【教学课件】第十三章生物技术在植物育种中的应用.ppt

第十三章第十三章生物技术在植物育种中的应用生物技术在植物育种中的应用1、教学的基本要求、教学的基本要求（1）了解细胞工程与作物育种的原理）了解细胞工程与作物育种的原理和基本方法；和基本方法；（2）了解作物的转基因技术的原理和）了解作物的转基因技术的原理和基本方法；基本方法；（3）了解分子标记的主要类型和分子）了解分子标记的主要类型和分子标记辅助选择育种的原理和基本方法。标记辅助选择育种的原理和基本方法。2、教学基本内容、教学基本内容第一节第一节细胞工程与作物育种细胞工程与作物育种一、细胞和组织培养与作物育种一、细胞和组织培养与作物育种二、植物原生质体培养和体细胞杂交二、植物原生质体培养和体细胞杂交第二节第二节作物育种的转基因技术作物育种的转基因技术一、转基因技术的发展现状一、转基因技术的发展现状二、二、*转基因育种的程序转基因育种的程序三、转基因作物品种的选育三、转基因作物品种的选育四、转基因作物的生物安全性四、转基因作物的生物安全性第三节第三节分子标记辅助选择育种分子标记辅助选择育种一、一、*分子标记的类型和特点分子标记的类型和特点二、常用分子标记的原理和遗传特性二、常用分子标记的原理和遗传特性三、三、MAS育种方法育种方法第十三章第十三章生物技术在作物育种生物技术在作物育种中的应用中的应用第一节第一节 细胞工程与作物育种细胞工程与作物育种 植物细胞工程植物细胞工程（plant cell plant cell engineeringengineering）是以植物组织和细胞培养技是以植物组织和细胞培养技术为基础发展起来的一门学科。它以细胞术为基础发展起来的一门学科。它以细胞为基本单位，在体外（为基本单位，在体外（in vitroin vitro）条件下）条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞某些生物进行培养、繁殖或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿生产某种物质的过程。学特性按人们的意愿生产某种物质的过程。细胞工程与作物遗传改良有着密细胞工程与作物遗传改良有着密切关系，利用细胞工程技术已培育出切关系，利用细胞工程技术已培育出一些大面积推广的品种。一些大面积推广的品种。早期，哈布兰特在前人细胞学说的早期，哈布兰特在前人细胞学说的影响下，提出影响下，提出高等植物的组织和器官高等植物的组织和器官可以不断分割可以不断分割，并进一步提出了，并进一步提出了植物植物细胞全能性（细胞全能性（celltotipotency）理论。）理论。植物细胞全能性是植物细胞工植物细胞全能性是植物细胞工程的理论基础程的理论基础。细胞全能性是指细细胞全能性是指细胞所具有的形成各种细胞类型的潜胞所具有的形成各种细胞类型的潜在能力，也包括植物细胞经脱分化在能力，也包括植物细胞经脱分化再形成植株的能力。再形成植株的能力。1904年，年，Hanning用萝卜的胚培用萝卜的胚培养，获得小植株，为组织培养的工作奠养，获得小植株，为组织培养的工作奠定了基础。定了基础。1934年，年，White对番茄切段进行培对番茄切段进行培养，建立了第一个活跃生长的无性繁殖养，建立了第一个活跃生长的无性繁殖系，获得了离体培养的真正成功。系，获得了离体培养的真正成功。三年后，三年后，White又发现又发现B族维生素对族维生素对培养物的生长有重要作用。培养物的生长有重要作用。经过几年的努力，以经过几年的努力，以White为主为主的几位科学家建立了植物组织培养的几位科学家建立了植物组织培养（plainttissueculture）的综合培）的综合培养基，成为以后各种培养基的基础。养基，成为以后各种培养基的基础。1948年，年，Skoog等发现腺嘌呤等发现腺嘌呤/生长素生长素的比例是控制芽和根分化的决定因素之一，的比例是控制芽和根分化的决定因素之一，这一发现成为植物组织培养中控制器官形成这一发现成为植物组织培养中控制器官形成的激素模式。的激素模式。Miller（1956）发现激动素比腺嘌呤更）发现激动素比腺嘌呤更能促进芽的形成。能促进芽的形成。1958年，年，Stewart&Shautz从胡萝卜从胡萝卜根的根的悬浮细胞悬浮细胞诱导分化成完整小植株，使诱导分化成完整小植株，使50多年前哈布兰特提出的细胞全能性假说首次得多年前哈布兰特提出的细胞全能性假说首次得到科学验证，这一成果大大加速了植物组织培到科学验证，这一成果大大加速了植物组织培养研究的发展。