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细菌培养基的制备灭菌及接种培养技术1第1页，共38页，编辑于2022年，星期一第一部分第一部分细菌培养基的制备、灭菌细菌培养基的制备、灭菌目的要求目的要求实验材料实验材料实验程序实验程序2第2页，共38页，编辑于2022年，星期一目目 的的 要要 求求熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备。熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备。掌握培养基和无菌水的制备方法。掌握培养基和无菌水的制备方法。掌握高压蒸气灭菌技术。掌握高压蒸气灭菌技术。3第3页，共38页，编辑于2022年，星期一实实 验验 材材 料料药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水等等。高压蒸气灭菌锅、烘箱、细菌过滤器、酒精灯。高压蒸气灭菌锅、烘箱、细菌过滤器、酒精灯。其它：培养皿、试管、移液管、锥形瓶、烧杯、玻璃珠等。其它：培养皿、试管、移液管、锥形瓶、烧杯、玻璃珠等。4第4页，共38页，编辑于2022年，星期一实实 验验 程程 序序玻璃器皿的洗涤和包装玻璃器皿的洗涤和包装培养基的制备培养基的制备无菌稀释水的制备无菌稀释水的制备培养基和玻璃器材等的灭菌培养基和玻璃器材等的灭菌5第5页，共38页，编辑于2022年，星期一实验程序实验程序1 （玻璃器皿的洗涤和包装）（玻璃器皿的洗涤和包装）清洗并烘干玻璃器皿：如培养皿、移液管、试管等。清洗并烘干玻璃器皿：如培养皿、移液管、试管等。棉塞的制作棉塞的制作 包装培养皿和移液管等。包装培养皿和移液管等。6第6页，共38页，编辑于2022年，星期一实实 验验 程程 序序2 （培养基的种类）（培养基的种类）据组成成分可分为据组成成分可分为:1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。2.半合半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。3.天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。从培养基的物理状态可分为从培养基的物理状态可分为 1.液体液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。2.固体培养基：固体培养基：在液体培养基中加入在液体培养基中加入1530g/L左右的琼脂。左右的琼脂。3.半固体培养基：在液体培养基中加入半固体培养基：在液体培养基中加入35g/L左右的琼脂。左右的琼脂。7第7页，共38页，编辑于2022年，星期一实实 验验 程程 序序2 （培养基的种类）（培养基的种类）常用凝固剂为琼脂（其次为明胶），又叫洋菜、冻粉。常用凝固剂为琼脂（其次为明胶），又叫洋菜、冻粉。8第8页，共38页，编辑于2022年，星期一实实 验验 程程 序序2（培养基的配制方法和步骤）（培养基的配制方法和步骤）1.取一个取一个300mL烧杯，装烧杯，装150mL蒸馏水。蒸馏水。2.按配方逐一正确称取各种成分，依次加入水中溶解。按配方逐一正确称取各种成分，依次加入水中溶解。注意：注意：a.前一种成分溶解之后，才能加入下一种成分前一种成分溶解之后，才能加入下一种成分 b.可加热促进各成分溶解可加热促进各成分溶解 c.加热过程应不断搅拌，以免糊底烧焦，并适当补加热过程应不断搅拌，以免糊底烧焦，并适当补充因蒸发而损失的水量。充因蒸发而损失的水量。培养基配方牛肉膏蛋白胨氯化钠琼脂蒸馏水pH数量0.75g1.5g0.75g3g150mL7.69第9页，共38页，编辑于2022年，星期一实实 验验 程程 序序2（培养基的配制方法和步骤）（培养基的配制方法和步骤）3.调调pH值：用值：用10 NaOH调调pH至至7.6，用精密，用精密pH试纸对照。试纸对照。4.分装：将培养基分装于分装：将培养基分装于5支试管，其余全部倒入支试管，其余全部倒入250mL锥形瓶中，分别塞上棉塞。