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色谱分离色谱分离第1页，共67页，编辑于2022年，星期二1 1 分配系数与分配比分配系数与分配比分配系数分配系数 在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的的浓度（浓度（g/mL）比）比，用，用K 表示。表示。第2页，共67页，编辑于2022年，星期二分配比 k：质量比，又叫容量因子或容量比分分配配系系数数与与分分配配比比都都是是与与组组分分及及固固定定相相的的热热力力学学性性质质有有关关的的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化。常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化。分分配配系系数数与与分分配配比比都都是是衡衡量量色色谱谱柱柱对对组组分分保保留留能能力力的的参参数数，数数值值越大，该组分的保留时间越长。越大，该组分的保留时间越长。第3页，共67页，编辑于2022年，星期二 意义：意义：溶质流过色谱柱时，K大的组份通过色谱柱所需要的时间长，K小的组份需要的时间短。当样品中各组份在两相的m不同时，就能实现差速迁移，达到分离的目的。第4页，共67页，编辑于2022年，星期二2、基基线线：在实验条件下，色谱柱仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线称为基线。3、峰峰高高：色谱峰顶与基线间的垂直距离，以h表示。4、保留值：、保留值：A 死死时时间间tm：不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间。因为物质不被固定相吸附，故其流动速度将与流动相的流动速度相近：B保保留留时时间间tr：试样从进样到柱后出现峰极大点时所经历的时间。C 调整保留时间调整保留时间tr：.第5页，共67页，编辑于2022年，星期二 保留时间保留时间tr的表达的表达：时间单位(如s,d,h),距离单位(如cm)，体积(ml,l)表示。tr意义意义：色谱法定性的基本依据，但同一组份的tr常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积等参数进行定性检定。第6页，共67页，编辑于2022年，星期二D、死死体体积积VM：指色谱柱内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和，当后两项很小而可忽略不计时，VM可由tm与流动相体积流速F0(ml/min)的乘积计算：E、保保留留体体积积VR：指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积。保留体积与tr的关系如右图：F、调调整整保保留留体体积积VR：某组份VR扣除VM后，称该组份的VR，即第7页，共67页，编辑于2022年，星期二G、相对保留值、相对保留值 2,1：某组份2与组份1的调整保留值之比，即：由于 2,1只与柱温及固定相的性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它是色谱法中，如GC、HPLC中，广泛使用的定性数据。注意：2,1绝不是两个组份保留时间或保留体积之比在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标值(s),然后再求其它峰(i)对这个峰的相对保留值。此时r,i可能大于1，也可能小于1。在多元混合物分析中，通常选择一对最难分离的物质对，将它们的相对保留值作为重要参数。在这种特殊情况下，可用符号a表示：式中tr,2为下一峰的调整保留时间，所以这时a总是大于1。第8页，共67页，编辑于2022年，星期二H)、分配比、分配比 k,即容量因子：即容量因子：意义意义：色谱柱对组份保留能力的重要参数k与m的关系：5 区域宽度区域宽度色谱主峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素。