养研究的发展。1964年，年，Guha等从曼佗罗等从曼佗罗花药花药培养出培养出单倍体植株。单倍体植株。1970年，年，Kameya等利用等利用花粉花粉培养获培养获得单倍体植株。得单倍体植株。1971年，年，Takebe等首次从烟草等首次从烟草原生质原生质体体获得再生植株；获得再生植株；1972年，年，Carlson等获得第一个烟草等获得第一个烟草种种间体细胞杂种间体细胞杂种植株。植株。至此，在愈伤组织水平、单个细胞至此，在愈伤组织水平、单个细胞水平、单个生殖细胞水平、原生质体水水平、单个生殖细胞水平、原生质体水平和体细胞杂种水平都获得了完整植株，平和体细胞杂种水平都获得了完整植株，充分证实了植物细胞的全能性。充分证实了植物细胞的全能性。植物组织培养流程示意图如下。植物组织培养流程示意图如下。外植体来源外植体来源外植体培养外植体培养愈伤组愈伤组织织再生小植株再生小植株再生植株再生植株植物细胞工程的应用在植物细胞工程的应用在20世纪世纪60年代就已受到重视，但真正的应用研究年代就已受到重视，但真正的应用研究在在70年代才进入高潮。我国第一个用花年代才进入高潮。我国第一个用花药培养育成烟草品种，随后又育成了一药培养育成烟草品种，随后又育成了一些水稻、小麦新品种。些水稻、小麦新品种。经济植物的经济植物的快繁与脱毒快繁与脱毒、体细胞变异的、体细胞变异的筛选、新种质的创造、细胞器的移植、筛选、新种质的创造、细胞器的移植、DNA的导入等均对作物改良和农业生产起到了促的导入等均对作物改良和农业生产起到了促进作用。进作用。一、一、植物的细胞和组织培养技术植物的细胞和组织培养技术（一）培养基及其组成（一）培养基及其组成 1 1、培养基（、培养基（MediumMedium）的种类和）的种类和特点特点常用的培养基有常用的培养基有MS、B5、White、N6、KM-8p、SH等。等。2、培养基的成分、培养基的成分培养基中都应包括植物生长必需的培养基中都应包括植物生长必需的16种种营养元素和某些生理活性物质，通常将这些营养元素和某些生理活性物质，通常将这些物质分为三大类，即无机营养物、有机物质物质分为三大类，即无机营养物、有机物质和植物生长调节物质（表）。和植物生长调节物质（表）。表表植物组织培养所需的养分和激素植物组织培养所需的养分和激素水水有机物有机物大量元素大量元素微量元素微量元素PH糖糖NFeCo氨基酸氨基酸PZnNi维生素维生素KBAl生长素生长素CaMnMo细胞分裂素细胞分裂素MgCuI调节物质调节物质赤霉素赤霉素S脱落酸脱落酸乙烯乙烯酵母提取物酵母提取物椰子汁椰子汁成分不定物质成分不定物质植物提取物植物提取物水解酪蛋白水解酪蛋白蛋白胨蛋白胨（二）培养基的配制（二）培养基的配制1、母液的配制、母液的配制为了为了减少配制培养基时每次称量药减少配制培养基时每次称量药品的麻烦，减少极微量药品在每次称重品的麻烦，减少极微量药品在每次称重时误差时误差，一般先配制，一般先配制高浓度的储备液，高浓度的储备液，即即母液母液。大量元素可配成大量元素可配成10倍母液倍母液，使用，使用时每配制时每配制1000ml培养基需要从母液培养基需要从母液中取中取100ml。配制母液时应做到分别。配制母液时应做到分别称量，充分溶解，在混合次序上应最称量，充分溶解，在混合次序上应最后加入后加入Ca2+，混合时要边加边，混合时要边加边混合。混合。微量元素因为使用量低，一般配微量元素因为使用量低，一般配成成100倍甚至倍甚至1000倍母液倍母液，使用时每配，使用时每配制制1L培养基从母液中取培养基从母液中取10ml或或1ml，配制时应注意充分溶解后再依次混合。配制时应注意充分溶解后再依次混合。第三种母液即铁盐，第三种母液即铁盐，铁盐必须单铁盐必须单独配制，独配制，若与其它元素混合易造成沉若与其它元素混合易造成沉淀。淀。一般采用鳌合铁一般采用鳌合铁，即，即FeSO4与与EDTA钠盐的混合物，一般扩大钠盐的混合物，一般扩大200倍。倍。EDTA钠盐须用温水溶解，然钠盐须用温水溶解，然后与后与FeSO4液混合，在液混合，在7580之间让其鳌合之间让其鳌合1h。使用鳌合铁的使用鳌合铁的目的是避免沉淀，并使培养基能缓目的是避免沉淀，并使培养基能缓慢不断地供应慢不断地供应Fe+。