《引物设计实例分析》PPT课件.ppt

引物设计实例分析引物设计实例分析引物设计基本原则引物长度（primer length）产物长度（product length）序列Tm值(melting temperature)G+C含量（composition）引物二聚体及发夹结构 （duplex formation and hairpin）阅读框1.引物的长度 一般为18-30bp，常用的是20bp左右，但不能大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于72，即Taq酶的最适温度2.扩增片段的长度 扩增片段长度在普通PCR以200500为宜；实时荧光PCR则为50150bp。3.引物溶解温度（Tm值）引物的Tm值一般控制在55-60度,尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度.如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度.Tm=2(A+T)+4(C+G)4.引物的GC含量 有效引物中(G+C)的比例为40-60%，过高（非特异性扩增0或过低（扩增效率不高）都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。5.引物自身 引物间3端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败;引物 3端碱基，最好为G或C，形成GC夹子，提高引发效率，并提高扩增的特异性任务任务用绿色荧光蛋白用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白标记蛋白NR1SPpcDNA3.1NR1Plasmid 1:Plasmid 2GFPSPBamHIpcDNA3.1NR1Plasmid 1:Plasmid 2GFPSPBamHI(GGATCC)pcDNA3.1NR1-1aGFP 121 ggggctccta gagaacccgg gggcgcttga ccgcgcgcgg gcggcccgcg ggtcgtacat 181 cgcgaggtcg tcgcactcgc gcaacccaga gccaggcccg ctgtgcccgg agctcatgag 241 caccatgcac ctgctgacat tcgccctgct tttttcctgc tccttcgcc c gcgcggatcc 301 cgaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgtt 361 ccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgc 421 cacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct 481 catctctagc caggtctacg ctatcctagt tagccacccg cctactccca acgaccactt 541 cactcccacc cctgtctcct acacagctgg cttctacaga atccctgtcc tgggactgac 601 tacccgaatg tccatctact ctgacaagag tatccacctg agtttccttc gcacggtgcc 661 gccctactcc caccagtcca gcgtctggtt tgagatgatg cgagtctaca actggaacca 721 catcatcctg ctggtcagcg acgaccacga gggacgggca gcgcagaagc gcttggagac 781 gttgctggag gaacgggagt ccaaggcaga gaaggtgctg cagtttgacc caggaaccaa NR1的编码序列的编码序列(4000bp)红色红色为信号肽,蓝色蓝色为BamHI酶切位点,下划线下划线标出酶切位点的阅读框 ATGGTGAGCAAG GGCGAGGAGC TGTTCACCGG GGTGGTGCCC ATCCTGGTCG AGCTGGACGG CGACGTAAAC GGCCACAAGT TCAGCGTGTC CGGCGAGGGC GAGGGCGATG CCACCTACGG CAAGCTGACC CTGAAGTTCA TCTGCACCAC CGGCAAGCTG CCCGTGCCCT GGCCCACCCT CGTGACCACC TTCGGCTACG GCCTGCAGTG CTTCGCCCGC TACCCCGACC ACATGAAGCA GCACGACTTC TTCAAGTCCG CCATGCCCGA AGGCTACGTC CAGGAGCGCA CCATCTTCTT CAAGGACGAC GGCAACTACA AGACCCGCGC CGAGGTGAAG TTCGAGGGCG ACACCCTGGT GAACCGCATC GAGCTGAAGG GCATCGACTT CAAGGAGGAC GGCAACATCC TGGGGCACAA GCTGGAGTAC AACTACAACA GCCACAACGT CTATATCATG GCCGACAAGC AGAAGAACGG CATCAAGGTG AACTTCAAGA TCCGCCACAA CATCGAGGAC GGCAGCGTGC AGCTCGCCGA CCACTACCAG CAGAACACCC CCATCGGCGA CGGCCCCGTG CTGCTGCCTAC CAGTCCGCCC TGAGCAAAGA CCCCAACGAG AAGCGCGATC ACATGGTCCT GCTGGAGTTC GTGACCGCCG CCGGGATCAC TCTCGGCATG GACGAGCTGT ACAAGTAAGFP序列(700bp)引物要求PCR扩增GFPGFP两边添加BamHI酶切位点保证NR1的阅读框不改变5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3 3 TACCACTCGTTCCCGCTCCTCGAGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5GFP序列5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3 3 TACCACTCGTTCCCGCTCCTCGCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5Primer1:5ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5 Primer2Primer1:5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.Primer2:5 TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.Primer1:5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.Primer2:5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.