《目基因克隆》PPT课件.ppt

第五章第五章第五章第五章 目的基因的克隆目的基因的克隆周毅峰周毅峰20112011年春年春目的基因的克隆目的基因的克隆D D 利用利用PCRPCR分离目的基因的方法分离目的基因的方法C cDNAC cDNA文库法文库法A A 鸟枪法鸟枪法E E 化学合成化学合成法法B B 基因文库法基因文库法 基因工程或基因工程或DNADNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用一类是利用PCRPCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。后将之克隆表达。A A 鸟枪法鸟枪法鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略 随机克隆供体细胞的全基因组随机克隆供体细胞的全基因组DNADNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的众多克隆中分离出含有目的基因的目的目的重组子重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离用于原核细菌目的基因的克隆分离 鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略染色体染色体DNADNA的切断的切断 超声波处理：超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端片段长度均一，大小可控，平头末端 全酶切：全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控大小不可控 部分酶切：部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整 与载体连接与载体连接 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为为转化受体细胞转化受体细胞 受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞的受体细胞筛选含有目的基因的目的重组子筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNADNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中重组子中目的重组子目的重组子的出现频率的出现频率 使用特征性限制性内切酶切开染色体使用特征性限制性内切酶切开染色体DNADNA 鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进例如，已知某目的基因位于例如，已知某目的基因位于1.8 1.8 kbkb的的SalISalI片段中，将染色体片段中，将染色体DNADNA用用SalISalI切开，琼切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6-2.01.6-2.0 kbkb大小区域内的凝胶块，从此大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收凝胶块中回收DNADNA片段，然后与载体进片段，然后与载体进行拼接行拼接在连接前将在连接前将DNADNA片段进行分级分离片段进行分级分离 2.0 kb1.6 kb1.8 kb鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进冻融法冻融法滤纸法滤纸法吸附法吸附法低融点凝胶法低融点凝胶法溶解法溶解法凝胶凝胶DNADNA片段回收技术片段回收技术 鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得的最小长度的目的基因不能获得的最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构不能除去真核生物目的基因的内含子结构B B 基因文库的构建基因文库的构建基因文库的基本概念基因文库的基本概念基因文库的构建程序基因文库的构建程序基因组文库重组克隆的排序基因组文库重组克隆的排序基因文库的基本概念基因文库的基本概念基因库与基因文库基因库与基因文库基因库（基因库（gene poolgene pool）特定生物体全基因组的集合（天然存在）特定生物体全基因组的集合（天然存在）基因文库（基因文库（gene library or gene bankgene library or gene