课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 (9)(精品).ppt

课题背景课题背景尿素尿素CO(NHCO(NH2 2)2 2 重要的农业重要的农业氮肥氮肥。只有被土壤中细菌分解为只有被土壤中细菌分解为NHNH3 3才能被植物吸收利用才能被植物吸收利用脲酶脲酶CO(NH2)2+H2O CO2+2NH3课题课题2 2 土壤分解尿素的细菌的分土壤分解尿素的细菌的分离与计数离与计数 1.从土壤中分离出从土壤中分离出能够分解尿素的细菌能够分解尿素的细菌能够分解尿素的细菌能够分解尿素的细菌 2.统计统计每克土壤每克土壤每克土壤每克土壤样品中究竟含有样品中究竟含有多少这样的细菌多少这样的细菌多少这样的细菌多少这样的细菌课题目的课题目的一、研究思路一、研究思路(一一)筛选菌种筛选菌种 1 1 1 1 实例：实例：实例：实例：寻找耐高温的寻找耐高温的DNA聚合酶聚合酶启示：启示：启示：启示：PCRPCRPCRPCR技术：要求使用耐高温技术：要求使用耐高温技术：要求使用耐高温技术：要求使用耐高温（939393930 0 0 0C C C C）的）的）的）的DNADNADNADNA聚合酶。聚合酶。聚合酶。聚合酶。寻找目的菌种时要根据它对寻找目的菌种时要根据它对寻找目的菌种时要根据它对寻找目的菌种时要根据它对_，到，到，到，到相应的环境中去寻找。相应的环境中去寻找。相应的环境中去寻找。相应的环境中去寻找。生存环境的要求生存环境的要求生存环境的要求生存环境的要求耐高温耐高温的酶的酶耐高温耐高温生物体生物体耐高温耐高温环境（热泉、火山口）环境（热泉、火山口）寻找寻找寻找寻找Taq细菌细菌筛选原因筛选原因筛选原因筛选原因:因为热泉的因为热泉的高温高温条件条件淘汰了绝大多数微生物淘汰了绝大多数微生物，使使耐热的耐热的TaqTaq细菌保留细菌保留下来。下来。2 2 2 2 实验室中微生物的实验室中微生物的实验室中微生物的实验室中微生物的筛选原理筛选原理筛选原理筛选原理 人为提供人为提供有利于目的菌株生长有利于目的菌株生长的条件的条件(包括营养、包括营养、温度、温度、pHpH等等)，同时，同时抑制或阻止其他微生物抑制或阻止其他微生物生长。生长。思考：思考：该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？氮源的分别是什么物质？碳源碳源：葡萄糖、尿素：葡萄糖、尿素氮源氮源：尿素：尿素 此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？原则上能。只有产生脲酶的细菌能利用尿素作为氮源而原则上能。只有产生脲酶的细菌能利用尿素作为氮源而生存。生存。3 3 3 3 选择培养基：选择培养基：选择培养基：选择培养基：在微生物学中，将允许在微生物学中，将允许在微生物学中，将允许在微生物学中，将允许_，同，同，同，同时时时时_生长的培养基。生长的培养基。生长的培养基。生长的培养基。特定种类的微生物生长特定种类的微生物生长特定种类的微生物生长特定种类的微生物生长抑制或阻止其他种类微生物抑制或阻止其他种类微生物抑制或阻止其他种类微生物抑制或阻止其他种类微生物结果：结果：结果：结果：培养一定时间后，培养一定时间后，培养一定时间后，培养一定时间后，该菌数量上升该菌数量上升，再通过稀释涂，再通过稀释涂，再通过稀释涂，再通过稀释涂布平板等方法对它进行纯化培养分离。布平板等方法对它进行纯化培养分离。布平板等方法对它进行纯化培养分离。布平板等方法对它进行纯化培养分离。如何对细菌进行计数？1 1 显微镜直接计数：显微镜直接计数：利用利用血球计数板血球计数板(血细血细胞计数板胞计数板），在显微，在显微镜下计算一定容积里镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。样品中微生物的数量。2 2 稀释涂布平板法（间接计数）稀释涂布平板法（间接计数）101102103104105106(二二二二)统计菌落数目统计菌落数目统计菌落数目统计菌落数目方法方法 运用运用稀释涂布平板法稀释涂布平板法来来统计统计样品中的样品中的活菌活菌数。数。原理原理 1 1个菌落个菌落1 1个活菌个活菌选择菌落数在选择菌落数在3030300300的平板上计数。的平板上计数。需培养计算出需培养计算出三个或三个以上三个或三个以上的平板菌的平板菌落求落求平均数平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目统计的菌落往往比活菌的实际数目低低。注意事项注意事项看课本看课本P22，并讨论你认为这两位同学的作法正确吗？如，并讨论你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？果有问题，错在哪？第一位同学：没有第一位同学：没有重复实验重复实验（至少涂布（至少涂布3 3个平板）个平板）第二位同学：第二位同学：A A组结果误差过大，不应用于计算平均值组结果误差过大，不应用于计算平均值计算公式：计算公式：某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）()A.2.34108B.2.34109C.234D.23.4 B每克样品中的菌株数每克样品中的菌株数=（CV）M(三三三三)设置对照实验设置对照实验设置对照实验设置对照实验阅读阅读P22P222323页页“（三）设置对照（三）设置对照”一段讨论教材中提出一段讨论教材中提出的问题。