【教学课件】第十三章分子生物学技术.ppt

第十三章分子生物学技术第一节、重组第一节、重组DNADNA技术技术-基因工程基因工程 第二节、分子杂交及相关技术第二节、分子杂交及相关技术第三节、聚合酶链反应的原理和应用第三节、聚合酶链反应的原理和应用第四节、基因定位的常用方法第四节、基因定位的常用方法1 1分子生物学技术l l7070年代以来年代以来,分子生物学技术迅速发展起分子生物学技术迅速发展起来来,使人们有可能进行人类基因组及单个使人们有可能进行人类基因组及单个基因的结构研究基因的结构研究,分析其功能特征分析其功能特征,了解其了解其变化规律。分子生物学技术为揭示人类遗变化规律。分子生物学技术为揭示人类遗传病的本质起着重要作用。下面就一些分传病的本质起着重要作用。下面就一些分子生物学技术予以介绍。子生物学技术予以介绍。2 21946 1950 1955 1960 19651970 1975 1980 1985 1990 1995 1944DNA是遗传物质1949Hbs贫血1953双螺旋1956HbsGlu-Val1966遗传密码第一个R酶1972重组质粒1975DNA杂交1977DNA测序1981转G小鼠1983HD病G定位1985PCR1986位置克隆1987G剔除小鼠1989位置克隆1990第一个基因治疗1995细菌G组序列1996酵母基因组序列现代分子遗传学发展现代分子遗传学发展重要事件重要事件3 3第一节第一节 重组重组DNADNA技术技术-基因工程基因工程l l重组重组DNADNA技术是现代分子生物技术发展中最重技术是现代分子生物技术发展中最重要的成就之一。即是基因工程要的成就之一。即是基因工程(Gene(Gene Engineering)Engineering)的核心技术。的核心技术。l l重组重组DNADNA技术（技术（Recombinant DNA Recombinant DNA TechniqueTechnique）是人类根据需要选择目的基因是人类根据需要选择目的基因（DNADNA片段）在体外与基因运载体重组，转移片段）在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。新的物种和治疗人类疾病的目的。l l这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的发现和应用。发现和应用。4 4 一、限制酶一、限制酶 l l限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶(restrictive(restrictive endonucleases)endonucleases)，又称限制酶。是特异性地，又称限制酶。是特异性地切断切断DNADNA链中磷酸二酯键的核酸酶（链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手分子手术刀术刀”）。）。l l发现于原核生物体内，现已分离出发现于原核生物体内，现已分离出100100多种，多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNADNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。技术和基因诊断中重要的一类工具酶。5 51 1、限制酶的命名、限制酶的命名 l l根据其来源命名。如：根据其来源命名。如：属名属名 菌株名菌株名EcoRI种名种名 编号编号l lEcoRIEcoRI来源于大肠杆菌来源于大肠杆菌E.coliE.coli的的RY13RY13菌株菌株,I,I指在该菌株中分离的第一个限制酶。指在该菌株中分离的第一个限制酶。6 62 2、限制酶识别序列和切割形成、限制酶识别序列和切割形成 l l 每种限制酶能识别和切割的通常每种限制酶能识别和切割的通常每种限制酶能识别和切割的通常每种限制酶能识别和切割的通常4 4 4 48 8 8 8个核苷酸序个核苷酸序个核苷酸序个核苷酸序列，称为限制性位点或切点。列，称为限制性位点或切点。列，称为限制性位点或切点。列，称为限制性位点或切点。