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第三章液相色谱质谱第三章液相色谱质谱联用技术联用技术本讲稿第一页，共七十三页n n液液质质联联用用(LC-MS)主主要要可可解解决决如如下下几几方方面面的的问问题题：不不挥挥发发性性化化合合物物分分析析测测定定；极极性性化化合合物物的的分分析析测测定定；热热不不稳稳定定化化合合物物的的分分析析测测定定；大大分分子子量量化化合合物物（包包括括蛋蛋白白、多多肽肽、多多聚聚物物等等）的的分分析析测测定定；没没有有商商品品化化的的谱谱库库可可对对比比查询，只能自己建库或自己解析谱图。查询，只能自己建库或自己解析谱图。本讲稿第二页，共七十三页液相色谱液相色谱-质谱联用要解决的重要问题质谱联用要解决的重要问题n液相色谱流动相对质谱工作条件的影液相色谱流动相对质谱工作条件的影响响n质谱离子源温度对液相色谱分析源的质谱离子源温度对液相色谱分析源的影响影响 本讲稿第三页，共七十三页一、一、LC-MS联用的接口技术联用的接口技术n n常常常常用用用用于于于于液液液液相相相相色色色色谱谱谱谱 质质质质谱谱谱谱联联联联用用用用技技技技术术术术的的的的接接接接口口口口主主主主要要要要有有有有移移移移动动动动带带带带技技技技术术术术（MBMB）、热热热热喷喷喷喷雾雾雾雾接接接接口口口口、粒粒粒粒子子子子束束束束接接接接口口口口（PBPB）、快快快快原原原原子子子子轰轰轰轰击击击击（FABFAB）、电电电电喷喷喷喷雾雾雾雾接接接接口（口（口（口（ESIESI）等。其中，电喷雾接口的应用极为广泛。）等。其中，电喷雾接口的应用极为广泛。）等。其中，电喷雾接口的应用极为广泛。）等。其中，电喷雾接口的应用极为广泛。n n1.电喷雾（电喷雾（ESI）n n1）特点特点：具有高的离子化效率，对蛋白质而言接近具有高的离子化效率，对蛋白质而言接近100%；有多种离子化模式可供选择；对蛋白质而言，稳；有多种离子化模式可供选择；对蛋白质而言，稳定的多电荷离子的产生，使蛋白质分子量测定范围可高定的多电荷离子的产生，使蛋白质分子量测定范围可高达几十万甚至上百万；达几十万甚至上百万；“软软”离子化方式使热不稳定化离子化方式使热不稳定化合物得以分析并产生高丰度的准分子离子峰。合物得以分析并产生高丰度的准分子离子峰。本讲稿第四页，共七十三页n n2）ESI接口的结构接口的结构n nESI 源主要由五部分组成：（源主要由五部分组成：（1）流动相导）流动相导入装置；（入装置；（2）真正的大气压离子化区域；）真正的大气压离子化区域；（3）离子取样孔；（）离子取样孔；（4）大气压到真空的界）大气压到真空的界面；（面；（5）离子光学系统。）离子光学系统。本讲稿第五页，共七十三页本讲稿第六页，共七十三页n n电喷雾电喷雾：现在常见的喷嘴是内径为：现在常见的喷嘴是内径为：现在常见的喷嘴是内径为：现在常见的喷嘴是内径为0.1mm 0.1mm 的金属毛细管。的金属毛细管。的金属毛细管。的金属毛细管。在它上面施加在它上面施加在它上面施加在它上面施加3 38kV 8kV 的电压时。由于毛细管的顶端很窄，的电压时。由于毛细管的顶端很窄，的电压时。由于毛细管的顶端很窄，的电压时。由于毛细管的顶端很窄，形成的电场强度可高达形成的电场强度可高达形成的电场强度可高达形成的电场强度可高达10106 6 V/m。当流速为。当流速为0.55Lmin 的的LC 流出物溢出金属毛细管顶端时，会形成扇状流出物溢出金属毛细管顶端时，会形成扇状喷雾。它是细小的液珠和溶剂蒸气的混合体。由于高喷雾。它是细小的液珠和溶剂蒸气的混合体。由于高压电场的作用，溶液中带某种电荷的溶质会向液体表压电场的作用，溶液中带某种电荷的溶质会向液体表面移动，使液珠表面该种电荷过剩。表面过量电荷的面移动，使液珠表面该种电荷过剩。表面过量电荷的正负，视施加在毛细管电极上的电压正负而定。正负，视施加在毛细管电极上的电压正负而定。本讲稿第七页，共七十三页n n离子的形成离子的形成：当表面带有大量电荷的精细液：当表面带有大量电荷的精细液珠向下游移动时，溶剂迅速蒸发，液珠表面珠向下游移动时，溶剂迅速蒸发，液珠表面积不断缩小，电荷密度增高。当此情况达到积不断缩小，电荷密度增高。当此情况达到Rayleigh 极限时，液珠会分裂成更小的液珠极限时，液珠会分裂成更小的液珠。在质量和电荷重新再分配后，更小的液珠。