《切片制作技术》PPT课件.ppt

病理切片制作技术l第一章第一章组织的取材和固定方法的取材和固定方法 l第二章第二章组织切片技切片技术 l第三章第三章苏木精木精-伊伊红染色方法染色方法第一章第一章组织的取材和固定方法的取材和固定方法l病病理理标本本的的检查应包包括括大大体体和和显微微镜下下观察察二二个个方方面面，而而正正确确的的诊断断往往往往取取决决于于准准确确的的显微微镜下下观察察，因因此此，制制片片质量量的的好好坏将直接影响坏将直接影响诊断断结果的准确性，甚至会果的准确性，甚至会带来来错误的的结果。果。l 近近年年来来，免免疫疫组织化化学学方方法法在在病病理理学学上上应用用越越来来越越广广泛泛，对取取材材的的要要求求也也越越来来越越高高，不不仅要要求求组织细胞胞的的形形态保保存存完完整整，而而且且要要求求最最大大程程度度的的保保存存组织或或细胞胞成成分分的的抗抗原原性性。抗抗原原性性不不受受损伤是是一一方方面面，还要要求求不不能能弥弥散散，否否则，对于于抗抗原原含含量量较少少的的标本本，抗抗原原性性完完全全丧失失，产生生假假阳阳性性结果果，影影响响病病理理诊断断的的准准确确性性，甚甚至抗原的定位也无从至抗原的定位也无从谈起。起。第一节第一节第一节第一节 取材取材取材取材 从从大大体体标本本上上按按照照病病理理检查的的目目的的和和要要求求切切取取适适当当大大小小的的组织块，供制片，供制片进行行显微微镜检查。l一、取材一、取材时对送送检组织的要求的要求l二、取材二、取材l三、取材三、取材时的注意事的注意事项l四、冰四、冰冻切片取材切片取材一、取材一、取材一、取材一、取材时对时对送送送送检组织检组织的要求的要求的要求的要求l送送检组织切取后切取后应立即放入立即放入10%10%福福尔马林溶液内固定；林溶液内固定；l尸尸检标本本应争取在死亡后尽可能短的争取在死亡后尽可能短的时间内取材；内取材；l有有特特殊殊要要求求（如如细菌菌培培养养、结石石的的化化学学成成分分分分析析等等）须事事先先联系系，在在标本未固定前本未固定前进行行处理。理。二、取材二、取材二、取材二、取材 对送送检组织应进行行详细检查，根根据据诊断断的的需需要要，确确定定取取材材的的部部位和位和块数；数；切切取取的的组织要要按按不不同同部部位位分分别给予予不不同同的的编号号或或标记，以以便便镜检时查对。三、取材三、取材三、取材三、取材时时的注意事的注意事的注意事的注意事项项l1 1注注意意防防止止人人为损伤 切切取取组织的的刀刀具具应锋利利、薄薄；切切取取组织块时，避避免免前前后后拉拉动或或用力用力挤压组织，避免使用有，避免使用有齿镊，引起，引起组织结构的构的变形和形和损伤。l2 2标本大小本大小经修整后的修整后的组织大小以大小以1.5cm1.5cm 1.5cm1.5cm 0.2-0.3cm0.2-0.3cm为宜。宜。l3 3取材取材时间原原则上上应尽快取材。尽快取材。l4 4注注意意包包埋埋方方向向 需需指指定定包包埋埋面面的的应作作记号号表表明明。如如皮皮肤肤组织的的包包埋埋面面应与与表表面面垂垂直直，才能保才能保证皮肤的各皮肤的各层结构都能被构都能被观察到。察到。l5 5小小标本本的的处理理方方法法 较小小的的标本本（如如穿穿刺刺材材料料等等）常常常常用用易易透透水水的的薄薄纸包包好好，在在取取材材时将将标本染上伊本染上伊红液，以免包埋液，以免包埋过程中程中丢失。失。l6 6注注意意特特殊殊情情况况 取取材材应避避免免过多多的的坏坏死死组织或或凝凝血血块，组织块上上如如有有血血液液、粘粘液液、粪便等便等污物，物，应先用水冲洗干先用水冲洗干净再取材。再取材。l7 7取取材材数数量量 不不同同的的标本本取取材材的的组织块多多少少不不同同，原原则上上是是凡凡是是可可疑疑处均均应取取材材。一一般来般来讲，除了病，除了病变的主体部分外，的主体部分外，应注意切取病注意切取病变组织和正常和正常组织交界交界处。l8 8清清除除多多余余部部分分 取取材材时应注注意意清清除除组织周周围的的多多余余脂脂肪肪组织，否否则会会对以以后后的的切切片片和和观察察带来一定的影响。来一定的影响。l9 9核核对取材完取材完毕，应核核对无无误，并，并签署有关信息和署有关信息和记录日期。日期。l1010组织存放存放取材完取材完毕，标本本应按序存放，并加足固定液以按序存放，并加足固定液以备复复查。