第四种母液为有机化合物母液，主要是第四种母液为有机化合物母液，主要是维生素和氨基酸类物质，维生素和氨基酸类物质，这类物质不能配成这类物质不能配成混合母液，混合母液，一定要分别配成单独的母液，一定要分别配成单独的母液，浓浓度为每毫升含度为每毫升含0.1、1、10mg，使用时根，使用时根据需要量取。据需要量取。最后一种母液是激素，最后一种母液是激素，每种激素每种激素应单独配制母液应单独配制母液，其浓度为，其浓度为0.1、0.5或或1.0mg/ml。多种激素难溶于水，。多种激素难溶于水，配制时应注意溶解次序。配制时应注意溶解次序。IAA、NAA、GA3、玉米素先溶于少、玉米素先溶于少量量95%酒精，再加水定容；酒精，再加水定容；NAA可溶于热可溶于热水或少量酒精后，再加水定容；水或少量酒精后，再加水定容；2，4-D不不溶于水，可用溶于水，可用1mol的的NaOH溶解后再定容；溶解后再定容；KT和和BA应先溶于少量应先溶于少量1molHCl中，然后中，然后定容。定容。表表一些植物组织培养基的成分（一些植物组织培养基的成分（mg/L）-成分成分MSB5ORWhiteNitschSHHellerLSER-大量元素大量元素NH4NO31650-1650-720-16501200KNO319002527.51900809502500-19001900CaCl2 2H2O440150-20075440440CaCl2-440-166-MgSO4 7H2O370246.5370750185400250370370KH2PO4170-170-68-170340NH4H2PO4-340-（NH4）2SO4-134-Ca（NO3）2 4H2O-300-NaNO3-600-NaH2PO4 H2O-150-19-125-KCl-65-750-成分成分MSB5ORWhiteNitschSHHellerLSER-微量元素微量元素KI 0.83 0.75 3.32 0.75 -1 0.01 0.83 -KI 0.83 0.75 3.32 0.75 -1 0.01 0.83 -H H3 3BOBO3 3 6.2 3 24.8 1.5 10 5 1 6.2 0.63 6.2 3 24.8 1.5 10 5 1 6.2 0.63MnSOMnSO4 44H4H2 2O 22.3 -89.2 5 25 -0.1 22.3 2.23O 22.3 -89.2 5 25 -0.1 22.3 2.23MnSOMnSO4 4HH2 2O -10 -10 -O -10 -10 -Zn SOZn SO4 47H7H2 2O 8.6 2 34.4 3 10 1 1 8.6 -O 8.6 2 34.4 3 10 1 1 8.6 -Zn SOZn SO4 44H4H2 2O -O -Zn NaZn Na2 2EDTA -15EDTA -15NaNa2 2MoOMoO4 42H2H2 2O 0.25 0.25 1.0 -0.25 0.1 -0.25 0.025O 0.25 0.25 1.0 -0.25 0.1 -0.25 0.025MoOMoO3 3 -0.001 -0.001 -Cu SOCu SO4 4 -0.2 -0.2 -Cu SOCu SO4 45H5H2 2O 0.025 0.025 0.1 0.01 0.025 -0.03 0.025 0.0025O 0.025 0.025 0.1 0.01 0.025 -0.03 0.025 0.0025CoClCoCl2 26H6H2 2O 0.025 0.025 0.1 -0.1 -0.025 0.0025O 0.025 0.025 0.1 -0.1 -0.025 0.0025CoSOCoSO4 47H7H2 2O -0.03 -O -0.03 -AlClAlCl3 3 -NiClNiCl2 26H6H2 2O -0.03 -O -0.03 -铁盐成分铁盐成分MSB5ORWhiteNitschSHHellerLSER-FeCl366H2O-1-Fe2(SO4)3-2.5-FeSO477H2O27.8-27.8-27.815-27.827.8Na2EDTA2HEDTA2H2 2O O37.3-37.3-37.320-37.337.3NaFe EDTA-28-1-成分成分MSB5ORWhiteNitschSHHellerLSER有机物有机物盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇0.5110.010.50.5-0.5盐酸硫胺素盐酸硫胺素0.110130.010.55-0.40.5烟酸烟酸0.5110.0555-0.5肌醇肌醇100100100-1001000-100-甘氨酸甘氨酸2-32-2脯氨酸脯氨酸-1381-叶酸叶酸-0.5-生物素生物素-0.05-蔗糖蔗糖3%2%3%2%2%3%-3%4%2、培养基的配制、培养基的配制以配制以配制1L培养基为例，培养基配制方法培养基为例，培养基配制方法如下：如下：混合各成分母液。