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第七章 酶法分析1 酶酶是是生生物物体体内内产产生生的的、具具有有催催化化功功能能的的蛋蛋白质，是一种生物催化剂。白质，是一种生物催化剂。什么是酶(enzyme)？2来来源源不不同同 酶酶来来自自生生物物体体。酶酶是是活活细细胞胞产产生生的的蛋蛋白白质质，能能够够在在较较温温和和的的条条件件下下进进行行催催化化反反应应，如如常常温温、常常压压和和中中性性的的pHpH环环境境。目目前前，人人们们尚尚无无法法用用有有机机化化学学方方法法合成酶分子。合成酶分子。催化效率非常高催化效率非常高 比化学催化剂高比化学催化剂高10107 710101313倍。倍。与化学催化剂相比，酶具有以下特点：3酶酶具具有有高高度度的的特特异异性性 对对其其催催化化的的对对象象(底底物物，substrate)substrate)有有高高度度的的选选择择性性。通通常常将将被被酶酶作作用用的的物物质质称称为为该该酶酶的的底底物物。一一种种酶酶只只作作用用于于一一种种或或一一类类底底物物，酶催化反应几乎没有副产物，这就是酶的特异性。酶催化反应几乎没有副产物，这就是酶的特异性。酶酶易易失失活活 酶酶与与化化学学催催化化剂剂相相比比更更脆脆弱弱。凡凡能能使使蛋蛋白白质质变变性性的的因因素素，如如高高温温、强强酸酸、强强碱碱、重重金金属属盐盐或或紫紫外外线线照照射射均均能能使使其其失失去去催催化化活活性性。另另外外，对对结结合合蛋蛋白白质质一一类类的的酶酶，若若将将其其辅辅助助因因子子(小小分分子子物物质质或或重重金金属属离子离子)除去，酶也失去活性。除去，酶也失去活性。4酶分析方法酶分析方法 利用酶促反应的高度专一性与分析化学的研究思利用酶促反应的高度专一性与分析化学的研究思路相结合，所建立的路相结合，所建立的酶分析方法酶分析方法，已经得到了广泛，已经得到了广泛的应用。的应用。55.1 酶及酶催化的反应 酶酶法法分分析析基基于于酶酶催催化化的的反反应应。酶酶活活性性及及催催化化的的反反应应受受各各种种因因素素的的影影响响，只只有有对对它它们们的的一一般般规规律律有有了了较较深深的的理理解解，才才能能很很好好地地控控制制酶酶催催化化的反应，以得到可靠的分析数据。的反应，以得到可靠的分析数据。65.1.1 酶活性的概念 由由于于酶酶是是一一种种蛋蛋白白质质催催化化剂剂，它它的的催催化化活活性性易易受受环环境境因因素素的的影影响响，在在储储存存过过程程中中会会失失活活，所所以以一一般般很很难难得得到到非非常常纯纯的的酶酶。对对一一般般的的化化学学试试剂剂，其其纯纯度度一一般般在在9090100100之之间间，而而对对于于酶酶制制剂剂，其其纯纯度度通通常常在在1 15 5之之间间。酶酶通通常常很很难难用用经经典典的的单单位位，如如质质量量、体体积积或或物物质质的的量量浓浓度度来来表表示示。酶酶的的量量一一般般用用酶活性单位或酶活力酶活性单位或酶活力(Activity)(Activity)来表示。来表示。7酶的活性单位酶的活性单位(Activity Unit)指的是指的是在一定条件下，在一定条件下，单位时间内底物的减少量或产物的增加量。也即酶量单位时间内底物的减少量或产物的增加量。也即酶量的多少以酶的催化能力来度量，实际上是通过测定酶的多少以酶的催化能力来度量，实际上是通过测定酶的催化反应的速度来表达。的催化反应的速度来表达。酶活力的测定是研究酶的酶活力的测定是研究酶的特性，进行酶制剂的生产及研究其应用时的一项必不特性，进行酶制剂的生产及研究其应用时的一项必不可少的指标。可少的指标。8 1961年年第第五五届届国国际际生生化化会会议议采采纳纳了了IUPAC及及国国际际生生化化协协会会酶酶委委员员会会推推荐荐的的酶酶国国际际单单位位IU的的定定义义：在在特特定定条条件件下下 1 min内内将将1 mol的的底底物物转转化化为为产产物物所所需需酶酶的的量量，这这样样一一个个酶酶的的量量就就叫叫 1 IU的的酶酶。在在报报导导酶酶的的活活性性时时应应采采用用固固定定的的温温度度(建建议议用用25 C)、pH和和底底物物浓浓度度。对对于于酶酶的的制制剂剂则则常常用用每每毫毫升升或或每每升升溶溶液液中中酶酶的的活活性性单单位位(IU/ml；IU/L)来表示。来表示。9 酶酶的的比比活活性性(Specific Activity)又又叫叫比比活活力力，定定义义为为每每毫毫克克酶酶蛋蛋白白所所具具有有的的催催化化活活性性，即即IU/mg(蛋蛋白白质质)。