锥形瓶中，分别塞上棉塞。注意不要污染注意不要污染棉塞和瓶口棉塞和瓶口。5.包扎成捆，挂上标签，注明何种培养基。包扎成捆，挂上标签，注明何种培养基。6.灭菌备用：培养基灭菌后必须在灭菌备用：培养基灭菌后必须在37下恒温培养下恒温培养24h，确定无菌生长，方可使用。，确定无菌生长，方可使用。10第10页，共38页，编辑于2022年，星期一实实 验验 程程 序序2 （培养基的分装和斜面培养基的制作）（培养基的分装和斜面培养基的制作）每支试管装的量为试管高度的每支试管装的量为试管高度的1/41/3.斜面长度为试管长度的斜面长度为试管长度的1/31/2.11第11页，共38页，编辑于2022年，星期一实验程序实验程序2 （培养基的配制方法和步骤）（培养基的配制方法和步骤）12第12页，共38页，编辑于2022年，星期一实验程序实验程序3 （无菌稀释水的制备）（无菌稀释水的制备）取一个取一个250mL的锥形瓶装的锥形瓶装90(或或99)mL蒸馏水，放蒸馏水，放30颗玻璃珠颗玻璃珠(用于打破活性污泥、菌块或土壤颗粒用于打破活性污泥、菌块或土壤颗粒)于于锥形瓶内，塞棉塞、包扎，待灭菌。锥形瓶内，塞棉塞、包扎，待灭菌。另取另取5支支18mm180mm的试管，分别装的试管，分别装9mL蒸馏蒸馏水，塞棉塞、包扎，待灭菌。水，塞棉塞、包扎，待灭菌。无菌稀释水为微生物分离实验中所需要的材料。无菌稀释水为微生物分离实验中所需要的材料。13第13页，共38页，编辑于2022年，星期一实验程序实验程序4 （培养基和玻璃器材等的灭菌）（培养基和玻璃器材等的灭菌）加热灭菌有加热灭菌有干热灭菌干热灭菌和和湿热灭菌湿热灭菌。干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器干热灭菌的操作方法干热灭菌的操作方法 a.将待灭菌的物品放入恒温箱，将温度调节至将待灭菌的物品放入恒温箱，将温度调节至160并维持并维持2h；b.把恒温箱的调节旋钮调回零处，待温度降到把恒温箱的调节旋钮调回零处，待温度降到50左右，左右，才能将物品取出。才能将物品取出。14第14页，共38页，编辑于2022年，星期一实验程序实验程序4 （培养基和玻璃器材等的灭菌）（培养基和玻璃器材等的灭菌）湿热灭菌：高压蒸气灭菌法湿热灭菌：高压蒸气灭菌法高压蒸气灭菌法的操作步骤如下：高压蒸气灭菌法的操作步骤如下：1.灭菌锅内加入一定量的水。灭菌锅内加入一定量的水。2.将待灭菌的物品放入锅内，并关严锅盖。将待灭菌的物品放入锅内，并关严锅盖。注意：器物不能装得太满。注意：器物不能装得太满。3.接通电源，进行加热。接通电源，进行加热。4.排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待温度计指排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待温度计指示温度为示温度为100时关闭排气阀；或当排出的蒸气相当猛烈且微时关闭排气阀；或当排出的蒸气相当猛烈且微带蓝色时关闭排气阀。带蓝色时关闭排气阀。15第15页，共38页，编辑于2022年，星期一实验程序实验程序4 （培养基和玻璃器材等的灭菌）（培养基和玻璃器材等的灭菌）5.当压力达当压力达1.05kg/cm2(灭菌器内的温度为灭菌器内的温度为121)即开始灭即开始灭菌，使其维持菌，使其维持1530min。对热不稳定的培养基如含有葡萄。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物质时，应适当降低压力糖、氨基酸等物质时，应适当降低压力(0.56kg/cm2)，延长，延长时间。时间。6.灭菌时间一到，切断电源，灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时待压力降至零时，才能打开排，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品，排出锅内剩余水。气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品，排出锅内剩余水。