如：如：如：如：Hare 5-GGCC-3Hare 5-GGCC-3Hare 5-GGCC-3Hare 5-GGCC-3 Bam HI 5-GGATCC-3Bam HI 5-GGATCC-3Bam HI 5-GGATCC-3Bam HI 5-GGATCC-3平末端平末端平末端平末端(blunt end)(blunt end)(blunt end)(blunt end)对称轴切，连接效果差对称轴切，连接效果差对称轴切，连接效果差对称轴切，连接效果差 切割形成切割形成切割形成切割形成 粘性末端（粘性末端（粘性末端（粘性末端（sticky endsticky endsticky endsticky end）交错切。）交错切。）交错切。）交错切。7 78 8部分常用限制酶及切点9 9互补末端连接1010产生相同序列的突出末端的不同片段产生相同序列的突出末端的不同片段可有三种方式：可有三种方式：l l1)1)用同一种限制酶切割；用同一种限制酶切割；l l2)2)用识别相同靶序列的不同限制酶切割；用识别相同靶序列的不同限制酶切割；l l3)3)用识别不同靶序列但可产生一致的粘用识别不同靶序列但可产生一致的粘性末端的限制酶切割。性末端的限制酶切割。11113 3、特点：、特点：l l根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断中的重要用途：中的重要用途：中的重要用途：中的重要用途：l l1)1)1)1)不论不论不论不论DNADNADNADNA的来源如何，同一种限制酶切割后产的来源如何，同一种限制酶切割后产的来源如何，同一种限制酶切割后产的来源如何，同一种限制酶切割后产生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属的的的的DNADNADNADNA重组。如人和质粒重组。如人和质粒重组。如人和质粒重组。如人和质粒DNADNADNADNA等。等。等。等。l l2)2)2)2)用于人类基因组的用于人类基因组的用于人类基因组的用于人类基因组的DNADNADNADNA分析，具特定的酶切位分析，具特定的酶切位分析，具特定的酶切位分析，具特定的酶切位点。点。点。点。l l3)Gene3)Gene3)Gene3)Gene突变改变酶切位点的消失或新产生将改变突变改变酶切位点的消失或新产生将改变突变改变酶切位点的消失或新产生将改变突变改变酶切位点的消失或新产生将改变酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。1212二、基因运载体及其选择二、基因运载体及其选择 l l载体（载体（VectorVector）:将外源目的将外源目的DNADNA导入受体细导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。胞，并能自我复制和增殖的工具。1313l l载体具以下特征载体具以下特征：l l1)1)分子量小，便于携带较大的分子量小，便于携带较大的DNADNA片段，能进片段，能进入宿主细胞并在其中增殖；入宿主细胞并在其中增殖；l l2)2)有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一切点；单一切点；l l3)3)被切割后的载体，插入外源被切割后的载体，插入外源DNADNA后，不影响后，不影响其复制能力，并有可选择的标记基因（如，其复制能力，并有可选择的标记基因（如，抗药基因）。抗药基因）。l l常用的载体有常用的载体有：质粒，：质粒，噬菌体，粘粒，噬菌体，粘粒，BACBAC，YACYAC，PIPI等。等。1414（一）（一）.质粒质粒plasmidplasmid Plasmid Plasmid Plasmid Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环独立于细菌染色体外的双链环独立于细菌染色体外的双链环独立于细菌染色体外的双链环DNADNADNADNA分子。分子。分子。分子。