取大量元素混合各成分母液。取大量元素母液母液100ml、微量元素母液、微量元素母液10ml、铁、铁盐母液盐母液5ml于一个于一个1L烧杯中，依次加烧杯中，依次加入有机成分和激素，并加水至入有机成分和激素，并加水至500ml。熔化琼脂：称熔化琼脂：称78g琼脂和所需琼脂和所需蔗糖于另一蔗糖于另一1L烧杯中，加水至烧杯中，加水至500ml，待糖溶解后，加热使琼脂充分熔化。，待糖溶解后，加热使琼脂充分熔化。将（将（1）和（）和（2）混合，搅拌均匀，）混合，搅拌均匀，补水至补水至1000ml。调调PH。一般用。一般用0.1molNaOH或或1NHCl调调PH至所需至所需PH。一般。一般PH调至调至5.8，但，但也有也有PH调到调到7.0的，不同材料的最适的，不同材料的最适PH不一不一样。对培养基的凝固来说，样。对培养基的凝固来说，PH较高时，培养较高时，培养基过硬，不便于培养材料吸收营养；基过硬，不便于培养材料吸收营养；PH过低，过低，低到低到4.0以下时，培养基很难凝固。以下时，培养基很难凝固。分装：将培养基分装于分装：将培养基分装于100ml或或50ml三角瓶中，每瓶三角瓶中，每瓶50或或30ml左左右，封口包装。右，封口包装。灭菌：一般用灭菌：一般用1.1kg/cm2压力，压力，在在121下灭菌下灭菌1520min。灭菌时间。灭菌时间应根据材料掌握。时间短，灭菌不彻底；应根据材料掌握。时间短，灭菌不彻底；时间长，会引起培养基成分降解。时间长，会引起培养基成分降解。放置备用。灭菌后取出培养瓶放置备用。灭菌后取出培养瓶放置在培养台上，使之冷却凝固。培放置在培养台上，使之冷却凝固。培养瓶应平放，以免形成斜面。养瓶应平放，以免形成斜面。（三）无菌操作方法（三）无菌操作方法1、消毒剂、消毒剂在接种前，必须使材料完全无菌，这是在接种前，必须使材料完全无菌，这是取得植物组织培养成功的基本保证。要保证取得植物组织培养成功的基本保证。要保证这一点，取材时应选取植物组织内部无菌的这一点，取材时应选取植物组织内部无菌的材料。从健壮植株上取材，不要有伤口；严材料。从健壮植株上取材，不要有伤口；严格防止病虫。格防止病虫。应在晴天取材，最好中午或下午取材。应在晴天取材，最好中午或下午取材。最好避免选用田间材料，选用无菌苗较好。最好避免选用田间材料，选用无菌苗较好。非要用田间材料时，为避免消毒困难，可将非要用田间材料时，为避免消毒困难，可将材料种在大棚或生长箱里。常用的消毒剂见材料种在大棚或生长箱里。常用的消毒剂见表。表。表表植物材料消毒常用的消毒剂及使用方法植物材料消毒常用的消毒剂及使用方法-消毒剂消毒剂使用浓度使用浓度消除难易消除难易消毒时间消毒时间消毒效果消毒效果（%）（min）-次氯酸钠次氯酸钠2易易530很好很好次氯酸钙次氯酸钙910易易530很好很好漂白粉漂白粉饱和溶液饱和溶液易易530很好很好氯化汞氯化汞0.11.0较难较难210最好最好酒精酒精7075易易0.22好好H2O21012最易最易515好好溴水溴水12 易易210很好很好AgNO31较难较难530好好抗生素抗生素450mg/L中中3060较好较好对于难消毒的材料，如有茸毛的、粗糙对于难消毒的材料，如有茸毛的、粗糙不平的材料等，在消毒前，一般先用肥皂水不平的材料等，在消毒前，一般先用肥皂水洗，自来水冲净，在洗，自来水冲净，在70%酒精或酒精或1LHCl中中浸浸30s，再加入消毒剂。不同的材料消毒的，再加入消毒剂。不同的材料消毒的方式和所需时间不一样，研究者应根据不同方式和所需时间不一样，研究者应根据不同材料确定具体消毒方案。材料确定具体消毒方案。2、无菌操作、无菌操作准备好接种材料用的培养基、待消毒的材准备好接种材料用的培养基、待消毒的材料、无菌水、无菌烧杯及其它必需玻璃器皿、料、无菌水、无菌烧杯及其它必需玻璃器皿、无菌操作工具（如剪刀、镊子、解剖刀等，这无菌操作工具（如剪刀、镊子、解剖刀等，这些工具可用高温消毒，也可用高压高温灭菌，些工具可用高温消毒，也可用高压高温灭菌，也可随用随消毒）、也可随用随消毒）、70%酒精等。酒精等。