比比活活性性越越高高，酶酶纯纯度度越越高高或或酶酶的的活活性性结结构构保保持持得得越越好好。用用比比活活性性进进行行酶酶制制剂剂间间相相对对活活性性的的比比较较或或酶酶制制剂剂纯纯度度的的检检测测比比较较方便。方便。105.1.2 酶催化反应的类型及酶的编号 根根据据酶酶所所催催化化的的反反应应类类型型，可可将将其其分分为为六六大大类类，在在每每种种大大的的类类型型下下，根根据据参参与与反反应应的的底底物物、辅辅酶酶或或基基团团又可进一步分类。又可进一步分类。氧化还原酶氧化还原酶(Oxidoreductases)转移酶转移酶(Transferases)水解酶水解酶(Hydrolases)裂合酶裂合酶(Lyases)异构化酶异构化酶(Isomerases)连接酶连接酶(Ligases)11氧化还原酶(Oxidoreductases)亚类亚类(表示底物中发生反应的供体基团的性质表示底物中发生反应的供体基团的性质)包括：包括：1.作用于供体的作用于供体的 CHOH2.作用于供体的醛基或酮基作用于供体的醛基或酮基3.作用于供体的作用于供体的HCCH4.作用于供体的作用于供体的 CHNH25.作用于供体的作用于供体的 CHNH6.作用于作用于NADH或或NADPH12转移酶(Transferases)亚类表示底物中被转移基团的性质亚类表示底物中被转移基团的性质1.转移一碳基团转移一碳基团2.转移醛基或酮基转移醛基或酮基3.转移酰基转移酰基4.转移糖苷基转移糖苷基5.转移甲基以外的烷基或芳香基转移甲基以外的烷基或芳香基6.转移含氮基团转移含氮基团7.转移磷酸基转移磷酸基8.转移含硫基团转移含硫基团13水解酶(Hydrolases)(亚类表示被水解的键的类型亚类表示被水解的键的类型)1.水解酯键水解酯键2.水解糖苷键水解糖苷键3.水解醚键水解醚键4.水解肽键水解肽键5.水解其他水解其他CN键键6.水解酸酐键水解酸酐键14裂合酶(Lyases)(亚亚类类表表示示分分裂裂下下来来的的基基团团与与残残余余分分子子间间的的键的类型键的类型)1.CC 2.CO 3.CN 4.CS 5.CX 6.PO15异构化酶(Isomerases)(亚类表示异构的类型亚类表示异构的类型)1.消旋及差向异构酶消旋及差向异构酶2.顺反异构酶顺反异构酶3.分子内氧化还原酶分子内氧化还原酶4.分子内转移酶分子内转移酶5.分子内裂合酶分子内裂合酶16连接酶(Ligases)(亚类表示新形成的键的类型亚类表示新形成的键的类型)1.CO 2.CS 3.CN 4.CC 5.磷酸酯键磷酸酯键17酶的编号酶的编号每每种种具具体体的的酶酶的的分分裂裂编编号号都都是是由由四四位位编编码码的的数数字字组组成成，编号之前均冠以编号之前均冠以EC，例如：，例如：EC是是Enzyme Commision(酶学委员会酶学委员会)的缩写的缩写W指出催化反应的类型指出催化反应的类型(16)X指指出出该该酶酶是是属属于于哪哪一一个个亚亚类类，即即指指出出与与反反应应的的一一般般底物及基团底物及基团Y指指出出该该酶酶属属于于哪哪一一个个亚亚-亚亚类类，即即指指出出催催化化反反应应特特殊殊的底物或辅酶的底物或辅酶Z指指出出该该酶酶在在亚亚-亚亚类类中中的的编编号号，即即酶酶的的系系统统编编号号(与与酶酶被发现的早晚及来源有关被发现的早晚及来源有关)。例例如如：醇醇脱脱氢氢酶酶(EC 1.1.1.1)，第第一一个个“1”代代表表氧氧化化还还原原酶酶类类；第第二二个个“1”代代表表以以 CHOH基基为为供供体体的的酶酶类类；第第三三个个“1”代代表表NAD或或NADP为为受受体体；第第四四个个“1”则则与与具具体体的的酶酶相相关关，它它是是同同一一类类酶酶的的顺顺序序编编号号，一一般般与与其其发现的先后一致，先发现的序号排在前。发现的先后一致，先发现的序号排在前。185.1.3 酶催化反应的特性酶作为一种催化剂，它只加速反应的进程，而不改变反应酶作为一种催化剂，它只加速反应的进程，而不改变反应平衡的位置。酶可以使反应至少加速一百万倍。平衡的位置。酶可以使反应至少加速一百万倍。19 (1)活活性性中中心心的的化化学学结结构构，它它可可以以诱诱导导致致使使底底物物的的化化学学键键变变形形或或极极化化，其其结结果果使使底底物物基基态态的的能能量量提提高高，因而具有更高的反应活性。因而具有更高的反应活性。