第一步：扩增第一步：扩增GFP基本序列基本序列变性变性,引物复性引物复性第二步：GC比值；Tm值Primer1:5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA.Primer2:5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.Primer1:5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA（GC:60%,Tm：64）Primer2:5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCC（GC:57%,Tm：66）第三步：酶切位点Primer1:5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA（GC:60%,Tm：64）Primer2:5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCC（GC:57%,Tm：66）BamHI:ggatccPrimer1:5 ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGA Primer2:5 ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC 第四步：阅读框atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc cgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct.Primer1:5 ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGANR1序列：序列：Primer1:5 ggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAatgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc cgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacctNR1序列：序列：5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3 GFP序列cgc gcg gat ccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG?ggat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct插入插入GFP后的组合序列后的组合序列Primer2:5 ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCCPrimer2:5 gg atc cct CTTGTACAGCTCGTCCATGCC第五步 保护序列不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目有要求第五步 保护序列Primer1:5 GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAPrimer2:5 GCGCggatccctCTTGTACAGCTCGTCCATGCC以以基基因因G h A G P 3 1为为 例例 说说 明明，以以 下下 是是G h A G P 3 1的的 O R F序序列列：ATGGGGTTTGCTGTAATAGTACTAGTAGTTAAAGCTGCTTTGCTTGTGCAGCTTTCACTGTTGTTACTGAGCACCTTCACTGTCTCTGCTCCCATTTGGCCTCAGGCTTCTCCTCCTCATTACCATGCTGTTTCACCTGTAGTCCCGCCTACTCACCCACCAACCCACCACCATCACCACCACCCTCACCCTCACCCTCACCCCCATCCTCATCCACCCACTAAGCCCCCAACCCCCACTCCTCCTCCAGTTCATCCACCACCCAAGGCGCCAGTGCAACCACCAACCAAGCCACCAGTTCACCCACCACCCAAGCCACCAGTTCAACCTCCAACTAAGCCACCAACCAAACCTCCAACTCAACCCCCGACTAAGCCACCAACTCAGCCCCCGACTAAGCCACCAACCAAGCCTCCAACTCAGCCCCCGACGAAGCCACCAACACACCCACCATCTCATCCTCCGGCCAAGCCACCTAAATCGAGCCAGGTGGCAGTGCAGGGCGTTGTTTATTGCAAGTCATGCAAGTACGCCGGAGTCGACACCCTTTTGGGAGCTAAACCAATTCTTAGTGCCACCGTAAGGCTGACATGCAAAGACGCTAAAAACGAATTAACGGTCCAGTTCAAGACTGACAAGAATGGTTATTTCTTCCTGCAAGCACCAATTACCATCTACAATTTTGATCTCCACAATTGCAGCGTCTCCCTCGTATCTTCACCATTGAAAGCATGCAGCAAGCCATCTAATCTAAACGGTGGATTGAAGGGCGCCCCCTTGAAGCCTGAGAAACCATCTACTTCAAAGAAGCTCCCATATGTTCTCTACAGCGT T G G G C C C T T C G C T T T C G A A C C C A C A T G T C A C A A G A A C T A GGhAGP31Up1:5CTTGGATCCATGGGGTTTGCTGTAATAGTACCTTTCTAGAGTTCTTGTGACATGTGGGTTCG3 XbaI 两两条条引引物物都都有有CTT作作为为保保护护碱碱基基，同同时时平平衡衡引引物物中中的的G+C含含量量。CTT后后面面6个个碱碱基基为为酶酶切切位位点点，分分别别为为BamHI（GGATCC）、XbaI（TCTAGA）酶酶切切位位点点，接接下下来来Up1为为ORF内内一一段段以以ATG开开头头的的上上游游序序列列，共共22个个碱碱基基，Dn1为为终终止止密密码码TAG结结尾尾的的22个个碱碱基基。Tm=66.8，（G+C）%=45.2%。实实际际上上，设设 计计 引引 物物 时时 应应 根根 据据 实实 际际 情情 况况 而而 定定，尽尽 量量 满满 足足 引引 物物 设设 计计 原原 则则，但但 与与 理理 想想 情情 况况 会会 有有 偏偏 差差。