将超净工作台打开，让其运行将超净工作台打开，让其运行10min左左右，在超净工作台上打开烧杯和无菌水瓶盖，右，在超净工作台上打开烧杯和无菌水瓶盖，将将HgCl2（0.1%）倒入有待消毒材料的烧杯）倒入有待消毒材料的烧杯中，中，510min后取出另一盛有无菌水的烧杯后取出另一盛有无菌水的烧杯中，无菌水冲洗中，无菌水冲洗34次，然后将材料取出接种次，然后将材料取出接种在培养基中，封口，放入培养室培养。在培养基中，封口，放入培养室培养。无菌操作时应注意下面几个问题：整过无菌操作时应注意下面几个问题：整过操作过程一切用具必须始终保持无菌状态；操作过程一切用具必须始终保持无菌状态；无菌操作前必须用肥皂洗手，然后用无菌操作前必须用肥皂洗手，然后用70%酒酒精洗手；操作时无菌器皿一旦打开，应尽量精洗手；操作时无菌器皿一旦打开，应尽量避免手再从其上横过；避免强呼吸，呼吸时避免手再从其上横过；避免强呼吸，呼吸时应将脸移开超净台；每次重新操作都要把工应将脸移开超净台；每次重新操作都要把工具在火焰上消毒，避免交叉污染。具在火焰上消毒，避免交叉污染。3、无菌培养、无菌培养材料接种后移入培养室培养，一般材料接种后移入培养室培养，一般培养室要求非常卫生，恒温，有理想的培养室要求非常卫生，恒温，有理想的光照控制系统，一般材料要求光照控制系统，一般材料要求25左左右，晚上一般不低于右，晚上一般不低于20。二、二、细胞和组织培养与作物育种细胞和组织培养与作物育种（一）（一）体细胞克隆变异及其育种利用体细胞克隆变异及其育种利用在近在近50年中，以植物组织培养年中，以植物组织培养为基础的生物技术的研究与发展为植为基础的生物技术的研究与发展为植物育种提供了一些新的实验方法和手物育种提供了一些新的实验方法和手段，并且培养出一些在生产上有利用段，并且培养出一些在生产上有利用价值的品种。价值的品种。体细胞克隆变异指植物组织和体细体细胞克隆变异指植物组织和体细胞培养物在培养过程中产生的变异胞培养物在培养过程中产生的变异。Larkin等（等（1981）在其综述文章中开始）在其综述文章中开始使用使用“体细胞克隆变异体细胞克隆变异”（somaclonalvariation）这一概念。）这一概念。为了区分来源于体细胞和单倍体细为了区分来源于体细胞和单倍体细胞的变异，胞的变异，Evans将将来自配子体组织的来自配子体组织的变异称为变异称为“配子体克隆变异配子体克隆变异”（gametoclonalvariation），以），以与体细胞克隆变异区分开。与体细胞克隆变异区分开。对于遗传变异的分析而言，对于遗传变异的分析而言，Orton为了为了统一术语，引进了统一术语，引进了R0、R1、R2等，分别表示等，分别表示再生再生当代、自交第一代、第二代等，至今这当代、自交第一代、第二代等，至今这一概念还在广泛应用。一概念还在广泛应用。1、体细胞克隆变异的遗传基础、体细胞克隆变异的遗传基础（1）染色体数目变异）染色体数目变异最多最多见的是多倍体，主要是培养基中使见的是多倍体，主要是培养基中使用了细胞分裂素。用了细胞分裂素。变异的大小与培养状态、年龄、变异的大小与培养状态、年龄、原始材料的倍性及培养时期有关。研原始材料的倍性及培养时期有关。研究发现：二倍体变异的频率随培养时究发现：二倍体变异的频率随培养时间的延长而降低，四倍体变异的频率间的延长而降低，四倍体变异的频率却随培养时间的延长而增加。却随培养时间的延长而增加。（2）染色体结构变异）染色体结构变异染色体结构变染色体结构变异似乎是体细胞克隆变异的主要来源，最重要异似乎是体细胞克隆变异的主要来源，最重要的是染色体缺失、倒位、重复和异位。很多体的是染色体缺失、倒位、重复和异位。很多体细胞再生株减数分裂时形成多价体、染色体桥、细胞再生株减数分裂时形成多价体、染色体桥、小片段、环等，充分说明了染色体结构变异的小片段、环等，充分说明了染色体结构变异的存在。存在。（3）点突变）点突变这类突变可分为多种类这类突变可分为多种类型，一种类型是型，一种类型是自发突变自发突变，最早证实点突变，最早证实点突变存在的是从烟草中利用体外筛选获得抗存在的是从烟草中利用体外筛选获得抗chlorsulfuron的突变体。很多通过细胞筛选的突变体。很多通过细胞筛选获得的抗病、抗除草剂等突变体属于此类。获得的抗病、抗除草剂等突变体属于此类。另一种点突变是诱发突变，培养另一种点突变是诱发突变，培养基中加入化学诱变剂或进行诱变处理。基中加入化学诱变剂或进行诱变处理。