四、冰四、冰四、冰四、冰冻冻切片取材切片取材切片取材切片取材（一）取材（一）取材l 在在详细检查的的基基础上上选取取最最有有代代表表性性的的组织，必必要要时应取取2 2块或或更更多多组织块。取取材材后后应立立即即用用液液氮氮速速冻，然然后后在在-70-70或或-40-40低低温冰箱保存。温冰箱保存。l（二）注意事项（二）注意事项l1 1液氮速液氮速冻时，标本盒不能直接浸入液氮，以免本盒不能直接浸入液氮，以免组织膨膨胀破碎。破碎。l 2 2新新鲜组织不不能能放放入入-10-10冰冰箱箱内内缓慢慢冷冷却却，否否则组织内内水水分分可可逐逐渐析出形成冰晶，造成析出形成冰晶，造成组织结构破坏。构破坏。l33冷冷冻后的后的组织块应密封保存，防止脱水。密封保存，防止脱水。l 4 4在在组织块复复温温时，应在在3737加加温温速速融融，自自然然复复温温将将造造成成组织结构破坏。构破坏。第二节第二节第二节第二节 固定方法固定方法固定方法固定方法 l 将将组织浸浸入入某某些些化化学学试剂，使使细胞胞内内的的物物质尽尽量量接接近近其其生生活活状状态时的的形形态结构构和和位位置置，这一一过程程称称为固固定定。凡凡需需病病理理检验的各种的各种组织都需都需经过固定。固定。l一、固定的意一、固定的意义l二、固定方法的二、固定方法的选择l三、固定液三、固定液一、固定的意一、固定的意一、固定的意一、固定的意义义11保持保持细胞与生活胞与生活时的形的形态相似，防止自溶与腐相似，防止自溶与腐败。2 2保保持持细胞胞内内的的特特殊殊成成分分与与生生活活状状态时相相仿仿。经过固固定定，细胞胞内内的的一一些些蛋蛋白白质等等可可沉沉淀淀或或凝凝固固，使使其其定定位位在在细胞胞内内的的原原有有部部位位，有利于其后物有利于其后物质的确切定位。的确切定位。3 3便便于于区区别不不同同组织成成分分。组织细胞胞内内的的不不同同物物质经固固定定后后产生生不同的折光率，不同的折光率，对染料染料产生不同的生不同的亲和力，和力，经染色后容易区染色后容易区别。4 4有有利利于于切切片片。固固定定剂有有硬硬化化作作用用，可可使使细胞胞正正常常的的半半液液体体状状胶胶体体变为半固体状凝胶，使半固体状凝胶，使细胞胞组织硬度增加，便于制片。硬度增加，便于制片。固定固定固定固定剂对组织细剂对组织细胞的不利影响胞的不利影响胞的不利影响胞的不利影响1 1影影响响常常规染染色色。如如用用福福尔马林林固固定定时，常常有有福福尔马林林色色素素的的异异常常沉沉积。2 2固固定定造造成成物物质损失失。不不同同的的固固定定剂和和固固定定方方法法会会引引起起不不同同程程度度的的细胞胞内内蛋蛋白白质、粘粘多多糖糖、脂脂类、核核酸酸和和低低分分子子量量物物质的的损失失，因因此此应根根据据研研究究目目的的的的不不同同选择适适当当的的固固定定剂和和固固定定方方法法，以以使使所所研究的物研究的物质损失达到最小。失达到最小。3 3组织皱缩。甲。甲醛、福、福尔马林固定的林固定的组织均有不同程度的均有不同程度的皱缩。二、固定方法的二、固定方法的二、固定方法的二、固定方法的选择选择l（一）细胞内物质成分与固定剂的关系（一）细胞内物质成分与固定剂的关系l（二）常用的固定方法（二）常用的固定方法l（三）固定时注意事项（三）固定时注意事项（一）细胞内物质成分与固定剂的关系（一）细胞内物质成分与固定剂的关系（一）细胞内物质成分与固定剂的关系（一）细胞内物质成分与固定剂的关系l 组成成细胞的主要成分是蛋白胞的主要成分是蛋白质、脂、脂类和糖和糖类，根据研究目，根据研究目的不同的不同选用不同的固定用不同的固定剂和固定方法，如要保存和固定方法，如要保存细胞内糖原用胞内糖原用CarnoyCarnoy液固定，液固定，T T淋巴淋巴细胞表面抗原胞表面抗原为不不稳定抗原，极易被固定抗原，极易被固定液破坏，因此常用冰定液破坏，因此常用冰冻切片切片进行染色。行染色。（二）常用的固定方法（二）常用的固定方法（二）常用的固定方法（二）常用的固定方法 1 1蒸蒸汽汽固固定定法法 要要固固定定组织中中的的可可溶溶性性物物质，一一般般选用用蒸蒸汽汽固固定定法法；较小小而而薄薄的的标本本，也也可可用用锇酸酸或或甲甲醛蒸蒸汽汽固固定定。主主要要用用于于某某些薄膜些薄膜组织以及血液或以及血液或细胞涂片的固定。胞涂片的固定。2 2注注射射、灌灌注注固固定定法法 某某些些组织块体体积过大大或或固固定定剂难以以进入入内内部，或需要部，或需要对整个整个脏器或器或动物物进行固定。行固定。3 3细细胞胞涂涂片片的的固固定定方方法法 可可采采用用浸浸入入法法和和滴滴加加法法。