在质量和电荷重新再分配后，更小的液珠进入稳定态；然后再重复蒸发、电荷过剩和进入稳定态；然后再重复蒸发、电荷过剩和液珠分裂。在整个过程的某个阶段，分析物液珠分裂。在整个过程的某个阶段，分析物可以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。可以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。本讲稿第八页，共七十三页n n离子的输送离子的输送离子的输送离子的输送：大气压条件下形成的离子，在电位差的：大气压条件下形成的离子，在电位差的趋使下（当然也有压力差的作用）趋使下（当然也有压力差的作用）,通过取样孔通过取样孔（sampling cone）进入质谱真空区。离子流通过一个）进入质谱真空区。离子流通过一个加热的金属毛细管，进入第一个降压区，在毛细管的加热的金属毛细管，进入第一个降压区，在毛细管的出口处形成超声速喷射流。由于分析物带电荷并且动出口处形成超声速喷射流。由于分析物带电荷并且动量大，可通过下游处于低电位的锥形分离器的小孔，量大，可通过下游处于低电位的锥形分离器的小孔，进入第二降压区，经聚焦后进入质谱。而与分析物离进入第二降压区，经聚焦后进入质谱。而与分析物离子一同穿过毛细管的少量的溶剂，由于呈电中性而且子一同穿过毛细管的少量的溶剂，由于呈电中性而且动量小，则在第一和第二降压区被抽走。动量小，则在第一和第二降压区被抽走。本讲稿第九页，共七十三页电喷雾电离源电喷雾电离源 ESINeedle喷雾针喷雾针多层套管构成多层套管构成溶液溶液雾化气（雾化气（N2/Air）Nebulizing Gas干燥气干燥气干燥气干燥气Drying GasDrying Gas（NN22）加快溶剂挥发加快溶剂挥发本讲稿第十页，共七十三页电喷雾电离源电喷雾电离源 ESITaylor锥锥库库 仑仑 分分 裂裂Rayleigh稳定限稳定限形成正形成正/负气相离子负气相离子被吸入质量分析器被吸入质量分析器本讲稿第十一页，共七十三页n n电喷雾接口的主要缺点是它只能接受非常小电喷雾接口的主要缺点是它只能接受非常小的液体流量（的液体流量（110Lmin1）n n 将气动辅助电喷雾技术运用在接口中，将气动辅助电喷雾技术运用在接口中，使使得接口可与大流量（约得接口可与大流量（约1mLmin1）的）的HPLC联机使用联机使用本讲稿第十二页，共七十三页2.大气压化学电离源（大气压化学电离源（APCI）n n大气压化学离子化（大气压化学离子化（APCI）技术应用于液）技术应用于液-质联用仪是由质联用仪是由Horning 等人于等人于20 世纪世纪70 年年代初发明的，代初发明的，20 世纪世纪80 年代末得到突飞猛年代末得到突飞猛进的发展，与进的发展，与ESI 源的发展基本上是同步的。源的发展基本上是同步的。但是但是APCI 技术不同于传统的化学电离接口，技术不同于传统的化学电离接口，它是它是借助于电晕放电启动一系列气相反应以借助于电晕放电启动一系列气相反应以完成离子化过程完成离子化过程，因此也称为放电电离或等，因此也称为放电电离或等离子电离。离子电离。本讲稿第十三页，共七十三页n n大气压化学电离是将化学电离原理延伸到大气压下进行的一种新大气压化学电离是将化学电离原理延伸到大气压下进行的一种新大气压化学电离是将化学电离原理延伸到大气压下进行的一种新大气压化学电离是将化学电离原理延伸到大气压下进行的一种新的软电离技术，样品溶液从的软电离技术，样品溶液从的软电离技术，样品溶液从的软电离技术，样品溶液从LCLC流出被气化后，溶剂分子在电晕流出被气化后，溶剂分子在电晕流出被气化后，溶剂分子在电晕流出被气化后，溶剂分子在电晕放电探针处形成反应气等离子体，样品分子与反应气等离子体进放电探针处形成反应气等离子体，样品分子与反应气等离子体进放电探针处形成反应气等离子体，样品分子与反应气等离子体进放电探针处形成反应气等离子体，样品分子与反应气等离子体进行质子交换被电离，形成准分子离子行质子交换被电离，形成准分子离子行质子交换被电离，形成准分子离子行质子交换被电离，形成准分子离子M+HM+H+或或或或M-HM-H-，最后，样，最后，样，最后，样，最后，样品分子的准分子离子通过筛选狭缝进入质谱仪，整个过程在大品分子的准分子离子通过筛选狭缝进入质谱仪，整个过程在大品分子的准分子离子通过筛选狭缝进入质谱仪，整个过程在大品分子的准分子离子通过筛选狭缝进入质谱仪，整个过程在大气压条件下完成。