由于培养过程中，培养物一直处于诱由于培养过程中，培养物一直处于诱变的环境条件下，所以突变究竟是变的环境条件下，所以突变究竟是自自发发还是还是诱发诱发很难搞清楚。很难搞清楚。第三种点突变是第三种点突变是基因的表达及基因放大基因的表达及基因放大或衰减。或衰减。高等植物的某些基因在发育过程中高等植物的某些基因在发育过程中受到某一环境刺激，可以受到某一环境刺激，可以放大自己，即基因放大自己，即基因的拷贝数大量增加的拷贝数大量增加，这意味着该基因转录的，这意味着该基因转录的mRNA及蛋白质增加。最初在动物细胞培养及蛋白质增加。最初在动物细胞培养中发现这一现象，后来在植物中发现也存在。中发现这一现象，后来在植物中发现也存在。比如，对某一物质的抗性，可以通过逐比如，对某一物质的抗性，可以通过逐步增加浓度的办法而使细胞对该物质的抗性步增加浓度的办法而使细胞对该物质的抗性提高很多倍，这就是基因放大系统存在的很提高很多倍，这就是基因放大系统存在的很好例证。同样，也发现植物细胞好例证。同样，也发现植物细胞DNA的丢失的丢失（衰减），（衰减），如大豆悬浮系经过较长时间的培如大豆悬浮系经过较长时间的培养，其核糖体基因丢失了养，其核糖体基因丢失了1/3。第四种点突变是有丝分裂交换。这种交第四种点突变是有丝分裂交换。这种交换尽管很微弱地改变了基因的顺序，但仍影换尽管很微弱地改变了基因的顺序，但仍影响基因的表达。这种变化包括：某一基因拷响基因的表达。这种变化包括：某一基因拷贝的丢失，某一基因拷贝的重复或修复过程贝的丢失，某一基因拷贝的重复或修复过程中基因的转变。中基因的转变。转座因子也是造成体细胞突变的原因之转座因子也是造成体细胞突变的原因之一，转座子通过插入与解离使某些基因的表一，转座子通过插入与解离使某些基因的表达受到调控。达受到调控。最后细胞质基因叶绿体和线粒体基因也最后细胞质基因叶绿体和线粒体基因也能发生突变。能发生突变。Gengenbachetal（1975）利用玉米利用玉米T小种毒素筛选获得了抗小种毒素筛选获得了抗T小种的细小种的细胞系，这个基因已知位于胞质中。胞系，这个基因已知位于胞质中。离体培养细胞会产生各种类型的突离体培养细胞会产生各种类型的突变体，除抗性突变体外，还有形态性状变体，除抗性突变体外，还有形态性状突变体、不育性、产量和品质性状的改突变体、不育性、产量和品质性状的改变等。形态变异如矮化性、叶型等，利变等。形态变异如矮化性、叶型等，利用这些变异可以进行高光效育种。用这些变异可以进行高光效育种。培养再生植株中出现不育性的频率较高，培养再生植株中出现不育性的频率较高，但大多为核基因的突变，可以用来培育不育但大多为核基因的突变，可以用来培育不育系。产量和品质的突变必须在田间通过适当系。产量和品质的突变必须在田间通过适当的分析才能确定。实验室内细胞水平的突变的分析才能确定。实验室内细胞水平的突变体筛选多数在抗性突变体方面开展工作，如体筛选多数在抗性突变体方面开展工作，如抗病、耐盐、抗重金属等。抗病、耐盐、抗重金属等。2、突变体的筛选、突变体的筛选为了增加突变频率，需要进行诱变处理。为了增加突变频率，需要进行诱变处理。将外植体、愈伤或悬浮系用诱变剂处理，如将外植体、愈伤或悬浮系用诱变剂处理，如使用化学诱变剂，要充分洗涤后再进入下一使用化学诱变剂，要充分洗涤后再进入下一步的工作。使用多大剂量和处理多长时间才步的工作。使用多大剂量和处理多长时间才能达到较好诱变效果，应根据具体试验确定。能达到较好诱变效果，应根据具体试验确定。在突变体筛选中常采用两种选择法，即在突变体筛选中常采用两种选择法，即一步筛选法和多步筛选法。一步筛选法和多步筛选法。一步筛选法是一步筛选法是将培养物接种在含有最低将培养物接种在含有最低全部致死剂量的培养基上全部致死剂量的培养基上，表现出生长的培，表现出生长的培养物再转移到含有抑制剂的新鲜培养基上。养物再转移到含有抑制剂的新鲜培养基上。可以看出，这种方法是一次就把可以看出，这种方法是一次就把筛选压设定很高筛选压设定很高，使不抗细胞（野生，使不抗细胞（野生细胞）完全不可能生长，筛选出的能细胞）完全不可能生长，筛选出的能生长的细胞即为耐（抗）性细胞系。生长的细胞即为耐（抗）性细胞系。但在有些情况下这种方法不一定实用，但在有些情况下这种方法不一定实用，有的细胞在超过最低全部致死浓度时，细胞有的细胞在超过最低全部致死浓度时，细胞均死亡，或单个细胞不能生存。多步筛选法均死亡，或单个细胞不能生存。