用用浸浸入入法法时，可可将将新新鲜而而湿湿润的的涂涂片片直直接接浸浸入入固固定定液液内内，如如可可能能，应每每个个病病例例单独固定以免交叉独固定以免交叉污染。染。4 4微微波波固固定定法法 微微波波固固定定的的组织具具有有核核膜膜清清晰晰、染染色色质均均匀匀、组织结构构收收缩小小的的优点点，目目前前已已经用用于于病病理理诊断断。但但应严格格控控制制固固定的温度，否定的温度，否则会影响会影响组织固定的固定的质量。量。（三）固定时注意事项（三）固定时注意事项（三）固定时注意事项（三）固定时注意事项1 1固固定定液液的的量量 固固定定组织时，固固定定液液的的量量要要充充足足，一一般般为组织块总体体积的的4-54-5倍倍。而而且且应在在组织切取后立即或尽快放入适当的固定液中。切取后立即或尽快放入适当的固定液中。2 2固固定定液液的的穿穿透透性性 一一般般固固定定液液在在2424h h内内不不能能穿穿透透厚厚度度大大于于2-32-3mmmm的的实体体组织或或0.50.5cmcm的的多孔疏松多孔疏松组织。3 3组织块的大小的大小厚度可根据厚度可根据组织类型而不同，原型而不同，原则上不上不应超超过4mm4mm，以以3mm3mm更更为适宜。适宜。4 4固固定定时间 大大多多数数组织应固固定定2424h h。固固定定的的时间与与使使用用固固定定液液的的种种类、组织块大大小小、温温度度等有关，不同的固定液有不同的固定等有关，不同的固定液有不同的固定时间，一般固定，一般固定时间为3-24h3-24h。5 5固定温度固定温度大多数可在室温（大多数可在室温（2525）固定，在低温固定）固定，在低温固定时，固定，固定时间应相相应延延长。6 6加加热加加热可使蛋白可使蛋白质凝固，但一般不要求加凝固，但一般不要求加热，因，因为加加热可加速可加速组织的自溶。的自溶。7 7特特殊殊固固定定 用用于于确确诊病病变，保保证在在诊断断时特特殊殊结构构保保存存完完好好。如如尿尿酸酸盐结晶晶就就需需要要特特殊殊固固定。定。三、固定液三、固定液三、固定液三、固定液 用用于于固固定定组织的的化化学学物物质称称为固固定定液液或或固固定定剂，一一般般由由单一一化化学学物物质组成成者者称称为固固定定剂或或单纯固固定定液液；由由多多种种化化学学物物质混混合合组成者称成者称为混合固定液或复合固定液。混合固定液或复合固定液。ll（一）单纯固定液（一）单纯固定液l（二）混合固定液（二）混合固定液（一）单纯固定液（一）单纯固定液（一）单纯固定液（一）单纯固定液l1 1甲甲醛（formaldehydeformaldehyde）l2 2重重铬酸酸钾 l3 3苦味酸苦味酸 l4 4锇酸（四氧化酸（四氧化锇）l5 5丙丙酮 l6 6酒精酒精 1 1 1 1甲甲甲甲醛醛（formaldehydeformaldehydeformaldehydeformaldehyde）市市售售的的为40%40%的的甲甲醛水水溶溶液液，也也称称为福福尔马林林（formalinformalin）。此此液液久久存存自自行行分分解解，形形成成白白色色沉沉淀淀为副副醛（三三聚聚甲甲醛或或多多聚聚甲甲醛），可可过滤后后使使用用，但但这种种溶溶液液中中有有甲甲酸酸产生生，使使溶溶液液呈呈酸酸性性，影影响响细胞胞核核的的染染色色，因因此此，储存存时间长的的甲甲醛应放放入入少少量量碳碳酸酸镁或或碳碳酸酸钠，或或用用大大理理石石中中和和。在在40%40%甲甲醛中中加加入入甲甲醇醇可可阻阻止止聚聚合合作作用用。一一般般作作为固固定定剂使使用的用的10%10%的甲的甲醛，是用水和，是用水和40%40%甲甲醛（9:19:1）混合而成，）混合而成，实际上是上是4%4%甲甲醛。甲甲醛水水溶溶液液渗渗透透能能力力强，固固定定均均匀匀，组织收收缩小小，但但经乙乙醇醇脱脱水水后后收收缩较大大。甲甲醛为非非沉沉淀淀性性固固定定剂，不不能能使使白白蛋蛋白白和和核核蛋蛋白白沉沉淀淀。甲甲醛通通过使使蛋蛋白白质分分子子发生生交交联而而产生生固固定定作作用用。因因其其价价格格较低低，可可用用于固定和保存大于固定和保存大标本。本。长时间固定的固定的标本，甲本，甲醛氧化氧化产生的生的蚁酸在酸在组织中与血中与血红蛋白形蛋白形成棕色的福成棕色的福尔马林色素，在制片前林色素，在制片前应注意充分流水冲洗，否注意充分流水冲洗，否则可能影可能影响染色效果。响染色效果。2 2 2 2重重重重铬铬酸酸酸酸钾钾 l常用其常用其1%-3%1%-3%水溶液作水溶液作为固定固定剂。