度量色谱峰区域宽度通常有三种方法：A、标准差、标准差：0.607倍峰高处峰宽的一半。B、半半峰峰宽宽Y1/2：峰高一半处对应的峰宽。它与 的关系为C、基基线线宽宽度度Y：色谱两侧拐点上的切线在基线上的截距。第9页，共67页，编辑于2022年，星期二色谱曲线的意义：色谱曲线的意义：色谱峰数色谱峰数=样品中单组份的最少个数；样品中单组份的最少个数；色谱保留值色谱保留值定性依据；定性依据；色谱峰高或面积色谱峰高或面积定量依据；定量依据；色谱保留值或区域宽度色谱保留值或区域宽度色谱柱分离效能评价指标；色谱柱分离效能评价指标；色谱峰间距色谱峰间距固定相或流动相选择是否合适的依据。固定相或流动相选择是否合适的依据。第10页，共67页，编辑于2022年，星期二 两组份完全分离必须满足：两组份完全分离必须满足：A、两组份的分配系数必须有差异；B、区域扩宽的速率应小于区域分离的速度；C、在保证快速分离的前提下，提供足够长的色谱柱。第11页，共67页，编辑于2022年，星期二6 两种色谱理论两种色谱理论u 塔板理论塔板理论热力学因素热力学因素u 速率理论速率理论动力学因素动力学因素 第12页，共67页，编辑于2022年，星期二 塔板理论的假设：塔板理论的假设：(1)在每一个塔板上，可以迅速建立分配平衡在每一个塔板上，可以迅速建立分配平衡 (2)(2)将流动相看作成脉动（间歇）过程；将流动相看作成脉动（间歇）过程；(3)(3)试样沿色谱柱方向的扩散可忽略试样沿色谱柱方向的扩散可忽略 (4)(4)每次分配的分配系数相同。每次分配的分配系数相同。（1）塔板理论 1952年年，Martin等等人人提提出出的的塔塔板板理理论论将将一一根根色色谱谱柱柱当当作作一一个个由由许许多多塔塔板板组组成成的的精精馏馏塔塔，用用塔塔板板概概念念来来描描述述组组分分在在柱柱中中的的分分配配行行为为。塔塔板板是是从从精精馏馏中中借借用用的的，是是一一种种半半经经验验理理论论，但但它它成成功功地地解解释释了了色色谱谱流流出出曲曲线呈正态分布线呈正态分布。半半经经验验理理论论；将将色色谱谱分分离离过过程程比比拟拟作作蒸蒸馏馏过过程程，将将连连续续的的色色谱谱分分离离过过程程分分割割成成多多次次的的平平衡衡过过程程的的重重复复（类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程）。（类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程）。第13页，共67页，编辑于2022年，星期二 将色谱柱视为精馏塔，即色谱柱是一系列连续的、相等的水平塔板组成。每一块塔板高塔板高(plate high)为为H。假设在每一块塔板上，溶质在两相间很快达到分配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前转移。对一长为L的色谱柱，溶质平衡的次数应为：n称为称为理论塔板数理论塔板数(theoreticalplatenumber)。与精馏塔一样，色谱柱的柱柱效效 随理论塔板数n的增加而增加，随塔板高H的增大而减小。第14页，共67页，编辑于2022年，星期二 色谱柱长：色谱柱长：L，塔板高度：塔板高度：H，色谱柱的理论塔板数：色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为：则三者的关系为：n=L/H 理论塔板数与色谱参数之间的关系为：理论塔板数与色谱参数之间的关系为：柱效参数：柱效参数：柱效参数：柱效参数：单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高组分在组分在tM时间内不参与柱内分配，需引入时间内不参与柱内分配，需引入有效塔板数有效塔板数和和有效塔板高度有效塔板高度：YY第15页，共67页，编辑于2022年，星期二（2）速率理论-影响柱效的因素用用速速率率方方程程重重新新定定义义塔塔板板高高度度，并并提提出出影影响响柱柱效效的的动动力力学学因因素素：涡流扩散、分子扩散、传质阻力涡流扩散、分子扩散、传质阻力速率方程（也称范速率方程（也称范.