7.待培养基冷却后置于待培养基冷却后置于37恒温箱内培养恒温箱内培养24h，若无菌生长，若无菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用。则放入冰箱或阴凉处保存备用。16第16页，共38页，编辑于2022年，星期一17第17页，共38页，编辑于2022年，星期一实验程序实验程序4 （培养基和玻璃器材的灭菌方法）（培养基和玻璃器材的灭菌方法）间歇灭菌法：间歇灭菌法：即常压灭菌，用于一些受高温而破坏的培养即常压灭菌，用于一些受高温而破坏的培养基的灭菌。基的灭菌。操作方法：操作方法：a.待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮1次，每次在次，每次在100煮沸煮沸3060min，连续，连续3d重复进行。重复进行。b.在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在37恒温条件恒温条件下培养下培养24h，这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成，这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。营养体，以便下次蒸煮时杀灭。c.第三次蒸煮之后基本无菌，但为了确保无菌仍要放在第三次蒸煮之后基本无菌，但为了确保无菌仍要放在37恒温恒温条件下培养条件下培养24h，确定无菌才能使用。，确定无菌才能使用。18第18页，共38页，编辑于2022年，星期一实验程序实验程序4（培养基和玻璃器材的灭菌方法）（培养基和玻璃器材的灭菌方法）过滤除菌法过滤除菌法：不能用加热灭菌的液不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、体物质（如维生素、血清），一般可用细血清），一般可用细菌过滤器进行除菌。菌过滤器进行除菌。19第19页，共38页，编辑于2022年，星期一第二部分第二部分细菌纯种分离、培养和接细菌纯种分离、培养和接种技术种技术目的要求目的要求实验材料实验材料实验程序实验程序20第20页，共38页，编辑于2022年，星期一目目 的的 要要 求求掌握从环境中分离培养细菌的方法，从掌握从环境中分离培养细菌的方法，从而获得若干种细菌纯培养技能。而获得若干种细菌纯培养技能。掌握几种接种技术。掌握几种接种技术。21第21页，共38页，编辑于2022年，星期一实实 验验 材材 料料无菌培养皿无菌培养皿(直径直径90mm)10套、无菌移液管套、无菌移液管1mL2支、支、10mL1支支。营养琼脂培养基营养琼脂培养基1瓶，活性污泥或土壤或湖水瓶，活性污泥或土壤或湖水1瓶，无菌瓶，无菌稀释水稀释水90mL1瓶、瓶、9mL5管。管。其它：接种环、酒精灯、恒温箱。其它：接种环、酒精灯、恒温箱。22第22页，共38页，编辑于2022年，星期一实实 验验 程程 序序细菌的纯种分离细菌的纯种分离细菌的接种方法细菌的接种方法23第23页，共38页，编辑于2022年，星期一实验程序实验程序1 （细菌的纯种分离）（细菌的纯种分离）稀释平板法稀释平板法平板划线法平板划线法24第24页，共38页，编辑于2022年，星期一实验程序实验程序1（细菌的纯种分离（细菌的纯种分离稀释平板法）稀释平板法）1.取样。取样。2.将将1瓶瓶90mL和和5管管9mL无菌水排列好，用记号笔依次编无菌水排列好，用记号笔依次编上上101、102、103、104、105、106。在无菌操。在无菌操作条件下，用作条件下，用10mL的无菌移液管吸取的无菌移液管吸取10mL水样水样(或其或其它样品它样品)加入编号为加入编号为101无菌水无菌水(内含玻璃珠内含玻璃珠)中，将移液中，将移液管吹洗三次，用手摇管吹洗三次，用手摇10min将颗粒状样品打散。即为将颗粒状样品打散。即为101浓度的菌液。用浓度的菌液。用1mL无菌移液管吸取无菌移液管吸取1mL 101浓度的菌浓度的菌液于编号为液于编号为102无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为为102浓度菌液。