未酸化的重。未酸化的重铬酸酸钾不能使不能使蛋白蛋白质沉淀，但可以使蛋白沉淀，但可以使蛋白质变为不溶性，保持其生活不溶性，保持其生活时的状的状态，对于于细胞胞质的固定的固定较好，并且可固定好，并且可固定类脂脂类物物质使其不溶于脂溶使其不溶于脂溶剂。用于固定高。用于固定高尔基体和基体和线粒体有良好效果，但有溶解染色粒体有良好效果，但有溶解染色质的的缺点，染色缺点，染色质保存相保存相对较差。差。3 3 3 3苦味酸苦味酸苦味酸苦味酸 是是一一种种强酸酸，易易燃燃易易爆爆。一一般般应配配成成饱和和溶溶液液储藏藏，常常用用其其饱和和溶溶液液作作固固定定剂。苦苦味味酸酸能能沉沉淀淀一一切切蛋蛋白白质，穿穿透透慢慢，组织收收缩明明显，但但组织没没有有明明显硬硬化化，可可使使皮皮肤肤软化化，因因此此皮皮肤肤组织用用苦味酸或其混合固定液固定苦味酸或其混合固定液固定时，易制作完整的切片。，易制作完整的切片。用含苦味酸的固定液固定用含苦味酸的固定液固定组织时，时间不宜超不宜超过24h24h，固定，固定后的后的组织应尽快放入尽快放入70%70%的酒精，并在酒精中滴加少量的酒精，并在酒精中滴加少量饱和碳酸和碳酸锂水溶液或水溶液或浓氨水，有助于除去苦味酸固定氨水，有助于除去苦味酸固定产生的黄色。生的黄色。4 4 4 4锇锇酸（四氧化酸（四氧化酸（四氧化酸（四氧化锇锇）为强氧化氧化剂，不能与酒精、甲，不能与酒精、甲醛等混合。常用其等混合。常用其1%-2%1%-2%的水的水溶液作溶液作为固定液。是固定液。是电镜研究必需的固定研究必需的固定剂，常用于后固定。，常用于后固定。锇酸的渗透力极弱，易使酸的渗透力极弱，易使组织变硬，固定的硬，固定的组织块应小，否小，否则内部内部固定效果不好。但延固定效果不好。但延长固定固定时间，组织的脆性增加，的脆性增加，对染色不利。染色不利。5 5 5 5丙丙丙丙酮酮可与水、醇、可与水、醇、氯仿和仿和醚等混合，可使蛋白等混合，可使蛋白质沉淀，渗透力沉淀，渗透力强，对核的固定差。广泛用于核的固定差。广泛用于酶组织化学方法中各种化学方法中各种酶的固定（如磷的固定（如磷酸酸酶、脂、脂酶和氧化和氧化酶等）。作用基本与酒精相同。等）。作用基本与酒精相同。6 6 6 6酒精酒精酒精酒精即乙醇。有固定兼脱水作用，固定速度即乙醇。有固定兼脱水作用，固定速度较慢，易使慢，易使组织变脆。脆。用于固定的用于固定的浓度度为80%-95%80%-95%。用于糖原的固定，如肝。用于糖原的固定，如肝组织等糖原染等糖原染色。酒精的渗透力弱，能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白。但核蛋色。酒精的渗透力弱，能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白。但核蛋白白经沉淀后，能溶于水，不利于染色体的固定。高沉淀后，能溶于水，不利于染色体的固定。高浓度乙醇固定度乙醇固定的的组织硬化硬化显著，著，时间过长组织变脆，收脆，收缩明明显。酒精一般不作。酒精一般不作常常规固定固定剂，用酒精固定，用酒精固定时，常先用，常先用80%80%酒精固定数小酒精固定数小时，再，再换95%95%酒精酒精继续固定。固定。（二）混合固定液（二）混合固定液（二）混合固定液（二）混合固定液1 1B-5B-5固定液固定液 2 2BouinBouin液液 3 3CarnoyCarnoy液液 4 4HellyHelly液液 5 5甲甲醛-生理生理盐水水 6 6中性中性缓冲甲冲甲醛液液7 7中性甲中性甲醛液液1 1 1 1B-5B-5B-5B-5固定液固定液固定液固定液即醋酸即醋酸钠-升汞升汞-甲甲醛固定液。多用于固定淋巴固定液。多用于固定淋巴组织。用。用该液液固定的固定的组织，在染色前，在染色前应进行脱汞行脱汞处理。理。2 2 2 2BouinBouinBouinBouin液液液液常用于活常用于活检标本固定的固定液。用于固定大多数本固定的固定液。用于固定大多数组织和器官，和器官，适用于适用于结缔组织染色。固定效果好，染色。固定效果好，组织细胞胞结构完整。构完整。细胞核胞核着色着色鲜明，但明，但细胞胞质着色着色较差。差。对脂肪的固定效果好，尤其适用脂肪的固定效果好，尤其适用于含脂肪的淋巴于含脂肪的淋巴结、乳腺、乳腺组织和脂肪瘤和脂肪瘤标本的固定。固定液偏酸，本的固定。固定液偏酸，对抗原有一定的抗原有一定的损害，使害，使组织收收缩，不适宜于，不适宜于标本的本的长期保存。