弟姆特方程式）弟姆特方程式）H=A+B/u+Cu H：理论塔板高度，：理论塔板高度，u：载气的线速度：载气的线速度(cm/s)A 涡流扩散项B/u 分子扩散项Cu 传质阻力项第16页，共67页，编辑于2022年，星期二涡流扩散项 A=2dp dp：固定相的平均颗粒直径：固定相的平均颗粒直径：固定相的填充不均匀因子：固定相的填充不均匀因子固固定定相相颗颗粒粒越越小小dp，填填充充的的越越均均匀匀，A，H，柱柱效效n，色色谱谱峰峰变变宽宽现现象减轻，色谱峰较窄。象减轻，色谱峰较窄。第17页，共67页，编辑于2022年，星期二分子扩散项 B=2Dg ：弯曲因子，弯曲因子，Dg：组分在气相中的扩散系数（：组分在气相中的扩散系数（cm2s-1）与与组分性质组分性质、流速流速、滞留时间、流动相性质、滞留时间、流动相性质、柱温柱温等因素有关等因素有关 第18页，共67页，编辑于2022年，星期二 k为容量因子；为容量因子；Dg、DL为扩散系数。为扩散系数。减小担体粒度，选择小分子量的气体作载气，可降低传质阻力。减小担体粒度，选择小分子量的气体作载气，可降低传质阻力。传质阻力项流动相传质阻力流动相传质阻力Cg固定传质阻力固定传质阻力CL C=（Cg+CL）第19页，共67页，编辑于2022年，星期二分离度 塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。度。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。难难分分离离物物质质对对的的分分离离度度大大小小受受色色谱谱过过程程中中两两种种因因素素的的综综合合影影响响：保留值之差保留值之差色谱过程的热力学因素；色谱过程的热力学因素；区域宽度区域宽度色谱过程的动力学因素。色谱过程的动力学因素。色谱分离中的四种情况如图所示：色谱分离中的四种情况如图所示：柱效高，柱效高，K(分配系数分配系数)较大较大,完全分离；完全分离；K不是很大，峰较窄，柱效高，基本分离不是很大，峰较窄，柱效高，基本分离 峰宽，柱效较低，峰宽，柱效较低，K较大较大,但分离的不好；但分离的不好；K小，柱效低，分离效果更差。小，柱效低，分离效果更差。第20页，共67页，编辑于2022年，星期二分离度的表达式：R=0.8：两峰的分离程度可达：两峰的分离程度可达89%；R=1：分离程度：分离程度98%；R=1.5：达：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。（相邻两峰完全分离的标准）。Y1Y2第21页，共67页，编辑于2022年，星期二n 理论塔板数理论塔板数n 增加柱效增加柱效，可提高分离度，可提高分离度n r21 （或（或选择选择因子因子）增大增大r21是提高分离度的最有效方法，是提高分离度的最有效方法，n 容量因子，分配比容量因子，分配比影响分离度的因素影响分离度的因素柱选择项柱选择项柱选择项柱选择项柱容量项柱容量项柱容量项柱容量项柱效项柱效项柱效项柱效项22114kknR+-=aa第22页，共67页，编辑于2022年，星期二k k 影响峰位影响峰位影响峰位影响峰位n n 影响峰宽窄影响峰宽窄影响峰宽窄影响峰宽窄 影响两峰间距影响两峰间距影响两峰间距影响两峰间距第23页，共67页，编辑于2022年，星期二谱定性、定量方法1.1.利用纯物质定性的方法利用纯物质定性的方法 2.2.利用文献保留值定性利用文献保留值定性3.3.