同样方法，依次稀释到浓度菌液。同样方法，依次稀释到106。25第25页，共38页，编辑于2022年，星期一实验程序实验程序1（细菌的纯种分离（细菌的纯种分离稀释平板法）稀释平板法）稀释液的制备稀释液的制备26第26页，共38页，编辑于2022年，星期一实验程序实验程序1（细菌的纯种分离（细菌的纯种分离稀释平板法）稀释平板法）3.平板的制作平板的制作 取取10套无菌培养皿编号，套无菌培养皿编号，104、105、106各各3个，另一个为空气个，另一个为空气对照。对照。取取1支支1mL无菌移液管从无菌移液管从浓度小的菌液浓度小的菌液开始，以开始，以106、105、104为序分别吸取为序分别吸取0.5mL菌液于相应编号的培养皿内菌液于相应编号的培养皿内(每次吸取前，用移液管在每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀菌液中吹泡使菌液充分混匀)。27第27页，共38页，编辑于2022年，星期一实验程序实验程序1（细菌的纯种分离（细菌的纯种分离稀释平板法）稀释平板法）3.平板的制作平板的制作 加热培养基，当其冷至加热培养基，当其冷至45左右左右时，右手拿装有培养基的锥形瓶，左时，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，靠托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和逆时将培养皿平放在桌上，顺时针和逆时针来回转动培养皿，使培养基和菌液针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置于充分混匀，冷凝后即成平板，倒置于30培养培养2448h，然后观察结果。，然后观察结果。28第28页，共38页，编辑于2022年，星期一实验程序实验程序1（细菌的纯种分离（细菌的纯种分离稀释平板法）稀释平板法）3.平板的制作平板的制作 取对照无菌培养皿，倒平板待凝固后，打开皿盖取对照无菌培养皿，倒平板待凝固后，打开皿盖10min后盖上，倒置于后盖上，倒置于30培养培养2448h，然后观察，然后观察结果。结果。29第29页，共38页，编辑于2022年，星期一实验程序实验程序1（细菌的纯种分离（细菌的纯种分离平板划线法）平板划线法）1.平板制作：平板制作：将融化并冷至约将融化并冷至约50的肉膏蛋白胨琼的肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌培养皿内，使凝固成平板。脂培养基倒入无菌培养皿内，使凝固成平板。2.划线：划线：用接种环挑取一环样品，左手拿培养皿，用接种环挑取一环样品，左手拿培养皿，中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖皿盖，将培养皿稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀半开，右手将接种环伸入培养皿内，在平板上掀半开，右手将接种环伸入培养皿内，在平板上轻轻划线轻轻划线(切勿划破培养基切勿划破培养基)。划线完毕盖好皿盖，。划线完毕盖好皿盖，30培养培养2448h后观察结果。后观察结果。30第30页，共38页，编辑于2022年，星期一实验程序实验程序1（细菌的纯种分离（细菌的纯种分离平板划线法）平板划线法）31第31页，共38页，编辑于2022年，星期一实验程序实验程序2（细菌的接种技术）（细菌的接种技术）接种方法：常用的有接种方法：常用的有斜面接种法斜面接种法、平板接种法平板接种法、液体接种法液体接种法、试管深、试管深层固体培养基的层固体培养基的穿刺接种法穿刺接种法。接种工具：常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种铲或接种工具：常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种铲或接种锄、玻璃涂棒等。接种锄、玻璃涂棒等。