的问题。设置对照的目的：设置对照的目的：设置对照的目的：设置对照的目的：排排排排除除除除实实实实验验验验组组组组中中中中非非非非测测测测试试试试因因因因素素素素对对对对试试试试验验验验结结结结果果果果的的的的影影影影响响响响，提提提提高实验结果的可信度。高实验结果的可信度。高实验结果的可信度。高实验结果的可信度。(1)A(1)A同学出现此结果的可能原因？同学出现此结果的可能原因？土样不同土样不同土样不同土样不同培养基污染培养基污染培养基污染培养基污染 (或混入了其他的含氮物质或混入了其他的含氮物质或混入了其他的含氮物质或混入了其他的含氮物质)(2)(2)设置对照实验，帮助设置对照实验，帮助A A同学排除上述两个可能影响实验同学排除上述两个可能影响实验结果的因素？结果的因素？这个实例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少这个实例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少这个实例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少这个实例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少方案一：方案一：方案一：方案一：由其他同学由其他同学由其他同学由其他同学用与用与用与用与A A同学相同土样同学相同土样同学相同土样同学相同土样进行实验进行实验进行实验进行实验 方案二：方案二：方案二：方案二：将将将将A A同学配制的培养基在同学配制的培养基在同学配制的培养基在同学配制的培养基在不加土样不加土样不加土样不加土样的情况下进的情况下进的情况下进的情况下进行培养，作为行培养，作为行培养，作为行培养，作为空白对照空白对照空白对照空白对照，以证明培养基是否受到污染。，以证明培养基是否受到污染。，以证明培养基是否受到污染。，以证明培养基是否受到污染。结果预测：结果预测：结果预测：结果预测：如果结果与如果结果与如果结果与如果结果与A A同学一致，则证明同学一致，则证明同学一致，则证明同学一致，则证明_；如果结果不同，则证明如果结果不同，则证明如果结果不同，则证明如果结果不同，则证明A A同学存在同学存在同学存在同学存在_A A无误无误无误无误培养基的配培养基的配培养基的配培养基的配制有问题。制有问题。制有问题。制有问题。实验流程：实验流程：样品稀释涂布平板样品稀释涂布平板微生物的培养与观察微生物的培养与观察 菌落计数菌落计数二、实验设计土壤取样土壤取样制备培养基制备培养基（一）土壤取样（一）土壤取样从从肥肥沃沃、酸酸碱碱度度接接近近中中性性的的湿湿润润土土壤壤中中取取样样。先先铲铲去去表表层层土土3cm3cm左左右右，再再取取样样，将将样样品品装装入入事事先先准准备备好好的的信信封中。封中。“微生物的天然培养基微生物的天然培养基”数量最大、种类最多数量最大、种类最多大约大约70%70%90%90%是细菌是细菌（二）制备培养基（二）制备培养基制备制备选择培养基（尿素为唯一氮源）选择培养基（尿素为唯一氮源）制备制备牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基 相同的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落相同的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显数目应明显多于多于选择培养基上的数目，因此，选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了到了选择选择作用。作用。（对照作用）（对照作用）（对照作用）（对照作用）思考？为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？思考？为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？思考？为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？思考？为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？（三）样品稀释涂布平板（三）样品稀释涂布平板稀释倍数为稀释倍数为 10101 1 10106 6。每个稀释度均用。每个稀释度均用3 3个选择培养基个选择培养基和和1 1个蛋白胨培养基个蛋白胨培养基。（四）微生物的培养与观察（四）微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。时间不足而导致遗漏菌落的数目。培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：细菌：30303737培养培养1 12d2d 放线菌：放线菌：25252828培养培养5 57d7d 霉菌：霉菌：25252828的温度下培养的温度下培养3 34d4d。