与其他分析仪器联用的定性方法与其他分析仪器联用的定性方法定性方法定量方法归一化法归一化法标准曲线法外标法标准曲线法外标法内标法内标法第24页，共67页，编辑于2022年，星期二第三节第三节 凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱 一、一、原理与操作原理与操作定义：定义：凝胶过滤凝胶过滤 (Gelfitration)即即凝胶过滤层析凝胶过滤层析 (Gelfitration Chromatography)，也也 称称分分 子子 排排 阻阻 层层 析析 (Molecular-Exclusion)、尺寸排阻尺寸排阻 (Size Exclusion)、分子筛层析分子筛层析 (Moleculai-Sieve Chromatography)，是是以以各各种种多多孔孔凝凝胶胶为为固固定定相相，利利用用溶溶液液中中各组分的分子量不同而进行分离的技术。各组分的分子量不同而进行分离的技术。第25页，共67页，编辑于2022年，星期二GFC是一种纯粹按照溶质分子在流动相溶剂中的体积大是一种纯粹按照溶质分子在流动相溶剂中的体积大小分离的色谱法。小分离的色谱法。填料具有一定范围的孔尺寸，大分子进不去而先流出色填料具有一定范围的孔尺寸，大分子进不去而先流出色谱柱，小分子后流出。谱柱，小分子后流出。第26页，共67页，编辑于2022年，星期二 在层析柱中填充分子筛(凝胶)介质，加入待纯化样品，然后用适当缓冲液淋洗，使样品自上而下扩展。大于凝胶孔径的分子不能进入胶粒内部而从胶粒间间隙扩展，下移速度较快；反之，小于凝胶孔径的分子，能自由出入胶粒内外，按照分于热运动规律，其运动轨迹“迂回曲折”。因此，下移速度慢。所以，样品通过一定距离的层析柱后，不同大小的分子就将按先后顺序依次流出，彼此分开。第27页，共67页，编辑于2022年，星期二第28页，共67页，编辑于2022年，星期二第29页，共67页，编辑于2022年，星期二凝胶过滤法是一种Partition层析法：样本固定相流动相小分子被阻滞小分子大分子Stokes radius分子大小、形状较快流出第30页，共67页，编辑于2022年，星期二第31页，共67页，编辑于2022年，星期二分子筛凝胶色谱原理分子筛凝胶色谱原理第32页，共67页，编辑于2022年，星期二第33页，共67页，编辑于2022年，星期二Size-exclusion chromatography第34页，共67页，编辑于2022年，星期二第35页，共67页，编辑于2022年，星期二Desalting proteins 脱盐蛋白脱盐蛋白proteinssalts第36页，共67页，编辑于2022年，星期二 图示，在装填具有一定孔径分布的凝胶过滤介质的层析柱中，料液中溶质1的相对分子质量很大，不能进入到凝胶的细孔中，因而从凝胶间的床层空隙流过，洗脱体积为层析柱的空隙体积；对子溶质4，其相对分子质量很小，能够进入到凝胶的所有细孔中，因而其洗脱体积接近柱体积；相对分子质量介于溶质1和溶质4之间的溶质2和3可进入到凝胶的部分细孔中，故其洗脱体积介于空隙体积和柱体积之间，根据相对分子质量的差别（溶质2的相对分子质量大于溶质3）顺序洗脱。相对分子质量大于溶质l和小于溶质4的溶质的洗脱体积分别与溶质1和溶质4相同。GFC的分离原理及洗脱曲线第37页，共67页，编辑于2022年，星期二GFC操作中溶质的分配系数M只是相对分子质量、相对分子质量、相对分子质量、相对分子质量、分子形状、分子形状、分子形状、分子形状、凝胶结构凝胶结构凝胶结构凝胶结构(孔径分布孔径分布孔径分布孔径分布)的函数，与所用洗脱液的pH值和离子强度值和离子强度等物性无关，即在一般的层析操作条件下、相对分子质量一定的溶质的分配系数为常数。因此，GFC操作一般采用组成一定的洗脱液进行洗脱展开，这种洗脱法称为恒定洗脱法(isocraticelution)。第38页，共67页，编辑于2022年，星期二GFC可分离系统体积介于V0和Vt之间的溶质，分离精度有限，料液处理量也很小，只有当料液体积小于两溶质的洗脱体积差，才有可能完全分离。第39页，共67页，编辑于2022年，星期二 （1）凝胶的处理 葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶以干品出售的，所以在使用前必须溶胀。可以将它们浸泡在洗脱剂中，慢慢搅拌。洗脱剂应具有一定的离子强度（约为0.08）。