气压条件下完成。气压条件下完成。气压条件下完成。APCIAPCI是一种软电离接口技术，电离过程中是一种软电离接口技术，电离过程中是一种软电离接口技术，电离过程中是一种软电离接口技术，电离过程中只产生单电荷峰，非常适合弱极性小分子化合物的测定只产生单电荷峰，非常适合弱极性小分子化合物的测定只产生单电荷峰，非常适合弱极性小分子化合物的测定只产生单电荷峰，非常适合弱极性小分子化合物的测定。另外，。另外，。另外，。另外，APCIAPCI还与高流量的梯度洗脱兼容，通过调节离子源电压，可以还与高流量的梯度洗脱兼容，通过调节离子源电压，可以还与高流量的梯度洗脱兼容，通过调节离子源电压，可以还与高流量的梯度洗脱兼容，通过调节离子源电压，可以得到不同断裂程度的质谱图。得到不同断裂程度的质谱图。得到不同断裂程度的质谱图。得到不同断裂程度的质谱图。本讲稿第十四页，共七十三页n n优点：形成的是单电荷的准分子离子，不会优点：形成的是单电荷的准分子离子，不会发生发生ESI 过程中因形成多电荷离子而发生信过程中因形成多电荷离子而发生信号重叠、降低图谱清晰度的问题；适应高流号重叠、降低图谱清晰度的问题；适应高流量的梯度洗脱的流动相；采用电晕放电使流量的梯度洗脱的流动相；采用电晕放电使流动相离子化，能大大增加离子与样品分子的动相离子化，能大大增加离子与样品分子的碰撞频率，比化学电离的灵敏度高碰撞频率，比化学电离的灵敏度高3 个数量个数量级。级。本讲稿第十五页，共七十三页大气压化学电离源大气压化学电离源 APCINeedle喷雾针喷雾针（加热）（加热）Corona Needle电晕针电晕针reagent gas试剂气试剂气离子离子-分子反应分子反应本讲稿第十六页，共七十三页本讲稿第十七页，共七十三页电喷雾与大气压化学电离的比较电喷雾与大气压化学电离的比较n n电离机理电离机理：电喷雾采用离子蒸发，而电喷雾采用离子蒸发，而APCIAPCI电离是高压放电离是高压放电发生了质子转移而生成电发生了质子转移而生成MMHH+或或或或M-HM-HM-HM-H-离子。离子。离子。离子。n n样品流速样品流速：APCIAPCIAPCIAPCI源可从源可从源可从源可从0.20.20.20.2到到到到2mL2mL2mL2mLminminminmin；而电喷雾源允许；而电喷雾源允许；而电喷雾源允许；而电喷雾源允许流量相对较小流量相对较小流量相对较小流量相对较小,一般为一般为一般为一般为0.2-1mL0.2-1mL0.2-1mL0.2-1mLmin.min.min.min.n n断裂程度断裂程度；APCIAPCI源的探头处于高温，对热不稳定的化合源的探头处于高温，对热不稳定的化合物就足以使其分解物就足以使其分解.n n灵敏度灵敏度：通常认为电喷雾有利于分析极性大的小分子和通常认为电喷雾有利于分析极性大的小分子和生物大分子及其它分子量大的化合物，而生物大分子及其它分子量大的化合物，而APCIAPCI更适合于分更适合于分析极性较小的化合物。析极性较小的化合物。n n多电荷多电荷：APCIAPCI源不能生成一系列多电荷离子源不能生成一系列多电荷离子本讲稿第十八页，共七十三页二、二、LC-MS分析条件的选择和优化分析条件的选择和优化n n1.接口的选择接口的选择：ESI适合于中等极性到强极性的化合物适合于中等极性到强极性的化合物分子，特别是那些在溶液中能预先形成离子分子，特别是那些在溶液中能预先形成离子的化合物和可以获得多个质子的大分子（如的化合物和可以获得多个质子的大分子（如蛋白质）。蛋白质）。APCI不适合可带多个电荷的大分子，不适合可带多个电荷的大分子，其优势在于弱极性或中等极性的小分子的分其优势在于弱极性或中等极性的小分子的分析。析。本讲稿第十九页，共七十三页2.正、负离子模式的选择：正、负离子模式的选择：正离子模式正离子模式：适合于碱性样品，可用乙酸或甲：适合于碱性样品，可用乙酸或甲酸对样品加以酸化。样品中含有仲氨或叔氨时酸对样品加以酸化。样品中含有仲氨或叔氨时可优先考虑使用正离子模式。可优先考虑使用正离子模式。负离子模式负离子模式：适合于酸性样品，可用氨水或三：适合于酸性样品，可用氨水或三乙胺对样品进行碱化。样品中含有较多的强负乙胺对样品进行碱化。样品中含有较多的强负电性基团，如含氯、含溴和多个羟基时可尝试电性基团，如含氯、含溴和多个羟基时可尝试使用负离子模式。