不同种类的细菌形成的菌落，在大小、形状、光不同种类的细菌形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一度的特泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一度的特征，征，菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据。菌落菌落菌落菌落 一一一一 无菌操作无菌操作无菌操作无菌操作1 1、取土用的、取土用的小铁铲小铁铲的盛土样的的盛土样的信封信封在使用前都需要在使用前都需要灭菌灭菌。2 2、应应在在火火焰焰旁旁称称取取土土壤壤。在在火火焰焰附附近近将将称称好好的的土土样样倒倒入入锥锥形形瓶瓶中，塞好棉塞。中，塞好棉塞。3 3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁火焰旁操作。操作。二二二二 做好标记做好标记做好标记做好标记注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。三三三三 制定计划制定计划制定计划制定计划三、操作提示三、操作提示四、结果分析与评价四、结果分析与评价 1.1.培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落？否筛选出菌落？对照的培养皿对照的培养皿无菌落说明培养基没有污染无菌落说明培养基没有污染。牛肉膏培养基的牛肉膏培养基的菌落数目多余选择培养基的菌菌落数目多余选择培养基的菌落数目落数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。，说明选择培养基已筛选出一些菌落。四、结果分析与评价四、结果分析与评价 2.2.获得某一稀释度下，菌落数获得某一稀释度下，菌落数3030300300的平板，的平板，在这以稀释度下是否至少有两个平板的菌落数相在这以稀释度下是否至少有两个平板的菌落数相接近？接近？相接近，说明操作成功。相接近，说明操作成功。五、课题延伸五、课题延伸1.1.1.1.在以在以在以在以尿素尿素尿素尿素为唯一氮源的培养基中加入为唯一氮源的培养基中加入为唯一氮源的培养基中加入为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂酚红指示剂酚红指示剂酚红指示剂。培养。培养。培养。培养某种细菌后，如果某种细菌后，如果某种细菌后，如果某种细菌后，如果PHPHPHPH升高，指示剂将升高，指示剂将升高，指示剂将升高，指示剂将变红变红变红变红，说明该细菌能，说明该细菌能，说明该细菌能，说明该细菌能够分解尿素。够分解尿素。够分解尿素。够分解尿素。2.2.2.2.测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到细菌过滤器过滤后，将滤膜放到细菌过滤器过滤后，将滤膜放到细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红伊红伊红伊红-美蓝美蓝美蓝美蓝 培养基上培养基上培养基上培养基上培养，大肠杆菌培养，大肠杆菌培养，大肠杆菌培养，大肠杆菌菌落呈现黑色菌落呈现黑色菌落呈现黑色菌落呈现黑色，通过记算得出水样中大，通过记算得出水样中大，通过记算得出水样中大，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。肠杆菌的数量。肠杆菌的数量。肠杆菌的数量。本课题知识小结本课题知识小结:巩固练习1.1.使用选择培养基的目的是（使用选择培养基的目的是（）A.A.培养细菌培养细菌 B.B.培养真菌培养真菌 C.C.使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖 D.D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别2.2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是别是()()A.COA.CO2 2和和N N2 2 B.B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素C CD D3.3.下列说法不正确的是（下列说法不正确的是（）A.A.科学家从科学家从70708080度热泉中分离到耐高温的度热泉中分离到耐高温的TaqDNATaqDNA聚聚 合酶。合酶。B.B.统计某一稀释度的统计某一稀释度的5 5个平板的菌落数依次为个平板的菌落数依次为M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作为该样品菌落数的估计值。作为该样品菌落数的估计值。C.C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。种类最多。4.4.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）入（）A.A.较多的氮源物质较多的氮源物质 B.B.较多的碳源物质较多的碳源物质 C.C.青霉素类药物青霉素类药物 D.D.高浓度食盐高浓度食盐B BC C