PBR322PBR322PBR322PBR322大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌 pSC101 pSC101 pSC101 pSC101PlasmidchromosomePlasmidchromosome COIEICOIEICOIEICOIEIplasmidplasmid革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌 pc194pc194pc194pc194scp12scp12scp12scp12 真核生物真核生物真核生物真核生物-酵母质粒酵母质粒酵母质粒酵母质粒 1515常用的质粒如常用的质粒如常用的质粒如常用的质粒如pUC19pUC19pUC19pUC19，多连接子，多连接子，多连接子，多连接子MCSMCSMCSMCS。插入外源基因片段长度。插入外源基因片段长度。插入外源基因片段长度。插入外源基因片段长度约约约约10kb10kb10kb10kb。将外源基因插入到。将外源基因插入到。将外源基因插入到。将外源基因插入到MCSMCSMCSMCS中，随质粒的表达而表达，中，随质粒的表达而表达，中，随质粒的表达而表达，中，随质粒的表达而表达，增殖而扩增。外源基因插入到增殖而扩增。外源基因插入到增殖而扩增。外源基因插入到增殖而扩增。外源基因插入到MCSMCSMCSMCS后，后，后，后，-半乳糖苷酶的活性半乳糖苷酶的活性半乳糖苷酶的活性半乳糖苷酶的活性丧失而不显兰色丧失而不显兰色丧失而不显兰色丧失而不显兰色-白色菌落。如果不插入外源基因，则产生白色菌落。如果不插入外源基因，则产生白色菌落。如果不插入外源基因，则产生白色菌落。如果不插入外源基因，则产生兰色。从而筛选阳性菌落。兰色。从而筛选阳性菌落。兰色。从而筛选阳性菌落。兰色。从而筛选阳性菌落。EcoRIHindIIIOriOri复制起复制起点点LacZAPRpUC191616（二）（二）.-.-噬菌体噬菌体(phage)(phage)l l是一种可在体外包装的细菌病毒是一种可在体外包装的细菌病毒,可高效感染可高效感染大肠杆菌大肠杆菌.-.-噬菌体噬菌体DNADNA是线状双链是线状双链DNADNA分子分子,全长约全长约50kb,50kb,每条链各带每条链各带12bp12bp长的单链互补末长的单链互补末端端-粘末端粘末端(COS(COS序列序列)。进入宿主细胞后不久，。进入宿主细胞后不久，COSCOS序列碱基配对环化。序列碱基配对环化。l l改建后的改建后的噬菌体发展了多种较大型的克隆噬菌体发展了多种较大型的克隆载体，如：载体，如：1717l l1 1、置换、置换载体载体 溶解途径溶解途径 载体和外源载体和外源DNADNA整合到宿主菌整合到宿主菌DNADNA中。中。可克隆可克隆23kb23kb的外源的外源DNADNA。l l2 2、插入、插入载体载体 裂解途径裂解途径 DNA DNA在宿主细胞中复制，然后包装成在宿主细胞中复制，然后包装成噬菌体，裂解宿主，释放噬菌体。可噬菌体，裂解宿主，释放噬菌体。可克隆克隆5kb5kb的的cDNAcDNA。1818裂裂解解途途径径1919（三）三）.粘粒粘粒(cosmid vector)(cosmid vector)（303040kb40kb）是将质粒和是将质粒和噬菌体改建的一种载体噬菌体改建的一种载体.它它含含COSCOS序列序列,插入一小插入一小plasmid plasmid 而得名而得名CosmidCosmid。改建后的粘粒含有。改建后的粘粒含有噬菌体的复噬菌体的复制起点和制起点和cos cos 末端。全长末端。全长8kb8kb。大片段外。大片段外源源DNADNA插入后，在体外包装进而被克隆。插入后，在体外包装进而被克隆。可包装可包装303045kb45kb长的长的DNADNA片段，多用于基片段，多用于基因文库构建。因文库构建。2020(四四)大片段大片段DNADNA克隆载体克隆载体 l l人类和哺乳动物的基因组很大，甚人类和哺乳动物的基因组很大，甚至许多单个基因也相当大（如：至许多单个基因也相当大（如：DMD DMD gene 2300kbgene 2300kb），克隆分析就需要，克隆分析就需要更大的基因载体。