这是因为大多数凝胶都含有少量羧基，如果洗脱剂的离子强度低于0.08，少量羧基不能被屏蔽，凝胶颗粒就具有离子交换性质，从而改变溶质的分配系数。二、二、凝胶层析的操作凝胶层析的操作第40页，共67页，编辑于2022年，星期二溶胀时不能用电磁搅拌器，这样会使颗粒损坏，产生大量粉末，影响流速。溶胀要完全，否则影响层析的均一性，甚至有使柱破裂的危险，加热可使溶胀加速。溶胀时搅拌可能产生很细的颗粒，必须将其除去，否则会严重降低柱的流速。琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶是以浓的悬浮液的形式出售的，不需溶胀。第41页，共67页，编辑于2022年，星期二凝胶层析的操作凝胶层析的操作 （2）装柱装柱前，柱的底部要先放些玻璃棉、玻璃细孔板等可拆卸的支持物，以支持固定相。凝胶要悬浮在洗脱剂中，在搅拌下缓慢加入柱中，使凝胶自然沉积，直到所需高度为止。床层要均匀，不能有纹路或气泡。装柱时要考虑凝胶的承压能力，如压力太高，凝胶会被挤压变形而影响流速。第42页，共67页，编辑于2022年，星期二 （3）上样和洗脱 柱床经洗脱剂平衡后，在床顶部留下数毫升洗脱剂，再用滴管轻轻沿柱壁将试样试样加入至柱的上面，防止扰动填充层表面，打开柱底部的流出口，使样品液渗入凝胶床内。当样品液面恰与凝胶床表面平时，加入数毫升洗脱剂冲洗管壁。这一步关键是既要使样品恰好全部渗入凝胶床，又不致使凝胶表面干燥而发生裂缝。然后用大量洗脱剂洗脱，并收集相应的洗脱液。第43页，共67页，编辑于2022年，星期二非水溶性物质的洗脱采用有机溶剂（如苯和丙酮），水溶性物质的洗脱一般采用水或具有不同离子强度和pH的缓冲液。pH的影响与被分离物质的酸碱性有关，在酸性pH时碱性物质易于洗脱，在碱性pH时酸性物质易于洗脱。多糖类物质的洗脱以水为最佳，有时为了使样品溶液解度增加而使用含盐洗脱剂。第44页，共67页，编辑于2022年，星期二（4）凝胶的再生和保养理论上因为凝胶本身不与溶质发生作用，所以层析分离后无需再生处理，但实际操作时凝胶层常有一定的污染，必须作适当的处理。交联葡萄糖凝胶柱可用0.2mol/LNaOH和0.5mol/LNaCl混合液处理。聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶由于遇酸、碱不稳定，常用0.5mol/LNaCl处理。第45页，共67页，编辑于2022年，星期二为了抑制微生物在凝胶层内生长，在凝胶床保存之前必须完全除去磷酸根离子和所有底物，将柱真空保存或低温保存，但温度不可过低，离子强度要高一些，以防冻结。经常使用的凝胶以湿态保存为主，只要在其中加入适当的抑菌剂就可放置几个月至一年，不需要干燥。常用的抑菌剂有：叠氮钠（0.02%）、三氯丁醇（0.01%0.02%）、乙基汞硫代水扬酸钠(0.005%0.01%)、苯基汞代盐（包括、苯基汞代乙酸盐、硝酸盐、硼酸盐，0.001%0.01%）。第46页，共67页，编辑于2022年，星期二三三 凝胶过滤介质凝胶过滤介质凝胶过滤层析常用于蛋白质等生物大分子的分级分离和除盐。因此，良好凝胶过滤介质应满足以下要求：亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不发生任何化学或物理相互作用；稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及化学试剂中保持稳定，使用寿命长；具有一定的孔径分布范围；机械强度高，允许较高的操作压力(流速)。