使用负离子模式。本讲稿第二十页，共七十三页3.流动相的选择流动相的选择n n常用的流动相为甲醇、乙腈、水和它们不同常用的流动相为甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合物以及一些易挥发盐的缓冲液。比例的混合物以及一些易挥发盐的缓冲液。n nLC/MS接口避免进入不挥发的缓冲液，避免接口避免进入不挥发的缓冲液，避免含磷和氯的缓冲液，含钠和钾的成分必须含磷和氯的缓冲液，含钠和钾的成分必须l mmol/L。本讲稿第二十一页，共七十三页4.流量和色谱柱的选择流量和色谱柱的选择n n不加热不加热ESI的最佳流速是的最佳流速是1-50 m mL/min，应用，应用4.6 mm内径内径LC柱时要求柱后分流，目前大多采柱时要求柱后分流，目前大多采用用 l-2.1 mm内径的微柱，内径的微柱，ESI源最高允许源最高允许l mL/min，建议使用，建议使用200-400 m mL/min；APCI的的最佳流速最佳流速l mL/min，常规的直径，常规的直径4.6mm柱最柱最合适。合适。n n为了提高分析效率，常采用为了提高分析效率，常采用 100 mm的短柱的短柱本讲稿第二十二页，共七十三页5.辅助气体流量和温度的选择辅助气体流量和温度的选择n n 操作中温度的选择和优化主要是指接口的干燥操作中温度的选择和优化主要是指接口的干燥气体而言，一般情况下选择干燥气温度高于分气体而言，一般情况下选择干燥气温度高于分析物的沸点析物的沸点20 左右即可。对热不稳定性化合左右即可。对热不稳定性化合物，要选用更低的温度以避免显著的分解。物，要选用更低的温度以避免显著的分解。n n选用干燥气温度和流量大小时还要考虑流动相选用干燥气温度和流量大小时还要考虑流动相的组成，有机溶剂比例高时可采用适当低的温的组成，有机溶剂比例高时可采用适当低的温度和流量小一点的。度和流量小一点的。本讲稿第二十三页，共七十三页六大禁止 禁止高浓度待测样品禁止高浓度待测样品 1ppm 禁止用洗涤剂清洗玻璃容器禁止用洗涤剂清洗玻璃容器 禁止用塑料容器装有机溶剂禁止用塑料容器装有机溶剂 禁止用不挥发性缓冲盐禁止用不挥发性缓冲盐 禁止高浓度有机缓冲盐禁止高浓度有机缓冲盐 10mM 禁止无机样品进样禁止无机样品进样本讲稿第二十四页，共七十三页建建议议 采用等度洗脱采用等度洗脱 采用甲醇作为流动相采用甲醇作为流动相 比例偏大比例偏大 采用小内径的色谱柱采用小内径的色谱柱 如如2.1mm2.1mm 除除MRM模式模式 不能超过不能超过4个通道个通道 一个色谱峰的数据点在一个色谱峰的数据点在15-2515-25个个本讲稿第二十五页，共七十三页建建议议 ESI广泛适用广泛适用 APCIAPCI效果更佳效果更佳 正模式广泛适用正模式广泛适用 负模式本底更低，信噪比更高负模式本底更低，信噪比更高本讲稿第二十六页，共七十三页影响分子量测定的因素v1）pH的的影影响响：正正离离子子方方式式pH要要低低些些，负负离离子子方方式式pH要要高高些，除对离子化有影响，还影响些，除对离子化有影响，还影响LC的峰形。的峰形。v2）气流和温度气流和温度：水含量高及流量大时要相应增加。：水含量高及流量大时要相应增加。v3）溶剂和缓冲液流量溶剂和缓冲液流量：流速适当高可以提高出峰的灵敏度。：流速适当高可以提高出峰的灵敏度。v4）溶溶剂剂和和缓缓冲冲液液的的类类型型：通通常常正正离离子子用用甲甲醇醇好好，负负离离子子乙乙腈好些腈好些v5）选选择择合合适适的的液液相相色色谱谱类类型型：正正相相、反反相相、选选择择合合适适的色谱柱的色谱柱本讲稿第二十七页，共七十三页v6）合合适适的的电电压压：DP电电压压高高时时，样样品品在在源源内内分分解解或或碎碎裂裂；高高DP电电压压时时会会使使多多电电荷荷离离子子比比例低，多聚体也减少例低，多聚体也减少v7）样品结构和性质样品结构和性质v8）杂杂质质的的影影响响：溶溶剂剂的的纯纯度度、水水的的纯纯净净程程度度等等。