(2)底底物物与与酶酶的的结结合合部部位位对对底底物物的的固固定定化化作作用用，使使底底物物与与其其它它参参与与化化学学反反应应的的基基团团接接近近，使使底底物物分分子子进进入入酶酶的的活活性性中中心心区区域域，因因而而使使很很多多反反应应类类似似于于分分子子内内反反应应，这这称称之之为为接接近近效效应应(Proximity Effect)，其其结结果果是是大大大大提提高高了了活活性性中中心心区区域域的的底底物物有有效效浓浓度度，使使参参与与反反应应的的基基团团的的有有效效浓浓度度非非常常高高，因因而而比比一一般般的分子间反应的速率要高得多。的分子间反应的速率要高得多。酶的高效催化活性一般归因于以下四个方面20 (3)使底物正确而有利的定向，这使得进行每使底物正确而有利的定向，这使得进行每一步反应时底物的键只发生最小程度的移动或旋一步反应时底物的键只发生最小程度的移动或旋转，因而使反应只需要最低的活化能，另外活性转，因而使反应只需要最低的活化能，另外活性部位合适的电荷分布和有利的几何形状也是影响部位合适的电荷分布和有利的几何形状也是影响过渡态能量的两个因素。过渡态能量的两个因素。(4)多功能基因间的协同催化作用。酶的上述特多功能基因间的协同催化作用。酶的上述特性彼此不能分离，共同加速酶催化反应的速率，性彼此不能分离，共同加速酶催化反应的速率，使酶成为最强有力的催化剂。使酶成为最强有力的催化剂。21 (1)活性部位仅占酶整个体积的一小部分，即酶分活性部位仅占酶整个体积的一小部分，即酶分子中大多数残基并不与底物接触。子中大多数残基并不与底物接触。(2)酶的活性部位是一个三维实体，由来自氨基酸酶的活性部位是一个三维实体，由来自氨基酸序列上不同部位的残基所组成。序列上不同部位的残基所组成。酶的活性中心的特点22 (3)酶酶的的三三维维活活性性中中心心是是裂裂缝缝或或裂裂隙隙，常常是是一一个个疏疏水水的的环环境境，底底物物就就存存在在于于这这样样的的一一个个环环境境中中。有有些些氨氨基基酸酸残残基基与与底底物物的的定定向向相相关关，因因而而与与酶酶的的特特异异性性有有关关，而而有有些些氨氨基基酸酸残残基基则则参参与与了了催催化化反反应应，这这些氨基酸也存在于活性三维实体的裂缝中。些氨基酸也存在于活性三维实体的裂缝中。(4)底底物物与与酶酶之之间间是是以以一一种种弱弱的的力力结结合合在在一一起起的的，二二者者复复合合物物的的平平衡衡常常数数可可在在10-2108 mol/L 的的范范围围内内变变化化，对对应应的的相相互互作作用用的的自自由由能能的的变变化化在在-12.5-50 kJ/mol.(5)结结合合的的专专一一性性取取决决于于活活性性中中心心中中原原子子的的确确定定排排布方式布方式235.1.4 酶催化反应的动力学反应速度随底物浓度S变化的曲线24 对于酶反应，其反应动力学的预测是非常复杂的。但对于酶反应，其反应动力学的预测是非常复杂的。但在研究底物浓度对反应速度的影响时，总是得到如上在研究底物浓度对反应速度的影响时，总是得到如上图所示的实验结果。当底物浓度升高时，最初底物的图所示的实验结果。当底物浓度升高时，最初底物的浓度与反应速度成正比，这属于一级反应；当底物的浓度与反应速度成正比，这属于一级反应；当底物的浓度升高到一定的程度时，反应速度不再随底物浓度浓度升高到一定的程度时，反应速度不再随底物浓度的增加而增大，这时变成零级反应。对这一实验事实的增加而增大，这时变成零级反应。对这一实验事实给出最为合理的解释是酶催化反应速度依赖于酶给出最为合理的解释是酶催化反应速度依赖于酶(E)底物底物(s)复合物分解形成产物的速度。复合物分解形成产物的速度。25 由由此此可可以以看看出出，反反应应产产物物的的形形成成只只包包含含一一个个组组分分，即即ESES复复合合物物(中中间间产产物物)，此此中中间间产产物物可可看看作作是是相相对对稳稳定定的的过过渡渡态态物物质质，它它进进一一步步分分解解为为产产物物P P和和游游离离态态酶酶E E。当当底底物物浓浓度度较较低低时时，反反应应速速度度与与底底物物浓浓度度成成止止比比。因因而而反反应应表表现现为为一一级级反反应应。而而高高浓浓度度的的底底物物会会饱饱和和所所有有酶酶的的活活性性位位点点，使使ESES复复合合物物的的浓浓度度为为最最大大，因因而而表表现现出出最最大大的的反反应应速速度度。底底物物浓浓度度再再增增加加时时并并不不能能提提高高ESES复复合合物物的的浓浓度度，因因而而反反应应速速度度将将保保持持不不变变，此此即即零零级级反应。