期保存。固定后固定后组织被染成黄色，需用被染成黄色，需用70%-80%70%-80%酒精洗酒精洗涤。在酒精中加入。在酒精中加入饱和碳酸和碳酸锂水溶液有助于清除水溶液有助于清除组织块的黄色。的黄色。3 3 3 3CarnoyCarnoyCarnoyCarnoy液液液液固定固定细胞胞浆和和细胞核，胞核，对染色体的固定佳，染色体的固定佳，显示示DNADNA和和RNARNA效效果果较好。也常用于糖原和尼氏体的固定。不适宜于保存脂好。也常用于糖原和尼氏体的固定。不适宜于保存脂类，不，不适宜于脂肪染色。固定液有防止酒精的硬化和收适宜于脂肪染色。固定液有防止酒精的硬化和收缩作用，增加渗作用，增加渗透力，可用作外膜致密不易渗透的透力，可用作外膜致密不易渗透的组织的固定。的固定。该液固定速度快，液固定速度快，3mm3mm厚的厚的组织块1h1h即可固定，大即可固定，大块材料最好不超材料最好不超过4h4h。4 4 4 4HellyHellyHellyHelly液液液液又成又成为ZenkerZenker福福尔马林液。林液。对细胞胞质固定效果好，固定效果好，显示某些示某些细胞胞质内特殊内特殊颗粒有独特粒有独特优越性，越性，对骨髓等造血器官的固定效果骨髓等造血器官的固定效果好，好，对心肌的心肌的闰盘保存也有良好效果。保存也有良好效果。5 5 5 5甲甲甲甲醛醛-生理生理生理生理盐盐水水水水应用最广泛的一种固定液，可保用最广泛的一种固定液，可保护脂脂类和和细胞核。胞核。6 6 6 6中性中性中性中性缓缓冲甲冲甲冲甲冲甲醛醛液液液液 为免免疫疫组织化化学学最最常常用用的的固固定定液液，对组织的的穿穿透透性性好好，组织收收缩小小。对大大多多数数抗抗原原物物质保保存存较好好，对细胞胞膜膜的的通通透透性性有有影影响响，可能使某些大分子抗原失去活性。固定可能使某些大分子抗原失去活性。固定时间以以24h24h以内以内为宜。宜。固定液配方：固定液配方：40%40%甲甲醛10ml10ml，0.01mol/LPBS0.01mol/LPBS（pH7.4pH7.4）90ml90ml。7 7 7 7中性甲中性甲中性甲中性甲醛醛液液液液是最常用的固定液之一，固定效果好。是最常用的固定液之一，固定效果好。第二章第二章组织切片技切片技术在取材后，在取材后，经固定的固定的标本如本如组织块较厚厚则应进行修整。有条行修整。有条件的件的应根据根据组织块大小分大小分别进行脱水、透明、浸蜡和包埋，包埋行脱水、透明、浸蜡和包埋，包埋好的好的组织块即可按需要即可按需要进行切片。行切片。ll第一第一节组织的脱水、透明、浸蜡的脱水、透明、浸蜡l第二第二节组织的包埋和包埋方法的包埋和包埋方法 l第三第三节组织切片法切片法第一节第一节第一节第一节 组织的脱水、透明、浸蜡组织的脱水、透明、浸蜡组织的脱水、透明、浸蜡组织的脱水、透明、浸蜡l l一、脱水一、脱水一、脱水一、脱水 l l二、透明二、透明二、透明二、透明 l l三、浸蜡三、浸蜡三、浸蜡三、浸蜡 l l四、骨和含四、骨和含四、骨和含四、骨和含钙组织钙组织脱脱脱脱钙钙法法法法一、脱水一、脱水一、脱水一、脱水脱水是借某些溶媒置脱水是借某些溶媒置换组织内水分的内水分的过程。程。组织经固定和水固定和水洗后含大量水分，水与石蜡不能混合，因此在浸蜡和包埋前必洗后含大量水分，水与石蜡不能混合，因此在浸蜡和包埋前必须进行脱水。脱水行脱水。脱水剂必必须能与水以任意比例混合，至于能与水以任意比例混合，至于选用何种脱用何种脱水水剂，应根据固定根据固定剂的要求，不要任意的要求，不要任意选用，否用，否则无法得到无法得到满意意结果。果。现将一些常将一些常见脱水脱水剂及其性能和注意事及其性能和注意事项简介如下：介如下：(一一)酒精酒精(二二)丙酮丙酮 （三）异丙醇（三）异丙醇 （四）正丁醇和叔丁醇（四）正丁醇和叔丁醇(一一一一)酒精酒精酒精酒精 是是最最常常用用的的脱脱水水剂之之一一。它它可可与与水水随随意意混混合合，脱脱水水能能力力较强，并并且且可可硬硬化化组织。酒酒精精的的穿穿透透速速度度很很快快，对组织有有较明明显的的收收缩作作用用。为避避免免组织过度度收收缩，在在用用酒酒精精作作为脱脱水水剂时，应从从低低浓度度开开始始，然然后后再再依依次次增增加加其其浓度度。一一般般从从7070酒酒精精开开始始，经80%80%、9090、9595酒酒精精，尔后后至至无无水水酒酒精精。对于于少少数数柔柔嫩嫩组织应从从5050或或3030酒酒精精开开始始脱脱水水。