bank）从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式基因组文库基因组文库（含有全部基因）（含有全部基因）存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为：存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为：cDNAcDNA文库文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）（含有全部蛋白质编码的结构基因）基因组基因组DNA文库文库(genomiclibrary)：指将某生物体的全部基因组指将某生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片片段，与合适的载体体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳段，与合适的载体体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性生物群落性生物群落cDNA文库文库(cDNAlibrary)：指将某生物基因组转录的部分或全指将某生物基因组转录的部分或全部部mRNA经反转录产生的各种经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，片段分别与克隆载体重组，贮存于受体生物群体中，这样的生物群体称为贮存于受体生物群体中，这样的生物群体称为cDNA文库文库根据构建文库所用的载体不同可将基因文库分为根据构建文库所用的载体不同可将基因文库分为质粒文库质粒文库噬菌体文库噬菌体文库黏粒文库黏粒文库人工染色体文库人工染色体文库M13 phage vector、phage vector、P1 phage vector et.Cosmid vectorYAC、BAC、PAC、TAC基因文库的基本概念基因文库的基本概念基因文库构建的基本战略基因文库构建的基本战略用鸟枪法构建基因组文库，用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体材料来自染色体DNADNA用用cDNAcDNA法构建法构建cDNAcDNA文库，文库，材料来自材料来自mRNAmRNA在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNAmRNA种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNAcDNA文库文库一般还有组织细胞的界定，如肝组织一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNAcDNA文库或胚胎组织文库或胚胎组织cDNAcDNA文库等。很显然，文库等。很显然，cDNAcDNA文库的信息量远小于基因组文库文库的信息量远小于基因组文库基因文库的基本概念基因文库的基本概念基因文库的完备性基因文库的完备性基因文库的基因文库的完备性完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数率，它与基因文库最低所含克隆数NN之间的关系可用下式表示：之间的关系可用下式表示：N=ln(1 P)/ln(1 f)N=ln(1 P)/ln(1 f)其中：其中：P=P=任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率 f=f=克隆片段的平均大小克隆片段的平均大小/生物基因组的大小生物基因组的大小 例如，人的单倍体例如，人的单倍体DNADNA总长为总长为2.9 2.9 x 10 x 1099 bp bp，基因文库中克隆片段基因文库中克隆片段的平均大小为的平均大小为15 15 kbkb，则构建一个完备性为则构建一个完备性为0.90.9的的基因文库至少需要基因文库至少需要4545万个克隆；而当完备性提高到万个克隆；而当完备性提高到0.99990.9999时，基因文库至少需要时，基因文库至少需要180180万个克隆万个克隆基因文库的基本概念基因文库的基本概念基因文库的质量标准基因文库的质量标准除了尽可能高的除了尽可能高的完备性外，完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：一个理想的基因文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆避免基因被分隔克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序以利克隆排序克隆片段易于从载体分子上完整卸下克隆片段易于从载体分子上完整卸下重组克隆能稳定保存、扩增、筛选重组克隆能稳定保存、扩增、筛选基因文库的构建程序基因文库的构建程序基因组基因组DNADNA的制备的制备 为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性，为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性，用于基因组用于基因组文库构建的文库构建的DNADNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的DNADNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNADNA片段片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高的比率就越低，重组率和完备性也就越高AAAAAAAA用常规方法制备的染色体用常规方法制备的染色体DNADNA的长度一般在的长度一般在100 