反应。26米氏方程 这这个个方方程程式式概概括括了了前前图图给给出出的的动动力力学学特特征征。当当底底物物浓浓度度低低时时，S比比km小小得得多多，vSvmax/km，这这就就是是说说，反反应应的的速速度度与与底底物物的的浓浓度度成成正正比比；而而当当底底物物浓浓度度很很高高时时，S比比km 大大得得多多，所所以以v=vmax，这这就就是是说说，反反应应速速度度已已达达到到最最大大值值，不不再再随随底底物物浓浓度度的的增增大大变变化化了了。当当然然，当当S适适中中时时，反反度度表现为混合型即介于零级与一级反应之间。表现为混合型即介于零级与一级反应之间。其中，27km和和vmax的重要意义的重要意义 米米氏氏常常数数km是是酶酶的的特特征征常常数数之之一一。它它一一般般只只与与酶酶的的性性质质有有关关，而而与与酶酶的的浓浓度度无无关关。不不同同的的酶酶，km值值不不同同。但但如如果果一一种种酶酶有有几几种种底底物物，则则对对每每种种底底物物，各各有有一一个个km值值。km值值不不仅仅与与具具体体底底物物有有关关，也也与与测测定定时时的的条条件件有有关关，如如温温度度及及离离子子强强度度等等。因因此此，酶酶的的km值值可可以以作作为为鉴鉴定定酶酶的的一一种种手手段段，但但测定必须在指定的条件下进行。测定必须在指定的条件下进行。285.1.5 5.1.5 影响酶催化反应的因素影响酶催化反应的因素 影影响响酶酶催催化化反反应应的的因因素素众众多多，除除了了酶酶和和底底物物的的性性质质，还还应应该该考考虑虑酶酶的的活活性性、底底物物的的浓浓度度、激激活活剂剂与与抑抑制制剂剂、温温度度、酸酸度度等等。在在讨讨论论影影响响酶酶促促反反应应的的因因素素时时，有有两两个个前前提提：一一是是采采取取单单因因子子研研究究法法，即即固固定定其其它它因因素素不不变变；二二是是讨讨论论酶酶促促反反应应的的初初速速度，因为此时的反应速度与酶的活性成正比。度，因为此时的反应速度与酶的活性成正比。29温度对酶催化反应的影响温度对酶催化反应的影响pH对乳酸脱氢酶活性的影响对乳酸脱氢酶活性的影响305.2 酶法分析的检测技术 在在酶酶法法分分析析中中，被被分分析析的的对对象象可可以以是是酶酶、底底物物、底底物物类类似似物物、酶酶的的活活化化剂剂或或抑抑制制剂剂等等。总总之之，凡凡是是可可以以影影响响酶酶催催化化反反应应的的各各种种物物质质都都有有可可能能被被分分析析。根根据据被被分分析析对对象象是是对对反反应应速速度度的的影影响响，还还是是对反应平衡的影响，其分析方法也有所不同。对反应平衡的影响，其分析方法也有所不同。31例例如如，对对酶酶活活性性的的测测定定，只只能能采采用用与与动动力力学学相相关关的的方方法法，而而对对底底物物的的测测定定既既可可以以采采用用动动力力学学方方法法，也也可可以以采采用用平平衡衡法法。常常用用的的分分析析方方法法包包括括初初速速度度法法、固固定定时时间间分分析析法法、固固定定变变化化分分析析法法及及平平衡衡分分析析法法等等。有有时时还还可可以以采采用用酶酶偶偶联联分分析析法法，使使分分析析测定简单化。测定简单化。325.2.1 酶活性的测定 为为了了检检测测酶酶催催化化反反应应就就需需要要测测定定酶酶作作用用底底物物浓浓度度的的减减小小或或产产物物的的积积累累，所所以以要要求求底底物物或或产产物物可可以以提提供供被被检检测测的的信信号号，并并且且要要求求底底物物与与产产物物之之间间有有比比较较大大的的信信号号差差异异，以以便便对对一一种种的的检检测测不不受受另另一一种种的的干干扰扰。由由于于酶酶活活性性代代表表的的是是其其催催化化反反应应的的能能力力，所所以以、根根据据所所催催化化反反应应的的速速度度便便可可以以得得到到酶酶的的活活性性。无无论论是是临临床床化化学学中中酶酶的的分分析析，还还是是在在酶酶的的分分离离、提提纯纯过过程程，或或者者是是对对酶酶的的性性质质的的研研究究，都都需需要要进进行行酶酶活活性性的检测。的检测。33 测测定定单单位位时时间间内内产产物物的的增增加加量量或或底底物物的的减减少少量量的的方方法法很很多多，常常用用的的分分析析方方法法有有分分光光光光度度法法、滴滴定定法法、电电化化学学分分析析法法、荧荧光光光光度度法法、比比旋旋光光度度法法等等。通通常常多多选选用用测测定定产产物物的的增增加加量量，因因为为产产物物浓浓度度由由低低向向高高变化，比较容易测定。