图632第32页，共38页，编辑于2022年，星期一实验程序实验程序2（细菌的接种技术（细菌的接种技术斜面接种法斜面接种法）左手平托两支试管，拇指压住两支试管。外侧左手平托两支试管，拇指压住两支试管。外侧是菌种试管，内侧是待接种的空白斜面是菌种试管，内侧是待接种的空白斜面(两支试两支试管的斜面同时向上管的斜面同时向上)。右手将棉塞旋松，以便。右手将棉塞旋松，以便在接种时容易拔出。在接种时容易拔出。右手拿接种环，在火焰上先将右手拿接种环，在火焰上先将环端环端烧红灭菌，烧红灭菌，然后然后将有可能伸入试管的其余部位将有可能伸入试管的其余部位也过火灭也过火灭菌。菌。将两支试管的上端并齐，靠近火焰，用右手小将两支试管的上端并齐，靠近火焰，用右手小指、无名指和手掌将两支试管的棉塞一并夹住拔指、无名指和手掌将两支试管的棉塞一并夹住拔出，出，棉塞仍夹在手中棉塞仍夹在手中，然后让试管口缓缓过火焰。，然后让试管口缓缓过火焰。12333第33页，共38页，编辑于2022年，星期一实验程序实验程序2（细菌的接种技术（细菌的接种技术斜面接种法斜面接种法）将已灼烧过的接种环伸入菌种试管内。将已灼烧过的接种环伸入菌种试管内。先冷却先冷却，而后再，而后再用环挑取少许菌种，将接种环抽出并迅速伸入待接种用环挑取少许菌种，将接种环抽出并迅速伸入待接种试管底部，在斜面上试管底部，在斜面上由底部向上划线由底部向上划线。抽出接种环，塞上。抽出接种环，塞上棉塞将试管插在试管架上，最后再次烧红接种环，则接种完棉塞将试管插在试管架上，最后再次烧红接种环，则接种完毕。毕。4567834第34页，共38页，编辑于2022年，星期一实验程序实验程序2（细菌的接种技术（细菌的接种技术液体接种和穿刺接种液体接种和穿刺接种）液体接种法液体接种法(从斜面菌种接入培养液从斜面菌种接入培养液)：用：用接种环接种环挑取斜面菌种送入挑取斜面菌种送入培养液中，使环在液体表面与管壁接触轻轻研磨，将环上的菌培养液中，使环在液体表面与管壁接触轻轻研磨，将环上的菌种全部洗入培养液中，取出接种环塞上棉塞。将试管轻轻撞击种全部洗入培养液中，取出接种环塞上棉塞。将试管轻轻撞击手掌使菌体在培养液中均匀分布。最后将接种环烧红灭菌。手掌使菌体在培养液中均匀分布。最后将接种环烧红灭菌。穿刺接种法穿刺接种法(从斜面菌种接入从斜面菌种接入(半半)固体培养基固体培养基)：用：用接种针接种针经火焰灭经火焰灭菌后，挑取少量菌种，垂直地穿入试管固体培养基中心至底部，菌后，挑取少量菌种，垂直地穿入试管固体培养基中心至底部，然后穿刺线缓慢将针抽出，塞上棉塞。烧红接种针灭菌，则接然后穿刺线缓慢将针抽出，塞上棉塞。烧红接种针灭菌，则接种完毕。种完毕。35第35页，共38页，编辑于2022年，星期一实验程序实验程序2（细菌的接种技术（细菌的接种技术稀释平板涂布法稀释平板涂布法）稀释样品：方法同稀释平板分离法稀释样品：方法同稀释平板分离法倒平板：将融化并冷至倒平板：将融化并冷至50左右的培养基倒入无菌培养皿中，冷左右的培养基倒入无菌培养皿中，冷凝后即成平板凝后即成平板用无菌移液管吸取一定量的经适当稀释的标志样品液于平板上，换上用无菌移液管吸取一定量的经适当稀释的标志样品液于平板上，换上无菌玻璃刮刀在平板上旋转涂布均匀无菌玻璃刮刀在平板上旋转涂布均匀将培养皿正摆在恒温箱中，调节一定温度进行培养。如果培养时间较长，将培养皿正摆在恒温箱中，调节一定温度进行培养。如果培养时间较长，次日把培养皿倒置继续培养，直至长出菌落。次日把培养皿倒置继续培养，直至长出菌落。36第36页，共38页，编辑于2022年，星期一实验程序实验程序2（细菌的接种技术）（细菌的接种技术）液体培养基中的菌种接入液体培养基中液体培养基中的菌种接入液体培养基中接种工具：无菌移液管和无菌滴管接种工具：无菌移液管和无菌滴管移液管和滴管不能在火焰上烧，应预先灭菌移液管和滴管不能在火焰上烧，应预先灭菌用无菌移液管自菌种管中吸取一定量的菌液接到另用无菌移液管自菌种管中吸取一定量的菌液接到另一管液体培养基中，将试管塞好棉塞即可。一管液体培养基中，将试管塞好棉塞即可。37第37页，共38页，编辑于2022年，星期一实实 验验 二二结结 束束38第38页，共38页，编辑于2022年，星期一