52《多聚酶链式反应扩增DNA片段》参考课件.ppt

课题课题2 2多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增DNADNA片断片断一、基础知识一、基础知识（一）（一）DNADNA分子的结构分子的结构C C、H H、O O、N N、P P1 1、组成元素、组成元素脱氧核苷酸脱氧核苷酸2 2、基本单位、基本单位3 3、脱氧核苷酸结构、脱氧核苷酸结构脱氧核脱氧核苷酸苷酸脱氧核苷脱氧核苷磷酸磷酸脱氧核糖脱氧核糖含氮含氮碱基碱基嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶腺嘌呤（腺嘌呤（A A）鸟嘌呤（鸟嘌呤（G G）胞嘧啶（胞嘧啶（C C）胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T T）一个核苷酸上的一个核苷酸上的磷酸基团上的磷酸基团上的“OHOH”和和另一个另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基之间失去一分子之间失去一分子水，形成水，形成磷酸二脂键，磷酸二脂键，即在即在相邻的相邻的两个脱氧核苷酸的两个脱氧核苷酸的3 3和和5 5碳原子碳原子之间形成磷酸二脂键。数量庞大的四之间形成磷酸二脂键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过种脱氧核苷酸通过3 3、5 5、磷酸二脂键彼此连接起、磷酸二脂键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。来形成脱氧核苷酸链。通常将通常将DNADNA的的羟基羟基“OHOH”末端末端称为称为3 3端，而磷酸基团的末端称为端，而磷酸基团的末端称为5 5端端4 4、多脱氧核苷酸链得形成、多脱氧核苷酸链得形成脱氧核苷酸结构式脱氧核苷酸结构式OOPOHO碱基碱基OOHOOPOHOOH碱基碱基5335碱基碱基碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖磷酸基团磷酸基团磷酸基团磷酸基团碱基碱基碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖碱基碱基碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖53多脱氧核苷酸链结构简图多脱氧核苷酸链结构简图5 5、DNADNA分子的双螺旋结构分子的双螺旋结构 DNA DNA分子是由两条反向平行的（即一条链为分子是由两条反向平行的（即一条链为3 35 5，另一条链为，另一条链为5 5 3 3）脱氧核苷酸长链）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则双螺旋结构盘旋而成的规则双螺旋结构 脱氧核糖与磷酸交替连结，排列在外侧，构脱氧核糖与磷酸交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；碱基排列在链的内侧成基本骨架；碱基排列在链的内侧 两条链上的碱基通过氢键连结起来，形成碱两条链上的碱基通过氢键连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤一定同胞嘧啶配对与胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤一定同胞嘧啶配对6 6、利用碱基互补配对规律的计算、利用碱基互补配对规律的计算 规律一：规律一：DNADNA双链中的两条互补链的碱基相等，任双链中的两条互补链的碱基相等，任意两个互补的碱基之和相等即意两个互补的碱基之和相等即A=TA=T，G=CG=C。任意两个不。任意两个不互补的碱基之和恒等，占碱基总数的互补的碱基之和恒等，占碱基总数的50%50%。即：。即：A+GA+GT+CT+CA+CA+CT+GT+G50%50%，（，（A+GA+G）/(T+C)/(T+C)(A+C)/(G+T)(A+C)/(G+T)(T+C)/(A+G)(T+C)/(A+G)1 1 规律二：在规律二：在DNADNA双链中的一条单链双链中的一条单链(A+G)/(T+C)(A+G)/(T+C)的的值与另一条互补链的值与另一条互补链的 (A+G)/(T+C)(A+G)/(T+C)的值互为倒数关系的值互为倒数关系 规律三：规律三：DNADNA双链中，一条单链的双链中，一条单链的(A+T)/(G+C)(A+T)/(G+C)的的值与另一条互补链的值与另一条互补链的(A+T)/(G+C)(A+T)/(G+C)的值是相等的，也与的值是相等的，也与整个整个DNADNA分子中的分子中的(A+T)/(G+C)(A+T)/(G+C)的值相等的值相等（二）（二）DNADNA分子的特性分子的特性1 1、稳定性、稳定性 在在DNADNA分子双螺旋结构的内侧，分子双螺旋结构的内侧，通过通过氢键氢键形形成的碱基对，使两条脱氧核苷酸长链稳固的并联成的碱基对，使两条脱氧核苷酸长链稳固的并联起来起来 例题：甲例题：甲DNADNA分子中，分子中，A A和和T T占占2525，G G和和C C占占75%75%，乙乙DNADNA分子中，分子中，G G和和C C占占2525，A A和和T T 占占75%75%，哪一个稳，哪一个稳定？