100 kbkb左右左右如果先将细胞固定在低融点凝如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有胶中，然后置入含有SDSSDS、蛋蛋白酶白酶K K、RNaseRNase的缓冲液中浸泡，可获得的缓冲液中浸泡，可获得1000 1000 kbkb大小的大小的DNADNA片段片段基因文库的构建程序基因文库的构建程序基因组基因组DNADNA的切割的切割 用于基因组用于基因组文库构建的文库构建的DNADNA片段的切割一般采用片段的切割一般采用超声波处理超声波处理和和限制性内切酶限制性内切酶部分酶切部分酶切两种方法，其目的是：两种方法，其目的是：第一，保证第一，保证DNADNA片段之间存在部分重叠区片段之间存在部分重叠区 第二，保证第二，保证DNADNA片段大小均一片段大小均一超声波处理超声波处理后的后的DNADNA片段呈平头末端，需加装人工接头片段呈平头末端，需加装人工接头 部分酶切法部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如：如：Sau3AISau3AI或或MboIMboI等，这样等，这样DNADNA酶解片段的大小可控酶解片段的大小可控 连接前，上述处理的连接前，上述处理的DNADNA片段必须根据载体的装载量进行分级片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的分离，以杜绝不相干的DNADNA片段随机连为一体！片段随机连为一体！基因文库的构建程序基因文库的构建程序载体和受体的选择载体和受体的选择 出于压缩重组克隆的数量，用于出于压缩重组克隆的数量，用于基因组基因组文库文库构建的构建的载体通常选载体通常选装载量较大的装载量较大的ll-DNA-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用人类）需使用YACYAC或或BACBAC载体载体ll-DNA-DNA 由于绝大多数真核生物的由于绝大多数真核生物的mRNAmRNA小于小于10 10 kbkb，因此用于因此用于cDNAcDNA文库文库构构建的载体建的载体通常选质粒通常选质粒 上述几种上述几种载体的最大装载量如下：载体的最大装载量如下：质粒质粒考斯质粒考斯质粒15 15 kbkb25 25 kbkb45 45 kbkbBACBAC300 300 kbkbYACYAC400 400 kbkb 用于基因用于基因文库构文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌基因文库的构建程序基因文库的构建程序从基因文库中筛选目的基因从基因文库中筛选目的基因 大型基因组大型基因组文库文库一般由数十万甚至上百万个重组克隆组成。除一般由数十万甚至上百万个重组克隆组成。除了一些具有特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因、结合蛋白了一些具有特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因、结合蛋白编码基因等）可以采用特殊的正选择筛选编码基因等）可以采用特殊的正选择筛选程序（如程序（如抗药性筛选法抗药性筛选法、酵母双杂交技术酵母双杂交技术等）直接筛选外，一般的基因组等）直接筛选外，一般的基因组文库筛选均需多轮文库筛选均需多轮操作步骤操作步骤酵母双杂交体系（酵母双杂交体系（YeastTwo-hybridsystem）真核生物的转录因子大多是由两个结真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、功能上独立的结构域组成构上分开、功能上独立的结构域组成的。如的。如GAL4的的N端端1-147aa是是DNA结结合域（合域（BD），其），其C端端768-881aa是转录是转录激活域（激活域（AD）。一般情况下，）。一般情况下，AD能能与与GAL4效应基因启动子上游的特定效应基因启动子上游的特定DNA区段（区段（UAS）相结合，而此时，）相结合，而此时，AD则推动了转录起始。则推动了转录起始。d.从大肠杆菌中分别提取这两种重组质粒从大肠杆菌中分别提取这两种重组质粒DNA，共转化感受态酿，共转化感受态酿酒酵母菌株。酒酵母菌株。e.将共转化的酵母菌株涂布于缺少将共转化的酵母菌株涂布于缺少Leu，Trp和和His的培养基上，筛的培养基上，筛选表达相互作用的杂种蛋白的阳性菌落。选表达相互作用的杂种蛋白的阳性菌落。主要实验过程主要实验过程a.选择缺失选择缺失GAL4编码基因的酵母寄主菌株编码基因的酵母寄主菌株-SFY526或或HF7c；b.构建带有构建带有GAL1UAS-启动子启动子-lacZ（His3）的转化载体）的转化载体;c.把已知的靶蛋白质编码基因克隆到把已知的靶蛋白质编码基因克隆到pGBT9的多克隆位点上，的多克隆位点上，把所有把所有cDNA都克隆到都克隆到pGAD424载体上，构成载体上，构成cDNA表达文库。