变化，比较容易测定。34测定方法初速度法 酶催化反应速度与酶和底物的浓度相关。酶促反酶催化反应速度与酶和底物的浓度相关。酶促反应的初速度最大，且能保持恒定。但随着反应时间应的初速度最大，且能保持恒定。但随着反应时间的增加反应速度会逐渐减小。所以，酶活性的准确的增加反应速度会逐渐减小。所以，酶活性的准确信息必须通过测定反应的初速度来确定。反应初速信息必须通过测定反应的初速度来确定。反应初速度恒定的时间一般很有限，初速度的测定必须在此度恒定的时间一般很有限，初速度的测定必须在此时间范围内进行。一般采取过量底物的方法来保证时间范围内进行。一般采取过量底物的方法来保证能够真实反映酶的活性。能够真实反映酶的活性。35固定时间分析法 间间隔隔一一定定的的时时间间，分分几几次次取取出出一一定定体体积积的的反反应应液液，使使酶酶终终止止作作用用，然然后后分分析析产产物物的的生生成成量量或或底底物物的的消消耗耗量量。这这是是最最经经典典的的方方法法，至至今今仍仍很很常常用用。但但应应注注意意，所所选选的的时时间间段段内内酶酶活活性性不不应应有有大大的的变变化。化。36固定变化分析法 这这种种方方法法与与固固定定时时间间法法的的原原理理相相同同，把把酶酶活活性性与与要要产产生生一一定定的的反反应应量量所所需需的的时时间间关关联联起起来来，即即酶酶的的活活性性与与产产生生一一定定的的变变化化量量所所需需的的时时间间成成反反比比。这这种种方方法法对对于于反反应应中中产产生生pH变变化化的的体体系系非非常常有有用用，因因为为这这可可以以通通过过电电位位法法方方便便地地进进行行测定。测定。37偶联法测定酶活性 有有时时需需要要将将两两个个酶酶反反应应偶偶联联起起来来以以获获得得可可被被检检测测的的信信号号。例例如如、葡葡萄萄糖糖在在己己糖糖激激酶酶和和ATP的的存存在在下下生生成成葡葡萄萄糖糖6磷磷酸酸及及ADP，由由于于这这样样一一个个反反应应中中没没有有明明显显的的光光谱谱性性质质的的变化，所以无法对酶的活性进行直接的检测。变化，所以无法对酶的活性进行直接的检测。生生成成的的葡葡萄萄糖糖6磷磷酸酸可可以以作作为为葡葡萄萄糖糖6磷磷酸酸脱脱氢氢酶酶的的底底物物，并并且且在在NADP存存在在下下发发生生第第二二个个酶酶反反应应，反反应应所所生生成成的的NADPH的的紫紫外外吸吸收收在在340 nm，而而NADP的的最最大大吸吸收收在在280 nm。据此可以对己糖激酶进行测定。据此可以对己糖激酶进行测定。385.2.2 底物的测定酶循环法 有有些些酶酶反反应应待待测测的的底底物物的的浓浓度度非非常常低低，采采用用一一般般的的方方法法很很难难检检测测到到产产物物的的量量。但但可可以以采采用用酶酶循循环环法法使使偶偶联联反反应应中中的的一一种种产产物物积积累累放放大大，当当反反应应进进行行到到一一定定的的时时间间时时，设设法法终终止止反反应应，并并测测定定积积累累的的产产物物，其量的大小直接与主反应中底物的量成正比。其量的大小直接与主反应中底物的量成正比。39待测待测实测实测例如：40底物的动力学测定法 根根据据米米氏氏方方程程，底底物物在在一一定定的的浓浓度度范范围围内内是是可可以以用动力学方法来测定的。用动力学方法来测定的。但但是是，当当底底物物的的浓浓度度很很低低时时，反反应应速速度度很很快快就就会会变变小小，采采用用一一般般的的方方法法很很难难测测定定反反应应的的初初速速度度。但但采采用用一一些些特特殊殊的的偶偶联联反反应应可可以以使使得得反反应应速速度度保保持持，从从而而可可以以获获得得精精确确的的反反应应初初速速度度的的数数据据。这这样样一一种种设设计计的的原原理理是是通通过过循循环环过过程程使使底底物物的的浓浓度度保保持持恒恒定定因因而而指指示示反反应应的的速速度度也也保保持持恒恒定定，该该速速度度与与第第一一个反应中底物的浓度成正比。个反应中底物的浓度成正比。41例：微量辅酶I(NAD)的分析。在在(1)式式中中，NAD在在醇醇脱脱氢氢酶酶的的存存在在下下与与乙乙醇醇反反应应生生成成乙乙醛醛和和NADH，所所生生成成的的NADH又又参参与与(2)式式所所示示的的反反应应，并并使使底底物物NAD复复原原，保保证证了了底底物物NAD的的浓浓度度恒恒定定不不变变，从从而而可可以以很很方方便便地地测测定定第第一一个个反反应的初速度，该速度与底物应的初速度，该速度与底物NAD的浓度成正比。的浓度成正比。