但但也也应注注意意，对于于一一些些需需特特殊殊处理理的的标本本，如如进行行糖糖原原和和尿尿酸酸盐结晶晶染染色色的的标本本，为较好好的的保保存存物物质的的结构构（它它们在在水水中中会会溶溶解解消消失失），应直直接接用用无无水水酒酒精精固固定定。经无无水水酒酒精精固固定定的的组织，更更换一一次次无无水水酒酒精精脱脱水水即即可可。一一般般情情况况下下，组织经上上述述处理理，即即可可达达到到脱脱水水要要求求。但但大大量量组织块同同时进行行脱脱水水时，为达达到到满意意的的脱脱水水效效果果，常常经过9595酒酒精精和和无无水水酒酒精精各各两两次次。但但注注意意组织块在在纯酒酒精精中中放放置置时间不不宜宜过长，防防止止组织过度度硬硬化化造造成成切切片片困困难。无无水水酒酒精精经应用用后后，很很难保保证无无水水，因因此此应在在无无水水酒酒精精容容器器内内加加人人硫硫酸酸铜吸吸收收水水分分。硫硫酸酸铜遇遇水水变蓝后后，即即应更更换无无水水硫硫酸酸铜或或更更换纯酒酒精精。但但放放人人容容器器的的硫硫酸酸铜最最好好不不要要与与组织块接接触触，可可在在硫硫酸酸铜表表面面加加一一块滤纸。对于于标本本量量较大大的的单位位，应经常常更更换酒酒精精，对于于标本本量量少少，又又不不经常常进行切片的基行切片的基层单位，可用以上方法。位，可用以上方法。脱脱水水的的时间与与组织块大大小小有有关关，对于于1.51.5cm1.5cm1.5cm0.2cm0.2-0.30.3cmcm的的组织块，一一般般脱脱水水时间如下：如下：7070酒酒精精数数分分钟，8080、9595、9595、100100、l00l00酒酒精精各各22-44h h，将将酒酒精精在在温温箱箱加加温温可可缩短脱水短脱水时间。对于小于小块组织，8080-100-100酒精酒精30-45min30-45min即可。即可。但但对于于结构构紧密的密的组织（如致密（如致密结缔组织等）和大等）和大块组织则不适用，不适用，应根据具体情况根据具体情况进行行调整。另外，脂肪整。另外，脂肪组织和疏松和疏松结缔组织应延延长脱水脱水时间，在，在9595酒精中水分必酒精中水分必须洗洗净，脂，脂肪必肪必须溶解掉。否溶解掉。否则石蜡不能渗入脂肪石蜡不能渗入脂肪细胞和胞和纤维组织，无法切出好的切片，而且染色，无法切出好的切片，而且染色时也容易脱片。也容易脱片。这样的的组织蜡蜡块，因含有水分，因含有水分，经与空气接触后即干燥出与空气接触后即干燥出现凹陷。凹陷。(二二二二)丙酮丙酮丙酮丙酮丙丙酮的的脱脱水水作作用用与与酒酒精精相相似似，但但对组织块的的收收缩作作用用比比酒酒精精更更严重重，因因此此一一般般很很少少单纯应用用丙丙酮作作脱脱水水剂。在在快快速速脱脱水水或或固固定定兼兼脱脱水水时有有时应用用，脱脱水水时间约l-3l-3h h。丙丙酮可可作作为染染色色后后的的脱脱水水剂，用于，用于DNADNA和和RNARNA染色。染色。（三）异丙醇（三）异丙醇（三）异丙醇（三）异丙醇 是是酒酒精精的的良良好好代代用用品品，不不含含水水，可可代代替替无无水水酒酒精精使使用用。脱脱水水后后组织收收缩小小，对组织的的硬硬化化作作用用也也较弱弱。对火火棉棉胶胶和和染染料料不不溶溶，因此不能用于火棉胶包埋和染料配制。在常因此不能用于火棉胶包埋和染料配制。在常规制片中很少制片中很少应用。用。（四）正丁醇和叔丁醇（四）正丁醇和叔丁醇（四）正丁醇和叔丁醇（四）正丁醇和叔丁醇正正丁丁醇醇是是无无色色液液体体，脱脱水水能能力力较弱弱，可可和和水水、酒酒精精和和石石蜡蜡混混合合，因因此此这种种脱脱水水的的组织块可可直直接接浸浸蜡蜡和和包包埋埋。叔叔丁丁醇醇无无毒毒，可可与与水水、酒酒精精、二二甲甲苯苯混混合合。可可单独独使使用用，也也可可与与酒酒精精混混合合使使用用，是是目目前前常常用用的的一一种种脱脱水水剂。与与正正丁丁醇醇相相比比，它它不不易易使使组织收收缩或或变硬硬，而而且且脱脱水水后后可可不不经透透明明直直接接浸浸蜡蜡，浸浸蜡蜡前前先先经过叔叔丁丁醇醇和和石蜡石蜡1:11:1混合液。混合液。电镜标本制作本制作时常用作中常用作中间脱水脱水剂。二、透明二、透明二、透明二、透明 为使使石石蜡蜡能能浸浸人人组织块，组织脱脱水水后后，必必须经过一一种种既既能能与与酒酒精精相相混混合合，又又能能溶溶解解石石蜡蜡的的溶溶剂，通通过这种种溶溶剂的的媒媒介介作作用用，而而达达到到石石蜡蜡浸浸入入组织块的的目目的的。