如近年来构建的更大的基因载体。如近年来构建的一些载体：一些载体：BACBAC，PIPI，YACYAC等。等。21211 1 1 1、细菌人工染色体（、细菌人工染色体（、细菌人工染色体（、细菌人工染色体（bacterial artificial bacterial artificial bacterial artificial bacterial artificial chromosome,BACchromosome,BACchromosome,BACchromosome,BAC）l l优点：能携带大片段优点：能携带大片段优点：能携带大片段优点：能携带大片段DNADNADNADNA，约约约约300kb300kb300kb300kb。在每个细胞中，一个载在每个细胞中，一个载在每个细胞中，一个载在每个细胞中，一个载体分子能繁殖多个拷贝，体分子能繁殖多个拷贝，体分子能繁殖多个拷贝，体分子能繁殖多个拷贝，高产高产高产高产DNADNADNADNA。l l缺点：会出现插入片段在缺点：会出现插入片段在缺点：会出现插入片段在缺点：会出现插入片段在结构上的不稳定，导致克结构上的不稳定，导致克结构上的不稳定，导致克结构上的不稳定，导致克隆隆隆隆DNADNADNADNA部分的缺失或重排。部分的缺失或重排。部分的缺失或重排。部分的缺失或重排。为克服上述缺点，人们采为克服上述缺点，人们采为克服上述缺点，人们采为克服上述缺点，人们采用低拷贝数复制子载体，用低拷贝数复制子载体，用低拷贝数复制子载体，用低拷贝数复制子载体，如，如，如，如，E coliE coliE coliE coli中的中的中的中的F F F F因子。此因子。此因子。此因子。此质粒含有质粒含有质粒含有质粒含有2 2 2 2种基因（种基因（种基因（种基因（part part part part A,part BA,part BA,part BA,part B）。每个）。每个）。每个）。每个E E E E colicolicolicoli能接受能接受能接受能接受 300kbDNA 300kbDNA 300kbDNA 300kbDNA片片片片段。段。段。段。22222 2、噬菌体、噬菌体PIPI载体和载体和PACPAC l lPIPI噬菌体与噬菌体与噬菌体一样，外有蛋白质噬菌体一样，外有蛋白质壳。内含相当大的（壳。内含相当大的（110110115kb115kb）线性）线性DNADNA，并在体外包装于，并在体外包装于PIPI壳内。壳内。PIPI进入进入宿主细胞后环化，扩增。宿主细胞后环化，扩增。l l19941994年，有人将年，有人将PIPI和和F F因子克隆结合产因子克隆结合产生生PIPI人工染色体克隆系统人工染色体克隆系统-PAC-PAC。23233 3 3 3、酵母人工染色体（、酵母人工染色体（、酵母人工染色体（、酵母人工染色体（yeast artificial yeast artificial yeast artificial yeast artificial chromosome,YACchromosome,YACchromosome,YACchromosome,YAC）l l适用适用适用适用于克于克于克于克隆大隆大隆大隆大片段片段片段片段DNADNADNADNA，0.20.20.20.22Mb2Mb2Mb2Mb。2424YAC YAC 的主要功能成份有三：的主要功能成份有三：l l1 1）着丝粒着丝粒着丝粒着丝粒：mitosismitosismitosismitosis姊妹染色单体和减姊妹染色单体和减姊妹染色单体和减姊妹染色单体和减I I I I同同同同源染色体分离之必需。源染色体分离之必需。源染色体分离之必需。源染色体分离之必需。l l2 2 2 2）端粒：端粒：端粒：端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵保护染色体末端免受核酸酶的侵保护染色体末端免受核酸酶的侵保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。袭。袭。袭。