12425.2.3 酶的检测方法 分分光光光光度度法法是是利利用用底底物物与与反反应应产产物物在在紫紫外外和和可可见见光光部部分分光光吸吸收收的的不不同同，连连续续或或固固定定时时间间测测定定反反应应一一定定时时间间内内吸吸光光度度的的变变化化。连连续续测测定定法法适适合合于于反反应应速速度度较较快快的的体体系系，而而固固定定时时间间测测定定法法则则适适合合于于一一些些反反应应速速度度较较慢慢的的体体系系。许许多多氧氧化化还还原原酶酶都都可可以以根根据据反反应应过过程程中中混混合合物物吸吸光光度度的的变变化化测测定定其其活活性性。如如脱脱氢氢酶酶以以NAD+或或NADP+作作为为辅辅酶酶，反反应应中中形形成成NADH或或NADPH，在在340 nm处处可可以以观观察察到吸光度的变化。到吸光度的变化。分光光度法43 只只要要酶酶反反应应的的底底物物或或产产物物之之一一有有荧荧光光或或二二者者的的荧荧光光光光谱谱不不发发生生重重叠叠就就可可以以根根据据荧荧光光的的变变化化来来测测定定酶酶的的活活性性。如如NADPH在在340 nm处处吸吸收收光光后后在在460 nm处会发出荧光。处会发出荧光。荧光法44电化学法 有有多多种种电电化化学学方方法法已已经经被被用用于于酶酶活活性性的的检检测测，其其中中应应用用最最广广泛泛的的是是电电位位计计技技术术，它它基基于于溶溶液液的的电电势势取取决决于于被被测测物物的的浓浓度度和和性性质质、如如pH电电极极可可测测定定酶酶反反应应过过程程中中反反应应液液的的pH的的变变化化，从从而而得得知知参参与与反应的酶的活性。反应的酶的活性。45 极极谱谱法法是是另另一一种种常常用用的的电电化化学学方方法法。在在溶溶液液中中浸浸入入两两个个电电极极，其其间间加加一一个个恒恒定定的的电电位位，通通过过检检测测反反应应过过程程中中电电流流的的变变化化来来确确定定参参与与反反应应的的酶酶的的活活力力。基基于于这这一一原原理理的的有有氧氧电电极极法法。有有些些酶酶促促反反应应中中，由由于于氧氧气气的的生生成成或或消消耗耗，引引起起溶溶液液中中溶溶解解氧氧浓浓度度的的变变化化，从从而而引引起起电电极极之之间间电电流流大大小小的的变变化化，由此可计算出酶的活力，由此可计算出酶的活力，46其他方法 量气法量气法 量热法量热法475.3 酶固定化技术和酶传感器 固固定定化化酶酶定定义义为为保保留留或或分分布布在在一一定定的的微微环环境境下下并并具具有有催催化化活活性性的的生生物物催催化化剂剂。酶酶的的固固定定化化是是指指通通过过某某种种方方式式将将酶酶与与载载体体结结合合，使使酶酶被被集集中中或或限限制制，从从而而使使固固定定化化酶酶易易于于从从底底物物和和产产物物中中分分离离出出来来，这这样样可可以以使使贵贵重重的的酶酶在在流流动动系系统统或或传传感感器器上上重重复复多多次次使用。使用。48固定化酶有两种常用的方式：固定化酶有两种常用的方式：一一种种是是先先将将酶酶固固定定到到固固相相载载体体上上，然然后后将将其其装装在在一一个小柱子中成为一个固定化酶反应柱；个小柱子中成为一个固定化酶反应柱；另另一一种种方方法法是是将将酶酶固固定定化化在在电电极极上上以以电电化化学学的的方方式式传导酶反内产物的信息。传导酶反内产物的信息。49酶固定化的意义酶固定化的意义 固固定定化化通通常常可可以以增增加加酶酶的的活活性性和和稳稳定定性性，并并使使酶酶的的重重复复使使用用简简单单化化。固固定定化化酶酶的的重重复复使使用用也也降降低低了了贵重酶的耗费。贵重酶的耗费。50 对对给给定定的的酶酶，理理想想的的固固定定化化方方法法应应该该使使酶酶具具有有高高的的转转化化数数，同同时时随随着着使使用用时时间间的的增增加加酶酶仍仍能能保保持持高高的的话话性性。酶酶的的固固定定化化会会对对其其物物理理化化学学性性质质产产生生影影响响，因此，固定化实验条件应小心选择。因此，固定化实验条件应小心选择。515.3.1 酶固定化方法 酶酶固固定定化化方方法法没没有有固固定定的的模模式式，一一般般都都凭凭经经验验进进行行。主主要要有有(1)吸吸附附、(2)共共价价结结合合、(3)静静电电结结合合、(4)分分子间交联子间交联、(5)凝胶包埋凝胶包埋及及(6)络合或金属结合络合或金属结合。52 固固定定化化的的目目的的是是要要提提高高单单位位载载体体所所具具有有高高的的酶酶活活力力。因因此此，在在固固定定化化时时，要要充充分分考考虑虑实实验验条条件件。