当当成成分分复复杂杂，杂杂质质太太多多时时，竞竞争争使使被被测测物离子化不好，同时使物离子化不好，同时使LC分离不好分离不好v9）样品浓度样品浓度本讲稿第二十八页，共七十三页分子量测定中的误判分子量测定中的误判v溶剂中的杂质溶剂中的杂质v来自于塑料添加剂的峰来自于塑料添加剂的峰v样品容器不干净，常见表面活性剂的峰样品容器不干净，常见表面活性剂的峰v进样系统污染进样系统污染v样品在源内碎裂，形成碎片离子样品在源内碎裂，形成碎片离子本讲稿第二十九页，共七十三页分子量测定失败的原因va）流动相不合适）流动相不合适vb）不挥发性盐的影响）不挥发性盐的影响vc）成分复杂，杂质太多）成分复杂，杂质太多vd)样品浓度不够样品浓度不够ve）pH值不合适值不合适vf）样品在源内分解或碎裂）样品在源内分解或碎裂本讲稿第三十页，共七十三页目标化合物分析目标化合物分析v（1）选择离子监测（）选择离子监测（SIM）SIM用用于于检检测测已已知知或或目目标标化化合合物物，比比全全扫扫描描方方式式能能得得到到更更高高的的灵灵敏敏度度。这这种种数数据据采采集集的的方方式式一一般般用用在在定定量量目目标标化化合合物物之之前前，而而且且往往往需要已知化合物的性质。往需要已知化合物的性质。若若几几种种目目标标化化合合物物用用同同样样的的数数据据采采集集方方式式监监测，那么可以同时测定几种离子。测，那么可以同时测定几种离子。本讲稿第三十一页，共七十三页（2 2）母离子扫描）母离子扫描v母离子分析可用来鉴定和确认类型已知的化母离子分析可用来鉴定和确认类型已知的化合物，尽管它们的母离子的质量可以不同，合物，尽管它们的母离子的质量可以不同，但在分裂过程中会生成共同的子离子，这种但在分裂过程中会生成共同的子离子，这种扫描功能在药物代谢研究中十分重要。扫描功能在药物代谢研究中十分重要。本讲稿第三十二页，共七十三页(3)中性丢失扫描中性丢失扫描 中性丢失扫描分析可用来鉴定和确认类型已中性丢失扫描分析可用来鉴定和确认类型已知的化合物，例如新生儿遗传疾病筛查中某知的化合物，例如新生儿遗传疾病筛查中某些检测项目。也可以帮助进行未知物结构判些检测项目。也可以帮助进行未知物结构判断，例如有中性丢失断，例如有中性丢失18Da的意味着的意味着-H2O，28-CO，30-HCOH，32-CH3OH，44-CO2等等。等等。本讲稿第三十三页，共七十三页三、三、LC-MS的应用的应用v医药学：药物代谢、药物动力学、杂质分析、天然产物分析医药学：药物代谢、药物动力学、杂质分析、天然产物分析v生物化学：肽、蛋白质、寡核苷酸、糖生物化学：肽、蛋白质、寡核苷酸、糖v环境化学：农药和农残分析、有机污染物、土壤环境化学：农药和农残分析、有机污染物、土壤/食品食品/水分析水分析v临床医学：新生儿检查、糖化血红蛋白（糖尿病）、血红蛋白变临床医学：新生儿检查、糖化血红蛋白（糖尿病）、血红蛋白变异、胆酸异、胆酸v食品科学：香料、添加物、包装物、蛋白质、致癌物食品科学：香料、添加物、包装物、蛋白质、致癌物v法医学：滥用药物、爆炸物、兴奋剂检测法医学：滥用药物、爆炸物、兴奋剂检测v兽医学：兴奋剂、磺胺类药物、抗体兽医学：兴奋剂、磺胺类药物、抗体v合成化学：有机金属化合物、有机合成物合成化学：有机金属化合物、有机合成物v有机化学：表面活性剂、染料有机化学：表面活性剂、染料本讲稿第三十四页，共七十三页LC-MS应用应用n n小分子化合物分析本讲稿第三十五页，共七十三页本讲稿第三十六页，共七十三页Mesocarb(双苯斯酮胺双苯斯酮胺)本讲稿第三十七页，共七十三页本讲稿第三十八页，共七十三页本讲稿第三十九页，共七十三页槟榔有效成分的分析槟榔有效成分的分析n n槟榔含有多种人体所需的营养元素和有益物槟榔含有多种人体所需的营养元素和有益物质，同时也含有多种药理活性成分，主要包质，同时也含有多种药理活性成分，主要包括生物碱、酚类化合物、脂肪油以及多种氨括生物碱、酚类化合物、脂肪油以及多种氨基酸和各种各样的矿物质等。槟榔的主要作基酸和各种各样的矿物质等。槟榔的主要作用是由槟榔碱的功效体现的。槟榔碱用是由槟榔碱的功效体现的。槟榔碱(Arecoline)属于生物碱，是一种含氮杂环属于生物碱，是一种含氮杂环的有机物，分子式的有机物，分子式C8H13O2N，沸点，沸点209，溶于醇、醚、氯仿和苯等有机溶剂，不溶于溶于醇、醚、氯仿和苯等有机溶剂，不溶于水。水。本讲稿第四十页，共七十三页本讲稿第四十一页，共七十三页本讲稿第四十二页，共七十三页n n1 1根据根据根据根据“氮规律氮规律氮规律氮规律”质量数奇数可以得到该化合物含有奇数个质量数奇数可以得到该化合物含有奇数个质量数奇数可以得到该化合物含有奇数个质量数奇数可以得到该化合物含有奇数个NN原子。原子。原子。原子。