l l3 3 3 3）自主复制序列（自主复制序列（自主复制序列（自主复制序列（ARSARSARSARS）元件）元件）元件）元件：是染色体自：是染色体自：是染色体自：是染色体自主复制的复制起点。主复制的复制起点。主复制的复制起点。主复制的复制起点。l l构建构建构建构建YACYACYACYAC需要需要需要需要4 4 4 4个短序列：个短序列：个短序列：个短序列：2 2 2 2个端粒，着丝粒，个端粒，着丝粒，个端粒，着丝粒，个端粒，着丝粒，ARSARSARSARS元件，与外源元件，与外源元件，与外源元件，与外源DNADNADNADNA连接成线性连接成线性连接成线性连接成线性DNADNADNADNA分子，分子，分子，分子，导入酵母细胞克隆。导入酵母细胞克隆。导入酵母细胞克隆。导入酵母细胞克隆。2525三、三、DNADNA重组与分子克隆化重组与分子克隆化 l l 为获得所需的基因或特异序列，为获得所需的基因或特异序列，需从细胞中分离得到目的基因与载需从细胞中分离得到目的基因与载体体DNADNA重组，并用适当方法在宿主重组，并用适当方法在宿主细胞中表达，扩增得到大量相同的细胞中表达，扩增得到大量相同的DNADNA片段，片段，称为称为DNADNA克隆，亦称分子克隆，亦称分子克隆。克隆。2626 基本原理与过程：1 1 1 1、分离纯化目的基因、分离纯化目的基因、分离纯化目的基因、分离纯化目的基因2 2 2 2、目的基因、目的基因、目的基因、目的基因+vector=+vector=+vector=+vector=重组重组重组重组DNADNADNADNA分子分子分子分子3 3 3 3、重组、重组、重组、重组DNADNADNADNA分子导入受体细胞，并在其内增殖。分子导入受体细胞，并在其内增殖。分子导入受体细胞，并在其内增殖。分子导入受体细胞，并在其内增殖。4 4 4 4、筛选含有重组、筛选含有重组、筛选含有重组、筛选含有重组DNADNADNADNA的细胞的细胞的细胞的细胞细胞克隆（细胞克隆（细胞克隆（细胞克隆（cell cell cell cell cloneclonecloneclone），将转化的细胞置于琼脂表面，以刺激细），将转化的细胞置于琼脂表面，以刺激细），将转化的细胞置于琼脂表面，以刺激细），将转化的细胞置于琼脂表面，以刺激细胞克隆生长，这些细胞是由单个细胞形成的遗传胞克隆生长，这些细胞是由单个细胞形成的遗传胞克隆生长，这些细胞是由单个细胞形成的遗传胞克隆生长，这些细胞是由单个细胞形成的遗传相同的细胞群体，故称细胞克隆。再将每个克隆相同的细胞群体，故称细胞克隆。再将每个克隆相同的细胞群体，故称细胞克隆。再将每个克隆相同的细胞群体，故称细胞克隆。再将每个克隆移至液体培养基中进行扩增。移至液体培养基中进行扩增。移至液体培养基中进行扩增。移至液体培养基中进行扩增。5 5 5 5、分离重组、分离重组、分离重组、分离重组DNADNADNADNA克隆：即收获扩增的培养细胞，克隆：即收获扩增的培养细胞，克隆：即收获扩增的培养细胞，克隆：即收获扩增的培养细胞，并选择分离重组并选择分离重组并选择分离重组并选择分离重组DNADNADNADNA。2727分离纯化目的基因分离纯化目的基因目的基因目的基因+vector=+vector=重组重组DNADNA分子分子2828重组重组DNADNA 和和分子分子克隆克隆 2929重组重组DNADNA和分子克隆的几种方法：和分子克隆的几种方法：（依目的基因的来源依目的基因的来源）1 1、从基因组中分离目的基因在细胞中克隆、从基因组中分离目的基因在细胞中克隆2 2、由特定、由特定mRNAmRNA逆转录合成逆转录合成cDNAcDNA后再进行后再进行 克隆克隆3 3、化学合成目的基因进行克隆、化学合成目的基因进行克隆4 4、PCRPCR体外扩增目的片段进行克隆体外扩增目的片段进行克隆3030从基因从基因组中分组中分离目的离目的基因在基因在细胞中细胞中克隆克隆 3131筛选含有重组筛选含有重组筛选含有重组筛选含有重组DNADNADNADNA的细胞的细胞的细胞的细胞细胞克隆（细胞克隆（细胞克隆（细胞克隆（cell clonecell clonecell clonecell clone）3232筛查含有目的基因的细胞克隆筛查含有目的基因的细胞克隆3333四、目的基因表达四、目的基因表达 l l上述细胞的克隆系统可直接导入的目基因扩上述细胞的克隆系统可直接导入的目基因扩增，获得足够量的目的基因来进行结构与功增，获得足够量的目的基因来进行结构与功能的研究。