【教学课件】第十三章紫外-可见分光光度法.ppt

第十三章第十三章 紫外紫外可见分光光度法可见分光光度法 n n电磁辐射按其波长可分为不同区域。电磁辐射按其波长可分为不同区域。n n 射线射线 5 5140pm140pmn n X X射线射线 10 10-3-310nm10nmn n 光学区光学区 10 101000m1000mn n 紫紫 外外 10 10380nm380nmn n 可见光可见光 380 380780nm780nmn n 红红 外外 0.78 0.781000m1000mn n 微微 波波 0.1mm 0.1mm1m1mn n 无线光波无线光波 1m 1m光学分析法 的类型光谱法 分子光谱、原子光谱 发射光谱、吸收光谱、荧光光谱、拉曼光谱等 非光谱法 1 基本原理 一、分子能级(量)与电磁辐射 二、光的性质 三、物质的颜色与光的关系与光的关系 四、物质吸收光的定律一一、分子能级分子能级(量量)与电磁辐射与电磁辐射n n分子的能量包括：价电子能量（Ee）120eV 分子内原子在平衡位置的振动能量（Ev）0.0251eV 分子绕重心转动的能量（Er）小于0.025eV E=Ee+Ev+Er 分子吸收光谱的特点：带状光谱二二 光的性质光的性质n n单色光：只有一种波长的光 n n复合光：由两种及两种以上波长的光组成的 光n n白光：红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等颜色的光按一定比例混合而成 n n互补色光：两种颜色的光按这一比例混合也可得到白光 白光绿 紫 橙青蓝黄青蓝红物质的颜色吸 收 光颜色波长/nm黄绿紫400450黄蓝450480橙绿蓝480490红蓝绿490500紫红绿500560紫黄绿560580蓝黄580600绿蓝橙600650黄绿红650700三、物质的颜色与光的关系 物质的颜色由物质与光的相互作用方式决定1.全吸收 物质显示黑色，如金属粉末；2.全透射 物质显无色，如水、无色溶液、无色玻璃等；3.全反射 物质显示银白色，如银等金属；4.漫反射 物质显白色，如碳酸钠、氯化钠粉末；5.部分吸收部分透过 物质呈现吸收光的互补色。硫酸铜溶液吸收黄色光而呈蓝色；高锰酸钾溶液则吸收绿光而呈紫红色。四、物质吸收光的定律朗伯比耳定律1、吸收曲线2、朗伯比耳定律 设入射光强度为I0，透过光强度为I，溶液浓度为c，液层厚度为b，它们之间的定量关系表示为 当当c的的单单位位为为gL-1，b的的单单位位为为cm时时，k称称为为吸吸收收系系数数（absorption coefficient）以以a表表示示。若c的单位为molL-1，b的单位为cm，k称为摩尔吸光系数（molar absorption）以表示。与与 a的的 关关 系系 为为 =Ma 例13-1 浓度为5.010-4gL-1的Cu2+溶液，用双环乙铜二胺显色后，于波长600nm处，以2.00cm比色皿测定透光度为50.1%，求吸光系数和摩尔吸光系数。解：已知 T=50.1%，则 b=2.00cm c=5.0010-4gL-1 M(Cu2+)=64.0gmol-1 则 3、偏离朗伯、偏离朗伯比耳定律的原因比耳定律的原因 n n物理原因：单色光不纯所致 n n化学原因：溶液浓度高于0.01molL-1 n n 介质不均匀如呈胶体、乳浊、悬浮状 n n 吸光微粒发生解离、缔合、互变异构等 2 分光光度计及测定方法 光度分析按照使用的光源及仪器又可分为光度分析按照使用的光源及仪器又可分为目视比色法目视比色法光电比色法光电比色法分光光度法分光光度法一、分光光度计 1、分光光度计的基本构造、分光光度计的基本构造 光源 单色光器 吸收池 检测器 显示器 n n光源（light source）：n n钨灯（612V），产生3203200nm的连续光谱，其适宜的波长是3601000nm。n n氢灯发射150400nm波长的光，适用于200400nm波长范围。n n辅助设备 聚光透镜、稳压电源n n单色器单色器（monochromatormonochromator）：）：n n作用作用 复合光分解成按波长顺序排列的单色光复合光分解成按波长顺序排列的单色光n n组成组成 入射狭缝、色散元件、准直镜。入射狭缝、色散元件、准直镜。n n色散元件类型色散元件类型 棱镜和光栅棱镜和光栅n n 棱镜材料棱镜材料 玻璃棱镜、石英棱镜玻璃棱镜、石英棱镜n n 玻璃棱镜的色散波段在玻璃棱镜的色散波段在360360700nm700nmn n 石英棱镜的色散波段在石英棱镜的色散波段在2002001000nm1000nmn n 光光栅栅做做色色散散元元件件的的特特点点：工工作作波波段段范范围围宽宽、适用性强、对各种波长色散率几乎一致。适用性强、对各种波长色散率几乎一致。