表达文库。基因文库的构建程序基因文库的构建程序从基因文库中筛选目的基因从基因文库中筛选目的基因密集铺板（密集铺板（1-101-10万）万）杂杂交交挖挖取取铺铺板板铺铺板板目的重组克隆目的重组克隆基因文库的构建程序基因文库的构建程序基因文库构建的技术性问题基因文库构建的技术性问题在基因组在基因组文库的构建过程中，文库的构建过程中，最应引起重视的问题是：最应引起重视的问题是：严禁外源严禁外源DNADNA片段之间的连接！片段之间的连接！为了避免上述情况的发生，为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合：可采取下列措施的组合：将待连接的将待连接的DNADNA片段根据载体的装载量分级分离片段根据载体的装载量分级分离用碱性磷酸单酯酶除去用碱性磷酸单酯酶除去DNADNA片段的末端磷酸基团片段的末端磷酸基团 用用TdTTdT酶在酶在DNADNA片段的末端上增补同聚尾末端片段的末端上增补同聚尾末端 基因组文库重组克隆的排序基因组文库重组克隆的排序 大型基因文库（包括人的基因文库）的构建在技术上并不大型基因文库（包括人的基因文库）的构建在技术上并不十分困难，如果一个十分困难，如果一个YACYAC基因文库的插入片段总和为整个基因基因文库的插入片段总和为整个基因组的十倍以上时，一般就能从基因文库中调出任何一段组的十倍以上时，一般就能从基因文库中调出任何一段DNADNA序序列。然而基因文库的克隆都是随机序列，必须将所有的克隆排列。然而基因文库的克隆都是随机序列，必须将所有的克隆排列成一个像天然染色体列成一个像天然染色体DNADNA上所表现出的信息顺序。这项工作上所表现出的信息顺序。这项工作的工作量可能远大于基因组文库的构建，属于基因文库的后期的工作量可能远大于基因组文库的构建，属于基因文库的后期制作制作基因组文库重组克隆的排序基因组文库重组克隆的排序 将单一的将单一的YACYAC克隆插入克隆插入DNADNA片段片段用限制性内切酶分布均匀用限制性内切酶分布均匀地水解成若干片段，末端标记同位素地水解成若干片段，末端标记同位素 然后再用然后再用Sau3AISau3AI或或MboIMboI将末端标记的将末端标记的DNADNA片段降解成碎片段降解成碎片，聚丙烯酰胺凝胶电泳，每片，聚丙烯酰胺凝胶电泳，每1010个个YACYAC克隆走在同一块板上，克隆走在同一块板上，形成形成1010个克隆的特征性个克隆的特征性DNADNA指纹图谱指纹图谱 电脑分析指纹图谱，如发现任何两个克隆电脑分析指纹图谱，如发现任何两个克隆DNADNA的指纹图谱的指纹图谱有部分相同的，则其两个有部分相同的，则其两个YACYAC片段就有互相重叠的可能性，于片段就有互相重叠的可能性，于是这两个是这两个YACYAC克隆的克隆的DNADNA片段克隆在染色体上是排列一起的片段克隆在染色体上是排列一起的 酶切片段末端标记法酶切片段末端标记法酶切片段末端标记法酶切片段末端标记法HHHHS S SSSSSSSSSSSSS SSSS单一克隆指纹图谱单一克隆指纹图谱十克隆指纹图谱十克隆指纹图谱载体载体DNADNA克隆克隆DNADNA基因组文库重组克隆的排序基因组文库重组克隆的排序 将若干将若干YACYAC克隆固定在薄膜上，并复制二十份薄膜；合成克隆固定在薄膜上，并复制二十份薄膜；合成2020种不同序列的短探针，其序列是随机的种不同序列的短探针，其序列是随机的 用用2020种探针随机定位杂交（一对一）种探针随机定位杂交（一对一）2020份份YACYAC克隆薄膜克隆薄膜 如果某两个克隆同时对同一种探针呈现杂交阳性反应，则如果某两个克隆同时对同一种探针呈现杂交阳性反应，则这两个克隆有可能是相互重叠的。若将杂交阳性结果记为这两个克隆有可能是相互重叠的。若将杂交阳性结果记为“1”“1”，而阴性结果记为，而阴性结果记为“0”“0”，可清晰地列成一张表，最终排出上述，可清晰地列成一张表，最终排出上述YACYAC克隆的排列顺序克隆的排列顺序 随机探针联合杂交法随机探针联合杂交法01010202030304040505060607070808090910101111121213131414151516161717181819192020AA BB CCDD EE FFGG01010202030304040505060607070808090910101111121213131414151516161717181819192020DDAABBCCEEFFGG11111111111111111111111111111111111111111111111111111111111101010404121206061313141402021414070719191111151505050808161603031010090920201818DDAABBCCEEFFGG111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111FFCCAADDGGEEBB基因组文库重组克隆的排序基因组文库重组克隆的排序 