片经伊红染色后在乙醇脱水时间过长。对策对策:检查伊红染液的pH值,如果必要的话,用乙酸将其调节在416510之间,从而使伊红染色色彩艳丽。确保每次蓝化步骤完成后,使用的弱碱性溶液被充分洗去,玻片上没有残留的弱碱性溶液。检查切片的厚度。脱水时不要让切片在低浓度乙醇停留时间过长,因为含水多的低浓度乙醇会将伊红的颜色分化掉。六、细胞质过染、分色不足六、细胞质过染、分色不足原因原因:伊红染色液浓度太高,特别是焰红燃料、四溴四氯荧光素钠的存在；切片在伊红染色时间过长；切片在伊红染色后经乙醇脱水步骤时过的太快,而使乙醇分化伊红的作用不能产生。对策对策:适当稀释伊红染色液,减少伊红染色时间,或者使切片在乙醇脱水等步骤时,停留时间相对均匀。同样,也要检查切片的厚度是否合适。七、切片中出现蓝黑色沉淀物七、切片中出现蓝黑色沉淀物原因原因:苏木精染色液中的金属膜,黏附在玻片上。对策对策:每天染色前仔细过滤苏木精染色液,或建议使用半氧化苏木精染色液,如Gill苏木精染色液,可以避免过多的金属膜产生。八、显微镜下见切片内有大量水珠八、显微镜下见切片内有大量水珠原因原因:切片经梯度乙醇处理后没有完全脱水,导致二甲苯透明中性树胶封固后残留大量水分。对策对策:移去盖玻片,用二甲苯溶解封固剂如中性树胶。将切片置入新鲜的无水乙醇换几道。待切片重新脱水完全后,用新二甲苯透明,中性树胶封固。所有用于脱水和透明的液体,在使用一定时间以后,应即时更换。九、光镜下切片某些区域难以聚焦九、光镜下切片某些区域难以聚焦原因原因:盖玻片上可能有封固切片的封固剂。对策对策:移去盖玻片,重新用干净的盖玻片封片。检查切片封片方法,是人工手工封法,还是机器自动封法,如有问题及时调整。十、封固剂从盖玻片与载玻片之间的缝十、封固剂从盖玻片与载玻片之间的缝隙回缩隙回缩原因原因:盖玻片弯曲或不平整;封固剂含二甲苯过多,稀释过度。对策对策:移去盖玻片,重新找一张盖玻片,用干净的封固剂封片。如用手工封片法,每天保证盛装封固剂的容器,在封固结束的时候盖紧盖子。尽量使用小的容器盛装封固剂,一旦封固剂太粘稠,就可以废弃不再使用。十一、水和玻片呈现乳白色混浊改变十一、水和玻片呈现乳白色混浊改变原因原因:切片从脱蜡的二甲苯经过梯度乙醇进入水溶液时,水和玻片呈现乳白色混浊改变，是用于脱蜡的二甲苯没有被乙醇洗干净。对策对策:更换洗涤二甲苯的乙醇液体,把切片重新放回无水乙醇,脱去玻片上的水分。十二、细胞核灰蓝十二、细胞核灰蓝原因原因:可能的原因是由于组织处理温度过高、过热,在石蜡停留的时间过长；或者固定时间太短,接下来就直接在高浓度的乙醇中行脱水处理。对策对策:理论上来说,加热处理仅在组织浸蜡步骤才使用,组织不能在热的蜡液中停留过长时间。如果由于某些原因不能进行下步包埋处理,完成浸蜡处理后的组织,可将组织连同塑料包埋盒一并放置在室温空气中,冷却凝固,以备包埋。待需要包埋时再重新加温直至石蜡融化即可。组织在处理前必须确保固定良好,脱水最好能从低浓度的乙醇开始。十三、从小斑点到大面积区域散布，细胞核十三、从小斑点到大面积区域散布，细胞核染色质不够细致染色质不够细致原因原因:HE染色不规则或不均匀,从小斑点到大面积区域,散布切片各处,细胞核染色质不够细致。由于使用密闭式组织处理机故障,如密闭不严,导致组织浸蜡时含有水和(或)固定剂。对策对策:如果使用开放式组织处理模式,在相对湿度较高的地方,用甲苯替代二甲苯。如果使用密闭式组织处理模式,经常仔细检查仪器设备的各项功能是否完好,一旦发现密闭垫圈老化,应及时更换。十四、裸核改变十四、裸核改变原因原因:切片中出现类似色素样的点状结晶和黑色光滑的细胞核，切片封片前放置在空气中时间太长,以至于二甲苯挥发切片干燥所致。对策对策:在染色过程中不宜让切片干涸，染色后不要直接把切片置入烤箱烤干或吹风吹干，待自然干燥后中性树胶封固即可。或者将出现“裸核”的切片，移去盖玻片，经透明剂稍浸片刻后取出，适当晾干，中性树胶封固，“裸核”即消失。谢谢！