n n吸收池（absorption cell，比色皿）：n n材料 无色光学玻璃、熔融石英n n形状 长方形n n规格 0.5cm、1cm、2cm、3cm和5cmn n要求 相同规格的两个吸收池的透光度相差应小于0.5%n n注意事项 保持透光面干燥、洁净，不可用手直接接触、不能磨擦透光面n n检测器（detector）：n n作用 透射光信号转换成电讯号。n n要求 灵敏度高、响应时间短、响应的线性关系好等，不同波长的光具有相同响应n n类型 光电管、光电倍增管n n显示器（display）：n n作用 显示和记录检测器的电信号n n类型 微安表、数码显示管n n标尺 透射比（T）、吸光度（A）2、常用的分光光度计、常用的分光光度计 n n分光光度计的类型 单波长、双波长。n n 单波长分光光度计又分为：单光束和双光束两种。n n 单波长单光束分光光度计 结构简单、使用方便，如 721型、751型721型分光光度计型分光光度计 工作波长范围工作波长范围工作波长范围工作波长范围 360 360800nm800nm结构结构结构结构 光电管、晶体管放大线路和微电流表直读光电管、晶体管放大线路和微电流表直读光电管、晶体管放大线路和微电流表直读光电管、晶体管放大线路和微电流表直读特点特点特点特点 在可见光区灵敏度和稳定性比较好在可见光区灵敏度和稳定性比较好在可见光区灵敏度和稳定性比较好在可见光区灵敏度和稳定性比较好 751G型紫外型紫外可见分光光度计可见分光光度计 适用波长范围适用波长范围适用波长范围适用波长范围 200 2001000nm1000nm 二、分光光度测定方法 标准曲线法标准曲线法标准曲线法标准曲线法 A0C3 显色反应及其影响因素 n n有色物质 在其最大吸收波长处，测量吸光度灵敏度高n n无色或浅色物质 先显色后测定n n 显色反应的类型 螯合、氧化还原、生化3 显色反应及其影响因素 n n一、显色反应的要求一、显色反应的要求 n n 1、反应定量完成 n n 2、选择性要好 n n 3、灵敏度要高 n n 4、有色物质稳定性好 n n二、显色反应条件的选择二、显色反应条件的选择 1、显色剂的用量 n n2、溶液的酸度 n n3、显色时间 n n4、显色温度 4 测量误差与条件的选择一、读数误差 微分后得 变形 或T=36.8%相对误差小于相对误差小于相对误差小于相对误差小于4%4%时时时时 透光率透光率透光率透光率 65 6515%15%吸光度吸光度吸光度吸光度0.20.20.80.8二、偏离吸收定律引起的误差 n n1.单色光不纯的影响 n n2.溶液的性质 n n3.仪器误差 n n4、测量条件的选择 n n （1）入射光的波长 n n （2）吸光度范围 n n （3）参比溶液 5 紫外可见分光光度法应用实例 n n一、一、单组分含量测定单组分含量测定n n二、二、多组分含量测定多组分含量测定 n n三、三、配合物组成的测定配合物组成的测定 n n四、定性分析四、定性分析一、单组分含量测定 定量方法：根据朗伯定量方法：根据朗伯比耳定律关系式计算比耳定律关系式计算 标准曲线法标准曲线法1 1、1,10-1,10-邻二氮菲法测定微量铁邻二氮菲法测定微量铁 显色剂显色剂 1,10-1,10-邻二氮菲是有机配位剂之一。邻二氮菲是有机配位剂之一。配位比配位比 3:1 3:1 最大吸收波长最大吸收波长=512nm=512nm 1.110 1.1104 4LmolLmol-1-1cmcm-1-1。酸度范围酸度范围 pH pH为为3 39 9，醋酸缓冲溶液，醋酸缓冲溶液pH=4.5pH=4.55.05.0 还原剂还原剂 过量盐酸羟胺过量盐酸羟胺 测定铁含量测定铁含量 0.5 0.58gmL8gmL-1-1 2、磷钼蓝法测定全磷 n n样品处理样品处理 浓硫酸或高氯酸浓硫酸或高氯酸 n n H H3 3POPO4 412(NH12(NH4 4)2 2MoOMoO4 421HNO21HNO3 3(NH(NH4 4)3 3POPO4 412MoO12MoO3 312NH12NH4 4NONO3 312H12H2 2O On n 以还原剂如抗坏血还原酸磷钼黄杂多酸为磷以还原剂如抗坏血还原酸磷钼黄杂多酸为磷钼蓝钼蓝 n n 最大吸收波长最大吸收波长 660nm 660nm 3、土壤中氮含量的测定 n n （1 1）铵态氮）铵态氮 n n奈氏试剂处理奈氏试剂处理 ，在，在490490nmnm处测定线性范围为处测定线性范围为0.50.516g/mL 16g/mL n n （2 2）硝态氮）硝态氮 n n用酚二磺酸比色法在用酚二磺酸比色法在420420nmnm下测定下测定 ，线性范围，线性范围0.050.059 9gmLgmL-1 n n4、谷物蛋白质的测定 n n5、植物样品中可溶性糖的测定 n n6、酶活性测定 二二 多组分的测定多组分的测定n n 1 1、吸收峰互不重叠、吸收峰互不重叠 n n 2 2、吸收峰相互重叠、吸收峰相互重叠 三、配合物组成的测定 1 1、摩尔比法、摩尔比法 2 2、连续变化法、连续变化法