从基因文库中任取一个克隆作为染色体走读的起点，将之从基因文库中任取一个克隆作为染色体走读的起点，将之两端序列分别亚克隆两端序列分别亚克隆，亚克隆片段在亚克隆片段在0.5-2.0 0.5-2.0 kbkb范围内范围内 分别以上述亚克隆分别以上述亚克隆DNADNA片段为探针，杂交同一基因文库，片段为探针，杂交同一基因文库，杂交阳性克隆中的插入杂交阳性克隆中的插入DNADNA片段必定与起点克隆所含的片段必定与起点克隆所含的DNADNA片片段连锁在一起段连锁在一起 然后再以阳性克隆片段的两端序列为探针，进行第二步走然后再以阳性克隆片段的两端序列为探针，进行第二步走读，直至线型染色体读，直至线型染色体DNADNA的端点的端点 染色体走读法（染色体走读法（chromosome walkingchromosome walking）染色体走读法（染色体走读法（chromosome walkingchromosome walking）走读的起点克隆片段走读的起点克隆片段亚克隆旁测序列亚克隆旁测序列探针标记探针标记第一轮杂交第一轮杂交阳性克隆阳性克隆阳性克隆阳性克隆第二轮杂交第二轮杂交第二轮杂交第二轮杂交染色体走读法（染色体走读法（chromosome walkingchromosome walking）走读的起点克隆片段走读的起点克隆片段cDNA文库的文库的DNA片段是互补片段是互补DNA(complementaryDNA,cDNA)cDNA是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的双链经体外反转录后形成的双链cDNAcDNA文库代表生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水文库代表生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水平上的基因的群体，并不能包括该生物的全部基因，且这些基因在平上的基因的群体，并不能包括该生物的全部基因，且这些基因在表达丰度上存在很大差异。表达丰度上存在很大差异。C cDNAC cDNA法法细胞总细胞总RNA的提的提取和取和mRNA分离分离第一链第一链cDNA合成合成第二链第二链cDNA合成合成双链双链cDNA克隆进克隆进质粒或噬菌体载体质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖并导入宿主中繁殖cDNA文库的构建共分四步文库的构建共分四步Step细胞总细胞总RNA的提取和的提取和mRNA分离分离cDNA文库构建是以文库构建是以mRNA为起始材料的，为起始材料的，mRNA在总在总RNA中所占比例很小，因此从总中所占比例很小，因此从总RNA中富集中富集mRNA是构建是构建cDNA文库和其它应用所必需进行的步骤。通过降低文库和其它应用所必需进行的步骤。通过降低rRNA和和tRNA含量，可大大提高筛选到目标基因的可能性。含量，可大大提高筛选到目标基因的可能性。目前纯化目前纯化mRNA的方法都是在固体支持物表面共价结合固定的方法都是在固体支持物表面共价结合固定一段由脱氧胸腺嘧啶核苷组成的寡聚核苷酸一段由脱氧胸腺嘧啶核苷组成的寡聚核苷酸oligo（dT）链，链，由它与由它与mRNA的的Poly（A）尾巴杂交，从而吸附固定住）尾巴杂交，从而吸附固定住mRNA，进而将，进而将mRNA从其它组分中分离出来的。从其它组分中分离出来的。指导合成高分子量蛋白质的能力，指导合成目的多肽指导合成高分子量蛋白质的能力，指导合成目的多肽的能力，的能力，mRNA的大小，总的大小，总mRNA制剂指导合成制剂指导合成cDNA第一链长分子的能力第一链长分子的能力mRNA的完整性的完整性高丰度高丰度mRNA：珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白，在特：珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白，在特定细胞中占定细胞中占50-90%。低丰度低丰度mRNA：含量：含量 0.5%被称为低丰度或稀有被称为低丰度或稀有mRNAmRNA的丰度的丰度cDNAcDNA法克隆目的基因的基本战略法克隆目的基因的基本战略mDNAmDNA55pppppp55G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 3355pppppp55G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 5555pppppp55G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55cDNAcDNA第一链第一链引物引物退火退火逆转录酶逆转录酶dNTPsdNTPs合成合成DNA时需要引物引导，目前常用的引物主要有两种，即时需要引物引导，目前常用的引物主要有两种，即Oligo（dT）和随机引物。）和随机引物。Oligo（dT）引物一般包含）引物一般包含1020个脱氧胸腺嘧啶核苷和一段带有稀有酶切位点的引物共同组成，个脱氧胸腺嘧啶核苷和一段带有稀有酶切位点的引物共同组成，随机引物一般是包含随机引物一般是包含610个碱基的寡核苷酸短片段。