第47页，共67页，编辑于2022年，星期二各种色析胶体：Pharmacia（法玛西亚）Bio-RadSephadexSepharoseSephacrylSephacelBioGelPBioGelAglucose(dextrose)agaroseglucose+acrylamidecelluloseacrylamideagaroseFPLCSuperose,SuperdexMonoQ,MonoS第48页，共67页，编辑于2022年，星期二传统传统SEC填料填料 粗、中、细粗、中、细 Sephadex葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶（瑞典（瑞典 Pharmacia 公司公司Amersham）肽和球蛋白的分离范围肽和球蛋白的分离范围G10 -700G15 -1500G25 10005000G50 150030000G75 300080000G100 4000150000 超细超细4000100000G150 5000300000 超细超细5000150000G200 5000600000 超细超细5000250000第49页，共67页，编辑于2022年，星期二Sephacryl 烯丙烯基葡聚糖与烯丙烯基葡聚糖与N、N-亚甲基双丙烯酰胺经共亚甲基双丙烯酰胺经共聚而制备的一种共价交联的刚性珠体。聚而制备的一种共价交联的刚性珠体。S-200 5000250,000 S300/400/500/1000Sepharose琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶2B/4B/6BSepharose CL交联琼脂糖交联琼脂糖 琼脂糖与琼脂糖与2，3-二溴丙醇在强碱二溴丙醇在强碱性条件下反应而得。性条件下反应而得。第50页，共67页，编辑于2022年，星期二Bio-Gel Bio Rad(美美)Bio-Gel A 琼脂糖琼脂糖 P聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺Superdex 琼脂糖和葡聚糖琼脂糖和葡聚糖 TSK-Gel乙烯共聚物乙烯共聚物 PW2000/2500/3000/4000/5000TSK HW-40/50/55/65/75TSK G4000/3000/2000SW凝胶过滤色谱一般用于原料液的凝胶过滤色谱一般用于原料液的初分离。初分离。第51页，共67页，编辑于2022年，星期二SephadexG是最传统的软凝胶过滤介质之一，目前仍被广泛使用。SephadexG是利用葡聚糖(右旋糖酐)交联制备的，交联剂一般采用环氧氯丙烷。原料中环氧氯丙烷用量越大，交联度越高，凝胶的网状结构越紧密，吸水量越小。Sephadex凝胶按交联度大小，分G10G200共八种型号。图7-7中曲线表示葡聚糖凝胶骨架。图7-7交联葡聚糖网状结构图7-8琼脂糖凝胶结构琼脂糖凝胶是另一种较常使用的凝胶过滤介质，其骨架结构如图7-8所示。第52页，共67页，编辑于2022年，星期二Sepharose是常用的琼脂糖凝胶品牌之一，机械强度较低。SepharoseCL是利用环氧氯丙烷交联制备的琼脂糖凝胶，机械强度较普通Sepharose高。除GFC外，琼脂糖凝胶经化学修饰后主要用于离子交换层析、疏水性相互作用层析及亲和层析的载体。除上述两种常用的凝胶外，聚丙烯酰胺凝胶也常使用。第53页，共67页，编辑于2022年，星期二常用：常用：葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、琼脂糖凝胶、Sephacryl、Superdex等等第54页，共67页，编辑于2022年，星期二表征凝胶特性的参数表征凝胶特性的参数l 排排阻阻极极限限：不不能能扩扩散散到到凝凝胶胶网网络络内内部部的的最最小小分分子子的的相对分子量。相对分子量。l 分分级级范范围围：凝凝胶胶阻阻滞滞并并且且相相互互之之间间可可以以得得到到分分离离的的溶质的相对分子量。溶质的相对分子量。l 凝胶粒径：粒径越小，凝胶粒径：粒径越小，HETP越小，分辨率越大。越小，分辨率越大。空隙体积：色谱柱中凝胶之间空隙的体积。空隙体积：色谱柱中凝胶之间空隙的体积。l 溶胀率：溶胀率：l床体积：床体积：1g凝胶干粉充分溶胀后所占有的体积。凝胶干粉充分溶胀后所占有的体积。