多步筛选法是首先使用半致死剂量对细胞进行筛选，每是首先使用半致死剂量对细胞进行筛选，每次继代将上代能生长的细胞系继代到筛选剂次继代将上代能生长的细胞系继代到筛选剂浓度提高的新鲜培养基上。浓度提高的新鲜培养基上。在这种筛选体制下，抗性细胞应在这种筛选体制下，抗性细胞应该比野生细胞长的快，通过逐步增加该比野生细胞长的快，通过逐步增加筛选剂水平，最终会筛选出在抑制剂筛选剂水平，最终会筛选出在抑制剂超过最低全部致死浓度时也能旺盛生超过最低全部致死浓度时也能旺盛生长的细胞系。长的细胞系。但是，去除抑制剂后，抗性培养物的稳但是，去除抑制剂后，抗性培养物的稳定性是常出现的一个问题，抗性丢失来自很定性是常出现的一个问题，抗性丢失来自很多原因，包括细胞对抑制剂的生理适应。可多原因，包括细胞对抑制剂的生理适应。可见，多步筛选易获得在某一抑制剂水平下，见，多步筛选易获得在某一抑制剂水平下，细胞稳定生长的细胞系。细胞稳定生长的细胞系。筛选的材料对象可以是原生质体、愈筛选的材料对象可以是原生质体、愈伤块、悬浮培养物和花粉伤块、悬浮培养物和花粉/小孢子培养物。小孢子培养物。利用原生质体进行抗性筛选有一大优点：利用原生质体进行抗性筛选有一大优点：筛选出的克隆极有可能来自单细胞，但是筛选出的克隆极有可能来自单细胞，但是操作困难。操作困难。利用愈伤块筛选是最简单的方法，但这利用愈伤块筛选是最简单的方法，但这种筛选存在一定缺陷，愈伤块里的各个细胞种筛选存在一定缺陷，愈伤块里的各个细胞不能均等地接触抑制剂，下部愈伤细胞比上不能均等地接触抑制剂，下部愈伤细胞比上部细胞吸收到较多的抑制剂，这样就使筛选部细胞吸收到较多的抑制剂，这样就使筛选结果在一定程度上失去可靠性。结果在一定程度上失去可靠性。悬浮细胞筛选也很常用，细胞接触选择悬浮细胞筛选也很常用，细胞接触选择剂较均匀，但存在一定的操作复杂性。花粉剂较均匀，但存在一定的操作复杂性。花粉/小孢子培养物用于突变体筛选有一定优势，小孢子培养物用于突变体筛选有一定优势，突变体很容易表现出来，也很易纯合。突变体很容易表现出来，也很易纯合。3、在作物改良上的应用、在作物改良上的应用利用上述方法便可筛选体细胞克隆变利用上述方法便可筛选体细胞克隆变异，将这一技术应用于作物改良技术路线异，将这一技术应用于作物改良技术路线见图。见图。优良品种优良品种细胞培养细胞培养R0R1群体群体改良的体细胞克隆改良的体细胞克隆确定遗传方式确定遗传方式田间实验田间实验遗传稳定性测试遗传稳定性测试多点田间实验多点田间实验育成新品系育成新品系继续田间实验，种子富集继续田间实验，种子富集区域试验区域试验审审定定投入生产投入生产图图利用体细胞克隆变异育种的技术路线利用体细胞克隆变异育种的技术路线（二）（二）单倍体细胞培养及育种利用单倍体细胞培养及育种利用1、单倍体细胞培养在遗传和育种中的应用价值、单倍体细胞培养在遗传和育种中的应用价值花药培养（花药培养（antherculture）是指在获得）是指在获得单倍体的一种技术，之后，花粉和小孢子培养单倍体的一种技术，之后，花粉和小孢子培养逐渐获得成功，从而使单倍体细胞培养体系更逐渐获得成功，从而使单倍体细胞培养体系更加完善。单倍体在遗传和育种研究中有如下优加完善。单倍体在遗传和育种研究中有如下优点：点：（1）后代的快速纯合）后代的快速纯合通过单倍体迅通过单倍体迅速产生纯系。在异花授粉作物中，可用单倍速产生纯系。在异花授粉作物中，可用单倍体产生加倍单倍体（体产生加倍单倍体（DH系），从中筛选纯合系），从中筛选纯合自交系用于杂交制种。由于加速纯合，从而自交系用于杂交制种。由于加速纯合，从而就缩短了育种周期（图）。就缩短了育种周期（图）。母本母本父本父本F1花药培养花药培养F2花粉植株花粉植株加倍加倍品系比较试验品系比较试验选择鉴定选择鉴定区域试验区域试验图图杂交育种与单倍体育种的周期比较杂交育种与单倍体育种的周期比较（2）提高选择效率）提高选择效率如果某一性状受如果某一性状受一对基因控制，在一对基因控制，在AAaaF2中，纯合中，纯合AA个体只有个体只有1/4。如。如F1采用花药或花粉培养，采用花药或花粉培养，产生的后代中产生的后代中AA个体占个体占1/2，比常规杂交，比常规杂交育种提高一倍。育种提高一倍。（3）排除杂种优势对后代选择的干扰）排除杂种优势对后代选择的干扰对于杂交育种来讲，由于低世代很多基因位对于杂交育种来讲，由于低世代很多基因位点尚处于杂合状态，会有不同程度的杂种优点尚处于杂合状态，会有不同程度的杂种优势表现，对个体的选择会造成一定误差。采势表现，对个体的选择会造成一定误差。