个碱基的寡核苷酸短片段。StepFirstcDNAstrandsynthesize煮沸煮沸NaOHNaOH自身引导法：自身引导法：获得的双链获得的双链cDNA cDNA 55端会有几对碱基缺失端会有几对碱基缺失AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA55pppppp55G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTOHOH 33KlenowKlenowdNTPsdNTPsS1S1StepSecondstrandsynthesizeofcDNAc cDNADNA第二链的合成第二链的合成 DNApol dNTPsDNApol dNTPsRNaesHRNaesH置换合成法：置换合成法：获得的双链获得的双链cDNA cDNA 55端也会有几对碱基缺失端也会有几对碱基缺失55pppppp55G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAApp 5555S1S1 AAAA AAAATTTTTTOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 5555TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTOHOH 33AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 5555TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3333T4-DNA ligaseT4-DNA ligasec cDNADNA第二链的合成第二链的合成 dCTPdCTPTdTTdT引导合成法：引导合成法：获得的双链获得的双链cDNA cDNA 能保留完整的能保留完整的55端序列端序列55pppppp55G G AAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTpp 5533 HOHO55pppppp55G G AAAAAAAAAACCCCCCCCCCCCCCOHOH 3333 HOHOCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTpp 5533 HOHOCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTpp 5533 HOHOCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTpp 5555 ppGGGGGGGGGGGGGG33 HOHOCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTpp 5555 ppGGGGGGGGGGGGGGAAAAAAAAAAOHOH 33NaOHNaOH退火退火KlenowKlenowdNTPsdNTPsStepdscDNAcloningandtransformation双链平头的双链平头的cDNA通常可用下列三种方法克隆入载体中：通常可用下列三种方法克隆入载体中：平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收平头两端分别接同聚物尾，最好是平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段核酸酶处理回收插入片段加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收将重组子转到受体中，扩增、检测阳性克隆将重组子转到受体中，扩增、检测阳性克隆cDNAcDNA法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序特异分离程序特异分离程序 提提取取细细胞胞总总mRNAmRNA，琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳分分离离，回回收收目目标标mRNAmRNA，由此合成双链由此合成双链cDNAcDNA，然后进行克隆然后进行克隆 特特异异分分离离程程序序较较适适用用于于mRNAmRNA丰丰度度极极高高的的目目的的基基因因克克隆隆如血红蛋白基因等如血红蛋白基因等 cDNAcDNA法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序差异分离程序差异分离程序 利用两组细胞利用两组细胞mRNAmRNA种类的差异，分离克隆差异种类的差异，分离克隆差异mRNAmRNA所对所对应的应的cDNAcDNA，因而这种程序较适用于分离克隆新基因因而这种程序较适用于分离克隆新基因 例如：正常的大鼠例如：正常的大鼠FR3T3FR3T3成纤维细胞中，有些新基因是不能成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能隆这些新基因，进而研究其生物学功能 差异分离程序差异分离程序 