能的研究。l l重组重组DNADNA技术的另一目的是获得基因重组后的技术的另一目的是获得基因重组后的产物产物RNARNA，蛋白质。，蛋白质。l l就是将目的基因与表达载体重组，导入宿主就是将目的基因与表达载体重组，导入宿主细胞进而表达出相应的基因产物（蛋白）。细胞进而表达出相应的基因产物（蛋白）。如胰岛素，干扰素；生产疫苗的抗原和特异如胰岛素，干扰素；生产疫苗的抗原和特异的抗体等。此类克隆系统称为表达克隆。的抗体等。此类克隆系统称为表达克隆。（expression cloningexpression cloning）.3434目的基目的基因表达因表达 3535（一）真核细胞的基因在原核细胞（一）真核细胞的基因在原核细胞（细菌）中表达（细菌）中表达 l l原核细胞中缺乏真核基因表达装置（如，原核细胞中缺乏真核基因表达装置（如，原核细胞中缺乏真核基因表达装置（如，原核细胞中缺乏真核基因表达装置（如，RNARNARNARNA剪接剪接剪接剪接因子等），因此不能直接表达。通常采用大肠杆因子等），因此不能直接表达。通常采用大肠杆因子等），因此不能直接表达。通常采用大肠杆因子等），因此不能直接表达。通常采用大肠杆 菌为宿主。菌为宿主。菌为宿主。菌为宿主。真核多肽的表达要求：真核多肽的表达要求：真核多肽的表达要求：真核多肽的表达要求：1 1 1 1）适当的）适当的）适当的）适当的cDNAcDNAcDNAcDNA（完整的编码序列）；（完整的编码序列）；（完整的编码序列）；（完整的编码序列）；2 2 2 2）适当的表达载体，提供特定多肽信息；）适当的表达载体，提供特定多肽信息；）适当的表达载体，提供特定多肽信息；）适当的表达载体，提供特定多肽信息；3 3 3 3）外部进行表达调控，表达系统设计有启动子。）外部进行表达调控，表达系统设计有启动子。）外部进行表达调控，表达系统设计有启动子。）外部进行表达调控，表达系统设计有启动子。产物特征：产物特征：产物特征：产物特征：1 1 1 1）真核细胞的蛋白由于不能羟基化而不稳定；）真核细胞的蛋白由于不能羟基化而不稳定；）真核细胞的蛋白由于不能羟基化而不稳定；）真核细胞的蛋白由于不能羟基化而不稳定；2 2 2 2）活性受限或无活性。）活性受限或无活性。）活性受限或无活性。）活性受限或无活性。3636(二二)、真核细胞基因在真核细胞中表达、真核细胞基因在真核细胞中表达 l l真核宿主细胞提供一个相似但又不相同的真核宿主细胞提供一个相似但又不相同的环境。常采用酵母或昆虫细胞作为宿主。环境。常采用酵母或昆虫细胞作为宿主。l l应用于真核细胞蛋白质的大量制备，研究应用于真核细胞蛋白质的大量制备，研究特定基因的表达。特定基因的表达。l l产物翻译后羟基化，羧基化等，有加强蛋产物翻译后羟基化，羧基化等，有加强蛋白的稳定和功能活性。白的稳定和功能活性。3737五、基因文库、基因文库l l基因文库（基因文库（gene librarygene library）,应用应用DNADNA重组重组技术构建的含有基因组的全部基因的技术构建的含有基因组的全部基因的DNADNA克隆。克隆。3838（一）一）一）一）构建基因构建基因构建基因构建基因组组组组DNADNADNADNA文文文文库库库库3939（二）染色体特异的基因文库二）染色体特异的基因文库 （chromosome specific library chromosome specific library）单个染色体单个染色体 细胞克隆细胞克隆（流式（流式C C仪）仪）细胞细胞 染色体染色体染色体文库染色体文库染色体区带染色体区带 区带特异区带特异（显微切割（显微切割 ）DNADNA文库文库4040 （三）（三）cDNAcDNA文库（文库（cDNA librarycDNA library）cDNAcDNA文库文库构建：构建：特定组织特定组织细胞一细胞一定发育定发育阶段阶段 总总 mRNAmRNA4141