n n2 2结合计算机检索系统，根据同位素丰度，对于荷质比结合计算机检索系统，根据同位素丰度，对于荷质比结合计算机检索系统，根据同位素丰度，对于荷质比结合计算机检索系统，根据同位素丰度，对于荷质比155155的分子离的分子离的分子离的分子离子峰可以得到一个环加两个双键的数值。子峰可以得到一个环加两个双键的数值。子峰可以得到一个环加两个双键的数值。子峰可以得到一个环加两个双键的数值。n n3 3由于是正离子电离方式，中性离子丢失不多，且分子离子在首先由于是正离子电离方式，中性离子丢失不多，且分子离子在首先由于是正离子电离方式，中性离子丢失不多，且分子离子在首先由于是正离子电离方式，中性离子丢失不多，且分子离子在首先消去一个中性分子甲基后得到最稳定的消去一个中性分子甲基后得到最稳定的消去一个中性分子甲基后得到最稳定的消去一个中性分子甲基后得到最稳定的140140质量数的最高峰。同时根据质量数的最高峰。同时根据质量数的最高峰。同时根据质量数的最高峰。同时根据BeynonBeynon表及其最小碎片质量数表及其最小碎片质量数表及其最小碎片质量数表及其最小碎片质量数4242的所有可能性可以得到该化合物只能的所有可能性可以得到该化合物只能的所有可能性可以得到该化合物只能的所有可能性可以得到该化合物只能含有不超过两个含有不超过两个含有不超过两个含有不超过两个NN原子。（原子。（原子。（原子。（1 1个）个）个）个）n n4 4对于含有双键和杂环的化合物，它们的分子离子比较稳定，这从谱图对于含有双键和杂环的化合物，它们的分子离子比较稳定，这从谱图对于含有双键和杂环的化合物，它们的分子离子比较稳定，这从谱图对于含有双键和杂环的化合物，它们的分子离子比较稳定，这从谱图和检索系统的碎片质量数上可以得到它们的一些稳定的碎片峰。和检索系统的碎片质量数上可以得到它们的一些稳定的碎片峰。和检索系统的碎片质量数上可以得到它们的一些稳定的碎片峰。和检索系统的碎片质量数上可以得到它们的一些稳定的碎片峰。本讲稿第四十三页，共七十三页本讲稿第四十四页，共七十三页生物大分子分析生物大分子分析本讲稿第四十五页，共七十三页多电荷离子多电荷离子 指带有指带有2个或更多电荷的离子，常见于蛋白质个或更多电荷的离子，常见于蛋白质或多肽等离子。有机质谱中，单电荷离子是或多肽等离子。有机质谱中，单电荷离子是绝大多数，只有那些不容易碎裂的基团或分绝大多数，只有那些不容易碎裂的基团或分子结构子结构-如共轭体系结构如共轭体系结构-才会形成多电荷离才会形成多电荷离子。它的存在说明样品是较稳定的。采用电子。它的存在说明样品是较稳定的。采用电喷雾的离子化技术，可产生带很多电荷的离喷雾的离子化技术，可产生带很多电荷的离子，最后经计算机自动换算成单质子，最后经计算机自动换算成单质/荷比离荷比离子。子。本讲稿第四十六页，共七十三页本讲稿第四十七页，共七十三页ESI ESI 在大气压和环境温度下进行，被分析物的分子在电离过程中通常在大气压和环境温度下进行，被分析物的分子在电离过程中通常在大气压和环境温度下进行，被分析物的分子在电离过程中通常在大气压和环境温度下进行，被分析物的分子在电离过程中通常产生多重质子化的离子。下图是典型的产生多重质子化的离子。下图是典型的产生多重质子化的离子。下图是典型的产生多重质子化的离子。下图是典型的 ESI ESI 质谱图，由一簇不同程度质谱图，由一簇不同程度质谱图，由一簇不同程度质谱图，由一簇不同程度质子化的分子离子峰质子化的分子离子峰质子化的分子离子峰质子化的分子离子峰 组成，相邻两峰相差一个质子。对于任意相邻两组成，相邻两峰相差一个质子。对于任意相邻两组成，相邻两峰相差一个质子。对于任意相邻两组成，相邻两峰相差一个质子。对于任意相邻两峰，由下列公式计算所含的质子数峰，由下列公式计算所含的质子数峰，由下列公式计算所含的质子数峰，由下列公式计算所含的质子数(n)(n)和样品的分子量和样品的分子量和样品的分子量和样品的分子量(M)(M)。本讲稿第四十八页，共七十三页1314+本讲稿第四十九页，共七十三页川牛膝川牛膝HPLCMS分析分析本讲稿第五十页，共七十三页tR=17.67min的色谱峰，一级质谱数据的色谱峰，一级质谱数据(ESI，MS其为含量最大的峰，结合杯苋甾酮其为含量最大的峰，结合杯苋甾酮(分子量分子量为为520.3)是川牛膝的主要成分，推测该离子峰为杯苋甾酮分子加合一个甲酸根后形成的准分是川牛膝的主要成分，推测该离子峰为杯苋甾酮分子加合一个甲酸根后形成的准分离子峰离子峰M+HCOO-。