在在这一一过程程中中，因因组织块中中的的水水分分被被溶溶剂（如如二二甲甲苯苯）取取代代，其其折折射射指指数数接接近近于于组织蛋蛋白白的的折折光光指指数数，组织块变得得透透亮亮，因因此此称称之之为透透明明。组织染染色色后后，也也要要进行行透明。用作透明透明。用作透明剂的有二甲苯、苯、甲苯、的有二甲苯、苯、甲苯、氯仿、仿、环己己酮等。等。（一）二甲苯（一）二甲苯 （二）苯和甲苯（二）苯和甲苯 （三）氯仿（三）氯仿（一）二甲苯（一）二甲苯（一）二甲苯（一）二甲苯是是常常用用的的透透明明剂，其其折折射射指指数数（refractiverefractiveindexindex，RIRI）为1.501.50。它它对组织的的收收缩性性强，易易使使组织变硬硬变脆脆。因因此此，组织块（3-4mm3-4mm）在在二二甲甲苯苯中中一一般般3030minmin即即可可使使组织透透明明，时间不不宜宜过长。组织块可可先先经过1:11:1无无水水酒酒精精、二二甲甲苯苯混混合合液液处理理，再再浸浸人人二二甲甲苯苯。切切片片染染色色后后进行行透透明明，不不会会使使苯苯胺胺染染料料退退色色。如如进入入二二甲甲苯苯时出出现浑浊，说明脱水不充分。明脱水不充分。（二）苯和甲苯（二）苯和甲苯（二）苯和甲苯（二）苯和甲苯苯苯（RI=1.50RI=1.50）和和甲甲苯苯（RIRI1.501.50）与与二二甲甲苯苯的的性性质相相似似，对组织收收缩较小小，与与二二甲甲苯苯相相比比，不不易易使使组织变脆脆。但但透透明明速速度度慢慢且且挥发快快，吸吸人人苯苯易易引引起起中中毒毒，操操作作应在在通通风橱橱或或空空气气较流流通通处进行行。苯苯对组织的的收收缩小小，不不引引起起组织硬硬化化变脆脆，适适于于处理理致致密密结缔组织、肌肌肉肉及及腺腺体体等等组织的的透透明明。脱脱水水至至无无水水酒酒精精时即即可可进入入纯苯透明，可苯透明，可长时间停留。甲苯多用于切片染色后的透明。停留。甲苯多用于切片染色后的透明。（三）氯仿（三）氯仿（三）氯仿（三）氯仿氯仿仿也也不不易易使使组织变脆脆变硬硬，但但透透明明能能力力比比二二甲甲苯苯差差，其其RIRI1.451.45，且且极极易易挥发和和易易吸吸收收水水分分，用用作作透透明明剂时，多多用用于于大大块组织（1cm1cm）的透明，而且）的透明，而且应在容器内放置无水硫酸在容器内放置无水硫酸铜。总体比体比较来看，以二甲苯最来看，以二甲苯最为常用，而且一般工常用，而且一般工业用二甲苯用二甲苯即可达到透明效果。用二甲苯透明即可达到透明效果。用二甲苯透明时，一般，一般经过2-32-3次次纯二甲苯溶二甲苯溶液，每次液，每次10-15min10-15min。同。同时也也应根据根据组织的种的种类和和组织块大小以及液大小以及液体的新体的新鲜程度加以程度加以调整，不整，不应机械照搬。如机械照搬。如脑组织和凝血和凝血块，应缩短在二甲苯内的留置短在二甲苯内的留置时间。而肌肉。而肌肉组织和胃和胃肠组织则应延延长。三、浸蜡三、浸蜡三、浸蜡三、浸蜡 组织经透透明明后后，在在熔熔化化的的石石蜡蜡内内浸浸渍的的过程程称称浸浸蜡蜡。为使使石石蜡蜡充充分分渗渗入入组织块中中，常常需需经过2-32-3次次石石蜡蜡浸浸渍才才能能完完成成。在在第第一一次次石石蜡蜡中中加加入入少少量量二二甲甲苯苯或或用用低低熔熔点点的的软蜡蜡，尔后后再再浸浸入入高高熔熔点点的的硬蜡效果更好。硬蜡效果更好。一一般般用用于于浸浸蜡蜡的的石石蜡蜡熔熔点点为52-5652-56。但但具具体体应用用时还应考考虑当当时的的情情况况，一一般般在在夏夏天天气气温温较高高的的情情况况下下，应采采用用高高熔熔点点的的硬硬蜡蜡，而而在在气气温温较低低的的季季节，应用用低低熔熔点点的的石石蜡蜡，这样有有利利于于切切片片制制作作。组织块总的的浸浸蜡蜡时间约3-43-4h h。当当然然也也应根根据据组织块的的种种类和和大大小小以以及及温温度度情情况况加加以以灵灵活活掌掌握握。时间不不宜宜过长，否否则易易造造成成组织块脆硬，脆硬，时间不足，也不足，也难制作良好的切片。制作良好的切片。