采用用DH群体进行选择育种，由于各基因位点群体进行选择育种，由于各基因位点在理论上均处于纯合状态，选择到的变异能在理论上均处于纯合状态，选择到的变异能更大程度上代表真实变异。更大程度上代表真实变异。（4）遗传研究的良好材料体系）遗传研究的良好材料体系单倍体单倍体是基因互作检测、遗传变异估是基因互作检测、遗传变异估计、连锁群构计、连锁群构建、建、QTL估计及定位等数量遗传学的良好材估计及定位等数量遗传学的良好材料。尤其是近代分子生物学的发展，料。尤其是近代分子生物学的发展，DH系系成为分子标记作图的良好群体，它在一定程成为分子标记作图的良好群体，它在一定程度上成为一种永久度上成为一种永久BC或或F2群体。群体。（5）突变体的筛选突变体的筛选由于单倍体的各由于单倍体的各基因均处于纯合状态，突变体很容易表现出基因均处于纯合状态，突变体很容易表现出来，从而大大提高了抗性或其它突变体的筛来，从而大大提高了抗性或其它突变体的筛选效率，利用这一体系获得各种突变体的事选效率，利用这一体系获得各种突变体的事例已很多，这里就不一一赘述。例已很多，这里就不一一赘述。2、离体培养条件下的小孢子发育、离体培养条件下的小孢子发育小孢子母细胞经减数分裂形成四分体小孢小孢子母细胞经减数分裂形成四分体小孢子，然后经单核早期、单核靠边期、双核期子，然后经单核早期、单核靠边期、双核期（一个营养核和一个生殖核），最后到达三核（一个营养核和一个生殖核），最后到达三核期而成为成熟花粉粒。在离体培养条件下，花期而成为成熟花粉粒。在离体培养条件下，花粉的正常发育途径受到抑制。粉的正常发育途径受到抑制。3、影响花药培养的因素、影响花药培养的因素（1）供体植株的生长条件）供体植株的生长条件供体植株供体植株的生长条件对培养效果有重要影响，有时只的生长条件对培养效果有重要影响，有时只有在控温、一定光周期和光强的条件下，其有在控温、一定光周期和光强的条件下，其花药才能有反应。环境条件对于不同的植物花药才能有反应。环境条件对于不同的植物种有很大不同，所以没有一个固定的环境控种有很大不同，所以没有一个固定的环境控制模式。制模式。（2）供体植株的年龄供体植株的年龄供体植株对培供体植株对培养效果也有一定影响，一般讲，开花初期植养效果也有一定影响，一般讲，开花初期植株的花蕾易于培养。株的花蕾易于培养。（3）花粉发育时期）花粉发育时期用于培养的花蕾，用于培养的花蕾，其花药内小孢子发育时期对培养效果有较大其花药内小孢子发育时期对培养效果有较大影响，但因物种而异。在烟草中，处于第一影响，但因物种而异。在烟草中，处于第一次有丝分裂期的花粉效果最好，而在禾本科次有丝分裂期的花粉效果最好，而在禾本科和芸苔属中，单核早期最好。和芸苔属中，单核早期最好。（4）花蕾和花药的预处理花蕾和花药的预处理对于有些物种，对于有些物种，培养前对花药和花蕾进行预处理，能显著提高培养培养前对花药和花蕾进行预处理，能显著提高培养效果。如大麦花药，效果。如大麦花药，4处理处理28d，或，或7处理处理14d，能收到最好效果。可对整穗、小穗、甚至分离的，能收到最好效果。可对整穗、小穗、甚至分离的花药施加预处理，只要注意处理期间不要与水接触。花药施加预处理，只要注意处理期间不要与水接触。也有人将花药接种后放在低温下预处理，不同材料也有人将花药接种后放在低温下预处理，不同材料需不同的预处理方式，没有一个固定模式。需不同的预处理方式，没有一个固定模式。（5）培养基）培养基究竟使用固体或液体培究竟使用固体或液体培养基应根据培养材料的要求定。多数情况下，养基应根据培养材料的要求定。多数情况下，MSMS、N N6 6及马铃薯提取液培养基在禾谷类作物及马铃薯提取液培养基在禾谷类作物中用的较多。花药培养时往往需要一定的渗中用的较多。花药培养时往往需要一定的渗透压，有的要求低浓度的蔗糖（透压，有的要求低浓度的蔗糖（2%2%4%4%），有），有的要求高浓度的蔗糖（的要求高浓度的蔗糖（8%8%12%）。）。二细胞结构的成熟花粉往往需低浓度糖，二细胞结构的成熟花粉往往需低浓度糖，而三细胞结构的成熟花粉植物往往需高渗条而三细胞结构的成熟花粉植物往往需高渗条件，如油菜小孢子培养时，糖的浓度可用到件，如油菜小孢子培养时，糖的浓度可用到13%17%。培养基中所添加的维生素和激。培养基中所添加的维生素和激素对培养效果可产生重要影响。对于某些植素对培养效果可产生重要影响。对于某些植物种来讲，添加某种植物的提取物或椰汁可物种来讲，添加某种植物的提取物或椰汁可以改善