又其二级碎片图中有。又其二级碎片图中有m/z=519.2，其应为杯苋甾酮分子失去一个质子形成的碎片离子，其应为杯苋甾酮分子失去一个质子形成的碎片离子峰峰M-H-。有。有m/z=501.4，这应是由于甾酮类物质中含有较多的羟基，其施加碰撞能后以水分子的形，这应是由于甾酮类物质中含有较多的羟基，其施加碰撞能后以水分子的形式失去而形成碎片离子峰式失去而形成碎片离子峰M-H-H2O-。再结合其它的碎片离子与杯苋甾酮的结构相符，因此。再结合其它的碎片离子与杯苋甾酮的结构相符，因此推断该化合物为杯苋甾酮。推断该化合物为杯苋甾酮。本讲稿第五十一页，共七十三页tR=16.22min的色谱峰，一级质谱数据的色谱峰，一级质谱数据,结合川牛膝中成分结合川牛膝中成分b-b-胡罗卜苷的分子量胡罗卜苷的分子量(576.2)推测其是推测其是b b-胡罗卜苷胡罗卜苷分子失去一个质子而形成的准分子离子峰分子失去一个质子而形成的准分子离子峰M-H-。再结合。再结合b b-胡罗卜苷的结构中含有羟基以及其二级质谱胡罗卜苷的结构中含有羟基以及其二级质谱的碎片离子的碎片离子531.2M-H-H2O-,513.0M-H-2H2O-,431.1、341.0、233.2，与，与b-b-胡罗卜苷的结构相符，胡罗卜苷的结构相符，因此推断该化合物为因此推断该化合物为b-b-胡罗卜苷。胡罗卜苷。本讲稿第五十二页，共七十三页本讲稿第五十三页，共七十三页本讲稿第五十四页，共七十三页麻黄类生物碱麻黄类生物碱HPLC-MS本讲稿第五十五页，共七十三页本讲稿第五十六页，共七十三页本讲稿第五十七页，共七十三页n n 结合麻黄的正离子一级质谱全扫描图和麻结合麻黄的正离子一级质谱全扫描图和麻黄中三对主要生物碱的分子量黄中三对主要生物碱的分子量(151.1、165.1、179.2)，发现色谱峰均为被测物质加合一个，发现色谱峰均为被测物质加合一个质子后形成的准分子离子峰质子后形成的准分子离子峰M+H+，说明，说明麻黄生物碱类物质在电喷雾电离麻黄生物碱类物质在电喷雾电离(ESI)条件条件下易得到质子而带正电荷。麻黄中的三对同下易得到质子而带正电荷。麻黄中的三对同分异构体为空间异构，因此每对物质的二级分异构体为空间异构，因此每对物质的二级质谱图是相同的。质谱图是相同的。本讲稿第五十八页，共七十三页n n由于麻黄中的三对同分异构体的分子结构比较相似，均含有由于麻黄中的三对同分异构体的分子结构比较相似，均含有由于麻黄中的三对同分异构体的分子结构比较相似，均含有由于麻黄中的三对同分异构体的分子结构比较相似，均含有烷基、羟基等，容易失去水分子、碳分子、烷烃等而形成相烷基、羟基等，容易失去水分子、碳分子、烷烃等而形成相烷基、羟基等，容易失去水分子、碳分子、烷烃等而形成相烷基、羟基等，容易失去水分子、碳分子、烷烃等而形成相应的碎片离子峰。根据此规律，结合三对同分异构体麻黄碱应的碎片离子峰。根据此规律，结合三对同分异构体麻黄碱应的碎片离子峰。根据此规律，结合三对同分异构体麻黄碱应的碎片离子峰。根据此规律，结合三对同分异构体麻黄碱的分子量对其成分推测如下：的分子量对其成分推测如下：的分子量对其成分推测如下：的分子量对其成分推测如下：n nM/Z=152.1M/Z=152.1的分子离子峰，由其质谱数据的分子离子峰，由其质谱数据的分子离子峰，由其质谱数据的分子离子峰，由其质谱数据(ESI.MS)M/Z(ESI.MS)M/Z：152.1M+H152.1M+H+、l34.1 M+H-H2 2O+、l 07.1 M+H-Hl 07.1 M+H-H2 2O-CH3 3-C-C+、89M+H-2H2O-CHO-CH3 3-C+，因此推断其为去甲，因此推断其为去甲基麻黄碱或去甲基伪麻黄碱。基麻黄碱或去甲基伪麻黄碱。本讲稿第五十九页，共七十三页n nm/z=166.l的分子离子峰，由其一级质谱数据的分子离子峰，由其一级质谱数据m/z：166.1M+H+以及二级质谱碎片离子以及二级质谱碎片离子148.1；M+H-H2O+、l35.1M+H-H2O-CH2+、124.1，推断其为麻黄碱或伪麻黄碱。，推断其为麻黄碱或伪麻黄碱。n nm/z=180.1的的分分子子离离子子峰峰，由由其其质质谱谱数数据据m/z：l62.2M+H-H2O+、l47.4M+H-H2O-CH2+、134.1M+H-2CH2+、l15.9M+H-CH2-NH4+、l03.1M+H-H2O-CH2-C+、88.8，推推断断其其为为甲甲基基麻黄碱或甲基伪麻黄碱。