尽尽量量不不改改变变酶酶的的活活性性部部位位更更不不能能导导致致酶酶蛋蛋白白变变性性。当当固固定化酶应用于食品时，就应该避免使用有毒的物质。定化酶应用于食品时，就应该避免使用有毒的物质。53吸附共价结合静电结合分子间交联凝胶包埋络合或金属结合54 酶酶固固定定化化中中使使用用的的载载体体可可分分为为两两大大类类，一一类类是是无无机机载载体体，如如高高岭岭土土、玻玻璃璃珠珠、氧氧化化铝铝、胶胶态态二二氧氧化化硅硅等等等等；另另一一类类是是有有机机载载体体，主主要要有有纤纤维维素素、琼琼脂脂糖糖、聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺、葡葡聚聚糖糖、胶胶原原蛋蛋白白等等等等。经经常常使使用用的的固固定定相相有有明明胶胶和和可可控控硅硅玻玻璃璃型型聚聚合物。合物。55常见的酶固定化技术常见的酶固定化技术565.3.2 酶电极 酶酶电电极极(电电化化学学传传感感器器)属属于于生生物物传传感感器器，一一般般定定义义为为：将将一一个个生生化化的的和和一一个个物物理理的的转转能能器器紧紧密密地地结结合合在在一一起起，所所产产生生的的电电信信号号与与分分析析试试剂剂浓浓度度之之间间有有一一个个计计量量的的关关系系。生生物物化化学学转转能能器器将将分分析析对对象象转转化化为为化化学学或或物物理理的的特特性性，然然后后由由物物理理转转能能器器将将其其转转化化为电信号。为电信号。57酶酶电电极极是是一一种种检检测测器器，它它由由固固定定化化酶酶和和具具有有传传感感功功能能的的电电极极紧紧密密偶偶合合在在一一起起构构成成。酶酶能能催催化化一一种种特特定定的的反反应应并并产产生生在在电电极极上上能能响响应应的的化化合合物物。酶酶电电极极适适合合于于测测定定各各种种气气体体(如如氧氧气气、氢氢气气及及二二氧氧化化碳碳等等)、含含氮氮化化合合物物(如如NO，NH3)、离离子子活活性性(如如碱碱金金属属及及重重金金属属)及及氧氧化化还还原原性性有有机机化化合合物物，分分析析灵灵敏敏度度在在亚微摩尔数量级。亚微摩尔数量级。58（1 1）采用固定化生物活性物质作催化剂，价值昂贵的试剂可）采用固定化生物活性物质作催化剂，价值昂贵的试剂可以重复多次使用，克服了过去酶法分析试剂费用高和化学分以重复多次使用，克服了过去酶法分析试剂费用高和化学分析繁琐复杂的缺点。析繁琐复杂的缺点。（2 2）专一性强，只对特定的底物起反应，而且不受颜色、）专一性强，只对特定的底物起反应，而且不受颜色、浊度的影响。浊度的影响。（3 3）分析速度快，可以在一分钟得到结果。）分析速度快，可以在一分钟得到结果。（4 4）准确度高，一般相对误差可以达到）准确度高，一般相对误差可以达到1 1 （5 5）操作系统比较简单，容易实现自动分析）操作系统比较简单，容易实现自动分析 （6 6）成本低，在连续使用时，每例测定仅需要几分钱。）成本低，在连续使用时，每例测定仅需要几分钱。（7 7）有的生物传感器能够可靠地指示微生物培养系统内）有的生物传感器能够可靠地指示微生物培养系统内的供氧状况和副产物的产生。在产控制中能得到许多复杂的的供氧状况和副产物的产生。在产控制中能得到许多复杂的物理化学传感器综合作用才能获得的信息。物理化学传感器综合作用才能获得的信息。生物传感器特点生物传感器特点59生物传感器发展历史生物传感器发展历史(R(R代表受体代表受体)60 酶法分析的优点 分分析析化化学学上上一一个个非非常常重重要要的的问问题题是是选选择择性性问问题题，特特别别是是当当待待测测物物的的浓浓度度非非常常低低，而而所所存存在在的的干干扰扰物物的的浓浓度度又又很很高高时时更更是是如如此此。酶酶反反应应的的高高选选择择性性使使得得在在极极其其复复杂杂系系统统中中低低浓浓度度物物质质的的测测定定成成为为可可能能，因因而而避避免免了了使使用用很很复复杂杂的的仪仪器器设设备备(如如色色谱谱和和质质谱谱)。而而且且当当酶酶作作为为示示踪踪试试剂剂的的抗抗体体、结结合合蛋蛋白白等等一一起起用用于于基基于于生生物物识识别别反反应应的的分分析析时时，其其催催化化放放大大效效应应可可以使分析方法的灵敏度得到大幅度的提高。以使分析方法的灵敏度得到大幅度的提高。5.4 酶法分析615.4.1 胞内酶活性的检测 待待测测酶酶常常存存在在于于细细胞胞内内组组织织周周围围的的液液体体、哺哺乳乳动动物物细细胞胞生生长长的的介介质质、细细菌菌、酵酵母母或或菌菌类类细细胞胞中中。