多瘤病毒感染的多瘤病毒感染的FR3T3FR3T3细胞细胞正常的正常的FR3T3FR3T3细胞细胞总总mRNAmRNA总总mRNAmRNAcDNAcDNA双链双链cDNAcDNA单链单链cDNAcDNA提取提取mRNAmRNA合成合成cDNAcDNA合成第二链合成第二链克隆克隆提取提取mRNAmRNA共价交联共价交联上柱上柱原位杂交原位杂交病毒诱导表达的基因病毒诱导表达的基因cDNAcDNA克隆克隆筛选目的基因片段的差别杂交及减法杂交技术筛选目的基因片段的差别杂交及减法杂交技术差别杂交（差别杂交（differentialhybridization）差别杂交差别杂交：又称为差别筛选：又称为差别筛选（differentialscreening），特），特别适用于分离特定组织中或发别适用于分离特定组织中或发育阶段表达的基因以及受生长育阶段表达的基因以及受生长因子调节的基因，也可用于分因子调节的基因，也可用于分离经特殊处理诱导表达基因离经特殊处理诱导表达基因差别杂交的局限性差别杂交的局限性灵敏度低，特别是对低丰度的灵敏度低，特别是对低丰度的mRNA。工作大，耗时耗钱。需要筛选大量的杂交滤膜，工作大，耗时耗钱。需要筛选大量的杂交滤膜，鉴定大量的噬菌斑或克隆片段。鉴定大量的噬菌斑或克隆片段。重复性差重复性差减法杂交（减法杂交（subtractivehybridization）减法杂交：减法杂交：又叫差减杂交、扣除杂交、减数杂交或消减杂交，是又叫差减杂交、扣除杂交、减数杂交或消减杂交，是通过通过DNA复性动力学原理富集目的基因序列，并以此构建减数复性动力学原理富集目的基因序列，并以此构建减数文库（文库（subtractivelibrary）的方式来进行目的基因分离克隆的。）的方式来进行目的基因分离克隆的。减法杂交的对象减法杂交的对象GenomicDNAcDNAGenomicDNAsubtractivehybridizationmRNAsubtractivehybridization克隆两样品存在特异性的基因克隆两样品存在特异性的基因克隆两样品差异表达的基因克隆两样品差异表达的基因减法杂交的本质减法杂交的本质是除去那些普遍共同存在的或非诱发产生是除去那些普遍共同存在的或非诱发产生cDNA序列，序列，从而使欲分离的目的基因的序列得到有效的富集从而使欲分离的目的基因的序列得到有效的富集DifferentialcDNAbetweenTandBcell,content2%inTcell,totalpositivecloning:35,whichpurposegene(T-cellreceptor)iscontained减法杂交也可用于分离缺失突变基因减法杂交也可用于分离缺失突变基因减法杂交的缺点减法杂交的缺点假阳性：回收假阳性：回收cDNA量少、容易丢一些量少、容易丢一些mRNA以及以及mRNA降解造降解造成成cDNA过短而导致的过短而导致的重复性易解低重复性易解低改进的方法改进的方法使用磁珠的减数技术（使用磁珠的减数技术（magnetassistedsubtractivetechnique，MAST）Oligo(dT)30乳胶和乳胶和PCR结合的方法结合的方法酶降解减数法酶降解减数法(enzymaticdegradingsubtractive,EDS)cDNAcDNA法克隆目的基因的局限性法克隆目的基因的局限性并非所有的并非所有的mRNAmRNA分子都具有分子都具有polyApolyA结构结构 细菌或原核生物的细菌或原核生物的mRNAmRNA半衰期很短半衰期很短mRNAmRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难分离纯化困难仅限于克隆蛋白质编码基因仅限于克隆蛋白质编码基因 D PCRD PCR法法 PCRPCR（Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction）法，又称为法，又称为聚合酶聚合酶链反应链反应或或PCRPCR扩增技术扩增技术，是一种高效快速的体外，是一种高效快速的体外DNADNA聚合程序聚合程序 使用使用PCRPCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或基因或DNADNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必 需的双引物需的双引物 利用利用PCRPCR定向扩增目的基因定向扩增目的基因5555目的基因目的基因55变性变性加热加热5555引物引物退火退火5555底物底物聚合聚合55555555加热加热变性变性55555555555555555555555555555555555555555555555555退火退火 引物引物底物底物聚合聚合加热加热变性变性引物引物退火退火底物底物聚合聚合112233 由由Taq DNATaq DNA聚合酶扩增的聚合酶扩增的PCRPCR产物中，其产物中，其33末端总是会带有末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A A，因为因为Taq DNATaq DNA聚合酶对聚合酶对dATPdAT