对于一般的于一般的动物物组织，脱水、透明和浸蜡，脱水、透明和浸蜡时间如下：如下：7575酒精酒精长短不定短不定8585酒精酒精120-300min120-300min9595酒精酒精I I和和II120-300minllII120-300minll无水酒精无水酒精I I、IIII和和III30minIII30min无水酒精无水酒精III60-120minIII60-120min二甲苯二甲苯I I和和II30minII30min二甲苯二甲苯III60minIII60min56-5856-58石蜡石蜡30min30min56-5856-58石蜡石蜡60-120min60-120min56-5856-58石蜡石蜡120-180min120-180min四、骨和含四、骨和含四、骨和含四、骨和含钙组织钙组织脱脱脱脱钙钙法法法法 骨骨、牙牙齿和和有有钙化化的的组织在在充充分分固固定定后后，应进行行脱脱钙处理理。脱脱钙组织的的厚厚度度不不宜宜超超过44mmmm。牙牙齿和和骨骨可可先先锯开开，而而后后用用砂砂轮磨磨成成薄薄片片脱脱钙，有有钙化化的的组织再再经脱脱钙液液浸浸泡泡短短时即即可可。组织脱脱钙有多种方法，常用的有以下几种：有多种方法，常用的有以下几种：（一）酸性溶液脱钙法（一）酸性溶液脱钙法 （二）螯合剂脱钙法（二）螯合剂脱钙法 （三）脱钙后处理（三）脱钙后处理（一）酸性溶液脱钙法（一）酸性溶液脱钙法（一）酸性溶液脱钙法（一）酸性溶液脱钙法1硝酸脱钙法硝酸脱钙法 常常用用脱脱钙液液，1010硝硝酸酸水水溶溶液液（加加少少量量尿尿素素），硝硝酸酸1010mlml和和1010甲甲醛90ml90ml的混合液。的混合液。组织块经甲甲醛固固定定后后，先先用用5 5硝硝酸酸溶溶液液脱脱钙。每每日日更更换脱脱钙液液，早早晚晚各各一一次次，直直至至用用针刺刺入入组织无无阻阻力力感感为止止，一一般般2-32-3天天，组织若若柔柔软性性较好好，用用镊子子可可弯弯曲曲120120而而回回弹，说明明脱脱钙完完全全。如如不不够，可可延延长时间，但但时间过长，将将影影响响染染色色。流流水水冲冲洗洗24h24h即即可可。有有时对脱脱钙液液进行行钙盐试验以以确确定定脱脱钙是是否否完完全全。可可取取用用过的的脱脱钙液液55m1m1，加加浓氨氨水水llmlml，充充分分混混合合后后，加加草草酸酸铵饱和和水水溶溶液液0.10.1m1m1，若若有有沉沉淀淀生生成成，说明明脱脱钙还不不充充分，若液体透明，分，若液体透明，说明已完全脱明已完全脱钙。l 2盐酸脱钙法盐酸脱钙法常常用用的的脱脱钙液液，盐酸酸8.58.5mlml，甲甲酸酸55m1m1，氯化化铝77g g，蒸蒸馏水水100ml100ml。盐酸和甲酸各酸和甲酸各20m120m1，蒸，蒸馏水水100ml100ml。方法同上。方法同上。（二）螯合剂脱钙法（二）螯合剂脱钙法（二）螯合剂脱钙法（二）螯合剂脱钙法1 1此此法法对组织无无损伤，但但脱脱钙速速度度慢慢。组织内内酶的的活活性性保保留留，可可用用于于组织化化学学染染色色的的小小块骨骨组织。对组织抗抗原原性性的的损伤也也较小小，因因此此用用于于免免疫疫组织化化学学染染色也色也较为理想，骨理想，骨组织超薄切片在超薄切片在预固定后常用固定后常用EDTAEDTA进行脱行脱钙处理。理。2 2用用EDTAEDTA（乙乙二二胺胺四四乙乙酸酸）溶溶液液：EDTAEDTA1010g g，溶溶解解于于磷磷酸酸盐缓冲冲液液（PBSPBS）或或TrisTris缓冲液（）冲液（）100ml100ml中。中。3 3薄片薄片组织放人放人EDTAEDTA溶液脱溶液脱钙，4 4天更天更换1 1次新液，需数周才能脱次新液，需数周才能脱钙完完毕。4 4脱脱钙后的后的组织，经流水冲洗以除去流水冲洗以除去组织中的中的EDTAEDTA，而后按常，而后按常规处理。理。（三）脱钙后处理（三）脱钙后处理（三）脱钙后处理（三）脱钙后处理1 1脱脱钙后的后的组织用流水冲洗用流水冲洗15-30min15-30min，也可先用碳酸，也可先用碳酸钠中和。中和。2 2修修去去锯面面的的薄薄层组织，切切成成适适当当大大小小的的组织块，常常规处理理，注注意意脱水脱水应充分，否充分，否则组织易脆，切片困易脆，切片困难。第二节第二节第二节第二节 组织的包埋和包埋方法组织的包埋和包埋方法组织的包埋和包埋方法组织的包埋和包埋方法组织块经过浸浸透透剂（石石蜡蜡、火火棉棉胶胶、树脂脂等等）浸浸透透，用用包包埋埋剂（石石蜡蜡、火火棉棉胶胶、树脂脂等等）包包起起的的过程程称称包包埋埋。不不同同的的包包埋埋方方法法有有不不同同的的要要求求，包包埋埋后后均均可可制制成成含含组织的的块。经包包埋埋后后，可可使使组织达达到到一一定定的的硬硬度度和和韧度度，有有利利于于切切成成薄薄片片。不不同同的的包包埋埋剂，其包埋方法不同，分其包埋方法不同，分别简述如下。述如下。一、常一、常一、常一、常规规石蜡