麻黄碱或甲基伪麻黄碱。本讲稿第六十页，共七十三页本讲稿第六十一页，共七十三页本讲稿第六十二页，共七十三页高效液相色谱高效液相色谱电喷雾串联质谱法测电喷雾串联质谱法测定清开灵复方中胆酸定清开灵复方中胆酸 n n采用采用采用采用HPLC/MS/MSHPLC/MS/MS技术，从清开灵注射液中，通过分技术，从清开灵注射液中，通过分技术，从清开灵注射液中，通过分技术，从清开灵注射液中，通过分子量、二级质谱碎片信息定性测定了清开灵复方中的胆子量、二级质谱碎片信息定性测定了清开灵复方中的胆子量、二级质谱碎片信息定性测定了清开灵复方中的胆子量、二级质谱碎片信息定性测定了清开灵复方中的胆酸。酸。酸。酸。n n直接进样实验。清开灵注射液经过初步化学处理后采用直接进样实验。清开灵注射液经过初步化学处理后采用直接进样实验。清开灵注射液经过初步化学处理后采用直接进样实验。清开灵注射液经过初步化学处理后采用电喷雾（电喷雾（电喷雾（电喷雾（ESIESI）离子源，在负离子扫描方式下，得到一）离子源，在负离子扫描方式下，得到一）离子源，在负离子扫描方式下，得到一）离子源，在负离子扫描方式下，得到一极质谱图、即分子离子峰极质谱图、即分子离子峰极质谱图、即分子离子峰极质谱图、即分子离子峰M-HM-H-，再用二级质谱，再用二级质谱（MS/MS）扫描目标分子离子的碎片峰。再以相同）扫描目标分子离子的碎片峰。再以相同的实验条件对标准品进行测定，做出其一级、二级的实验条件对标准品进行测定，做出其一级、二级质谱图。质谱图。本讲稿第六十三页，共七十三页通过对样品进行分子离子峰的扫描发现通过对样品进行分子离子峰的扫描发现M-H-的峰中有一个很的峰中有一个很强的强的407，根据样品处理过程以及对复方各单味药材的研究，其，根据样品处理过程以及对复方各单味药材的研究，其应该为一有机酸的负离子峰，并初步推断其为胆酸。（胆酸的应该为一有机酸的负离子峰，并初步推断其为胆酸。（胆酸的分子量为分子量为408）。如图所示：通过对照样品）。如图所示：通过对照样品(右右)和标准品（左）和标准品（左）的二级质谱图，发现其主要碎片峰均吻合较好。的二级质谱图，发现其主要碎片峰均吻合较好。本讲稿第六十四页，共七十三页检测硝基呋喃类代谢物检测硝基呋喃类代谢物本讲稿第六十五页，共七十三页n n以第一步测得值为母离子，做以第一步测得值为母离子，做PRODUCT ION SCAN（MS2），调节），调节CE等参数，等参数，使母，子离子都具有一定强度，平滑后得到使母，子离子都具有一定强度，平滑后得到MS2谱，从各母离子中各选择谱，从各母离子中各选择2个最高的子个最高的子离子，分别为离子，分别为呋喃它酮呋喃它酮AMOZ：M/Z 291，262；呋喃唑酮呋喃唑酮AOZ：M/Z 134，104；呋喃妥因呋喃妥因AHD：M/Z 134，104或或178；呋喃西林呋喃西林SEM：M/Z 192，166，本讲稿第六十六页，共七十三页AMOZ本讲稿第六十七页，共七十三页AMOZ-D5本讲稿第六十八页，共七十三页AOZ本讲稿第六十九页，共七十三页AHD本讲稿第七十页，共七十三页AHD内标（选252/134）本讲稿第七十一页，共七十三页SEM内标（选212/195）本讲稿第七十二页，共七十三页n n以第二步选定的离子对，例如以第二步选定的离子对，例如以第二步选定的离子对，例如以第二步选定的离子对，例如335.1/262.2 335.1/262.2 等，做等，做等，做等，做MRM SCAN MRM SCAN。n n通过软件操作优化各种参数，如温度、气流等。通过软件操作优化各种参数，如温度、气流等。通过软件操作优化各种参数，如温度、气流等。通过软件操作优化各种参数，如温度、气流等。n n接好色谱柱，编辑接好色谱柱，编辑LC梯度洗脱，进样。梯度洗脱，进样。n n用空白提取液配制同样浓度标样，按上一步方法进样。用空白提取液配制同样浓度标样，按上一步方法进样。n n用空白提取液配制一系列不同浓度用空白提取液配制一系列不同浓度用空白提取液配制一系列不同浓度用空白提取液配制一系列不同浓度硝基呋喃代谢物硝基呋喃代谢物标样，标样，按上一步方法进样，例如，分别稀释为浓度按上一步方法进样，例如，分别稀释为浓度0.25ug/kg,0.5ug/kg,1.0ug/kg,2.0ug/kg,4.0ug/kg,8.0ug/kg,等等。等等。本讲稿第七十三页，共七十三页