在在活活性性测定之前应注意下述两个因素：测定之前应注意下述两个因素：(1)在在测测定定的的早早期期应应对对蛋蛋白白水水解解酶酶的的活活性性进进行行抑抑制制。否则，它们会分解或破坏所要分析的酶的活性。否则，它们会分解或破坏所要分析的酶的活性。(2)小小分分子子的的干干扰扰，它它们们可可能能会会错错误误地地被被当当成成是是酶酶的的底底物物或或产产物物。特特殊殊情情况况时时它它们们可可能能就就是是酶酶的的抑抑制制剂剂。如如果果含含血血清清的的培培养养液液用用于于哺哺乳乳动动物物细细胞胞的的培培养养，则则应应进行纯化或要进行血清酶活性的测定。进行纯化或要进行血清酶活性的测定。62亚细胞样品酶活性的测定635.4.2 工业过程及产品中酶的测定 药药物物、去去污污剂剂工工业业，包包括括废废物物处处理理工工业业等等都都是是酶酶应应用用的的非非常常重重要要的的领领域域。另另外外，酶酶在在纺纺织织、皮皮革革、造纸及酒精工业等方面也具有很广阔的应用前景。造纸及酒精工业等方面也具有很广阔的应用前景。645.4.3 临床诊断中酶的测定 生生物物体体内内的的代代谢谢活活动动都都是是由由酶酶促促反反应应支支撑撑的的，一一个个细细胞胞中中含含有有上上千千种种酶酶并并且且在在细细胞胞各各个个组组分分中中，酶酶的的种种类类与与含含量量不不同同。细细胞胞内内进进行行的的复复杂杂的的生生化化反反应应在在酶酶的的催催化化作作用用下下仍仍有有序序地地进进行行着着。生生命命活活动动的的关关键键是是依依靠靠酶酶系系统统的的完完整整性性、酶酶活活性性的的调调节节和和酶酶含含量量的的调调节节，否否则则将将引引起起疾疾病病甚甚至至危危及及生生命命。酶酶缺缺陷陷引引起起的的疾疾病病多多属属先先天天性性或或遗遗传传性性疾疾病病；酶酶活活性性异异常常往往往往可可以以用用来来诊诊断断疾疾病病。如如血血清清及及尿尿中中的的淀淀粉粉酶酶主主要要用用于于胰胰腺腺炎炎的的诊诊断断，当当急急性性胰胰腺腺炎炎时时，血血清清淀淀粉粉酶酶迅迅速速升高，但只有比正常值大两倍以上时才有意义。升高，但只有比正常值大两倍以上时才有意义。655.4.4 酶在生化分析中应用的发展趋势单细胞分析 将来酶测定关键的步骤是小型化及高选择性分离和测将来酶测定关键的步骤是小型化及高选择性分离和测定方法的发展，而且分离和测定要能同时进行。最终目定方法的发展，而且分离和测定要能同时进行。最终目的是能够在单细胞和亚细胞水平上进行生命的分子过程的是能够在单细胞和亚细胞水平上进行生命的分子过程的研究，并且在可能的情况下尽量不破坏细胞的整体性的研究，并且在可能的情况下尽量不破坏细胞的整体性来进行特定酶活性的分析。对于单细胞分析，毛细管电来进行特定酶活性的分析。对于单细胞分析，毛细管电泳是最佳的选择。泳是最佳的选择。测定时可以将单个细胞吸入毛细管中，然后用高盐缓测定时可以将单个细胞吸入毛细管中，然后用高盐缓冲液使细胞溶解；也可以将一个超薄的毛细管插入到细冲液使细胞溶解；也可以将一个超薄的毛细管插入到细胞中吸取细胞内的成分用于分析。胞中吸取细胞内的成分用于分析。66模拟酶分析推动模拟酶推动模拟酶(又称人工酶又称人工酶)研究的有两个动力：研究的有两个动力：一一是是酶酶反反应应具具有有高高效效专专一一、省省能能源源、无无公公害害的的理理想想反应的特点反应的特点二二是是天天然然酶酶提提取取困困难难、价价格格昂昂贵贵、易易失失活活、难难以以储储存存，模模拟拟酶酶就就是是基基于于对对天天然然酶酶的的结结构构的的了了解解，设设计计合合成成比比天天然然两两简简单单得得多多的的非非蛋蛋白白质质分分子子，但但具具有有酶酶催催化化的的高高效效性性与与专专一一性性，对对热热、酸酸、碱碱稳稳定定，能能溶溶于有机溶剂。于有机溶剂。67若是盲目的一味迫求模拟天然酶，不仅目前科学若是盲目的一味迫求模拟天然酶，不仅目前科学水平无法达到，付出的代价也是难以承受的。水平无法达到，付出的代价也是难以承受的。目前，酶的模拟有两种途径：目前，酶的模拟有两种途径：一是对酶的活性中心功能团的模拟，这些模型删一是对酶的活性中心功能团的模拟，这些模型删去了大部分对酶的活性比较次要的结构，合成模去了大部分对酶的活性比较次要的结构，合成模拟酶的分子量只有天然酶的千分之一到万分之一拟酶的分子量只有天然酶的千分之一到万分之一二是对酶作用方式的模拟，例如胶束模拟酶。二是对酶作用方式的模拟，例如胶束模拟酶。68 带带有有咪咪唑唑基基、羟羟基基、巯巯基基