第55页，共67页，编辑于2022年，星期二影响分离特性的因素影响分离特性的因素l线速度线速度l料液体积料液体积第56页，共67页，编辑于2022年，星期二凝胶过滤色谱影响操作的因素l线速度线速度l料液体积料液体积第57页，共67页，编辑于2022年，星期二l料液浓度料液浓度 料料液液与与流流动动相相得得黏黏度度比比小小于于2，以以避避免免不规则的洗脱曲线（吐舌和拖尾）。不规则的洗脱曲线（吐舌和拖尾）。l相对分子质量与分配系数的关系相对分子质量与分配系数的关系 ma-blogMrl凝胶粒径凝胶粒径 小小粒粒径径凝凝胶胶是是提提供供色色谱谱柱柱效效的的最最佳佳途途径径。粒粒径径 ，柱柱效效，分分离离度度 ，分分离离速速度度都都变变大大第58页，共67页，编辑于2022年，星期二凝胶层析的应用及特点凝胶层析的应用及特点分离纯化分离纯化GFC可用于相对分子质量从几百到106数量级的物质的分离纯化，是蛋白质、肽、脂质、抗生素、糖类、核酸以及病毒(50nm400nm)的分离与分析中频繁使用的液相层析法。GFC还可用于医药产业中无热原水的制备以及低分子生物制剂中抗原性杂质的除去。例如，青霉素的致敏作用般认为是产品中存在的一些高分子杂质所致，如青霉素聚合物和青霉素降解产物青霉烯酸与蛋白质相结合形成的青毒噻唑蛋白，它们都是具有强烈致敏性的抗原。利用SephadexG25凝胶柱处理青霉素溶液可除去这类高分子杂质第59页，共67页，编辑于2022年，星期二高效GFC分离骨髓血清蛋白质的结果第60页，共67页，编辑于2022年，星期二2 2脱盐脱盐 GFC在分离领域的另一主要用途是生物大分子溶液的脱盐，以及除去其中的低相对分于质量物质。例如，经过盐析沉淀获得的蛋白质溶液中盐浓度很高，一般不能直接进行离子交换层析分离，可首先用GFC脱盐。第61页，共67页，编辑于2022年，星期二 此外，GFC还用于溶解目标产物的缓冲液的交换。生物物质的分离纯化需要多步操作，上一步操作所用缓冲液有时不适合于下一步单元操作的有效实施(例如，某些盐离子抑制蛋白质在亲和吸咐剂上的吸附)，必须进行缓冲液的交换。若将缓冲液A换成缓冲液B，可先用B液冲洗GFC柱，上样后用B液洗脱，即可完成缓冲液的交换。第62页，共67页，编辑于2022年，星期二3相对分子质量的测定相对分子质量的测定GFC中溶质的分配系数m在分级范围内随相对分子质量的对数值增大而线性减小，分配系数与相对分子质量Mr之间存在如下关系：ma-blogMr 在凝胶过滤介质的分级范围内蛋白质的分配系数(或洗脱体积)与相对分子质量的对数呈线性关系，所以GFC可用于未知物质相对分子质量的测定。第63页，共67页，编辑于2022年，星期二 首先用标准蛋白质 如细胞色素C(12500，指分子量，下同)、肌红蛋白(16900)、胰凝乳蛋白酶(23200)、卵白蛋白(45000)和血红蛋白(64500)等分别 进行凝胶过滤层析实验，确定分配系数与相对分子质量的关系式。然后测定未知物质的洗脱体积(分配系数)，就可推算其相对分子质量。不过，GFC仅对球形分子的测量精度较高，对分子形状为棒状的物质，测量值将小于实际值。第64页，共67页，编辑于2022年，星期二凝胶层析的特点凝胶层析的特点 与其他层析法相比，GFC的最大特点是操作简便，凝胶过滤介质相对价廉易得，适合于大规模分离纯化过程。因此，GFC在生物大分子的分离纯化过程中应用最为普遍，尤其被广泛应用子分离纯化过程的初级阶段以及最后成品化前的脱盐。第65页，共67页，编辑于2022年，星期二GFCGFC的具体优点的具体优点：溶质与介质不发生任何形式的相互作用。因此可采用恒定洗脱法洗脱展开，操作条件温和，产品收率可接近100；每批操作结束后不需要进行介质的清洗或再生，故容易实施循环操作，提高产品纯度；第66页，共67页，编辑于2022年，星期二作为脱盐手段，GFC比透析法速度快，精度高，与超滤法相比，剪切应力小，蛋白质活性收率高；分离机理简单，操作参数少，容易规模放大。与其他层析法相比，GFC的不足之处的不足之处：仅根据溶质之间相对分子质量的差别进行分离，选择性低，料液处理量小；经GFC洗脱展开后产品被稀释。因此需要在具有浓缩作用的单元操作(如超滤、离子交换和亲和层析等)后使用。第67页，共67页，编辑于2022年，星期二