定？答：甲答：甲DNADNA分子比乙分子比乙DNADNA分子稳定。因为分子稳定。因为A A与与T T之间之间形成两个氢键，形成两个氢键，在在G G和和C C之间形成三个氢键，之间形成三个氢键，三个氢键三个氢键比两个氢键稳定，所以在比两个氢键稳定，所以在DNADNA分子中含有较多的分子中含有较多的G GC C碱基对比含有较多的碱基对比含有较多的A AT T碱基稳定碱基稳定2 2、多样性、多样性 构成构成DNADNA分子的碱基对的数量不同，碱基对的排分子的碱基对的数量不同，碱基对的排列顺序千变万化列顺序千变万化 例题：如果有例题：如果有40004000个碱基对，碱基对有多少种排个碱基对，碱基对有多少种排列方式？列方式？答：碱基对排列方式有答：碱基对排列方式有4 440004000种种3 3、特异性、特异性 不同的不同的DNADNA分子由于碱基对的排列顺序存在差异，分子由于碱基对的排列顺序存在差异，因此每一个因此每一个DNADNA分子的碱基对都有其特定的排列顺序，分子的碱基对都有其特定的排列顺序，这种特定的排列顺序包含着特定的遗传信息，每一种这种特定的排列顺序包含着特定的遗传信息，每一种生物生物(A+T)/(G+C)(A+T)/(G+C)的比值是特定的的比值是特定的（三）（三）DNADNA的复制的复制2 2、时期、时期有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期3 3、场所、场所细胞核（主）、线粒体、叶绿体细胞核（主）、线粒体、叶绿体4 4、模板、模板DNADNA母链母链1 1、概念、概念由一个由一个DNADNA形成两个完全相同的形成两个完全相同的DNADNA的过程的过程5 5、原材料、原材料脱氧核苷酸脱氧核苷酸6 6、基本条件、基本条件酶、酶、ATPATP、原料、模板、原料、模板7 7、复制过程、复制过程 DNA DNA的解旋的解旋 亲代亲代DNADNA分子利用细胞提供的能量在解旋酶的分子利用细胞提供的能量在解旋酶的作用下氢键断裂，部分双螺旋链解旋为两条平行作用下氢键断裂，部分双螺旋链解旋为两条平行的双链的双链 RNA RNA引物的合成引物的合成 以单股以单股DNADNA为模板，在引物酶的作用下合成小段为模板，在引物酶的作用下合成小段的的RNARNA引物引物 DNA DNA的生成的生成 以单股的以单股的DNADNA为模板，在为模板，在DNADNA聚合酶的作用下，聚合酶的作用下，在在RNARNA引物的末端由引物的末端由5 5端端3 3端合成端合成DNADNA。切掉引物生成冈崎片断切掉引物生成冈崎片断 在核酸酶的作用下切掉引物。在在核酸酶的作用下切掉引物。在DNADNA聚合酶的作聚合酶的作用下将引物部位换上用下将引物部位换上DNADNA，此时的，此时的DNADNA片断称为冈崎片断称为冈崎片断片断 DNA DNA片断的连接片断的连接 在在DNADNA连接酶的作用下将冈崎片断连接起来。形连接酶的作用下将冈崎片断连接起来。形成一条完整的新的成一条完整的新的DNADNA链。新链与旧链构成新的链。新链与旧链构成新的DNADNA边解旋边复制边解旋边复制(过程）过程）8 8、复制特点、复制特点半保留复制（结果）半保留复制（结果）9 9、遵循原则、遵循原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则1010、精确复制的原因、精确复制的原因1111、复制的意义、复制的意义 DNA DNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性从而保持了遗传信息的连续性规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行 一条双链一条双链DNADNA分子，复制分子，复制N N次，形成的子代次，形成的子代DNADNA分子中，含亲代分子中，含亲代DNADNA母链的有两个母链的有两个DNADNA分子，占子代分子，占子代DNADNA总数的总数的2/22/2N N；亲代；亲代DNADNA分子母链两条，占子代分子母链两条，占子代DNADNA中脱氧核苷酸链总数的中脱氧核苷酸链总数的2/2 2/2 N+1N+1=1/2=1/2N N 设一条设一条DNADNA分子中有胸腺嘧啶为分子中有胸腺嘧啶为m m个，则该个，则该DNADNA复复制制n n次后，形成子代次后，形成子代DNADNA分子需游离的胸腺嘧啶为分子需游离的胸腺嘧啶为T=(2T=(2N N-1)m-1)m1212、DNADNA复制过程中的等量关系复制过程中的等量关系（四）（四）PCR(PCR(多聚酶链式反应）多聚酶链式反应）1 1、DNADNA聚合酶聚合酶特性特性 不能从头合成不能从头合成DNADNA，只能从，只能从DNADNA的的33端开始延伸端开始延伸DNADNA链，因此，链，因此，DNADNA复制需要引物复制需要引物2 2、DNADNA聚合酶聚合酶作用过程作用过程 当引物与当引物与DNADNA母链通过碱基互补配对结合后，母链通过碱基互补配对结合后，DNADNA聚合酶就能从引物的聚合酶就能从引物的33端开始延伸端开始延伸DNADNA链，链，DNADNA的合成方向总是从子链的的合成方向总是从子链的55端向端向33端延伸端延伸3 3、PCRPCR原理原理 在在8080100100C C的温度范围内，的温度范围内，DNADNA的双螺旋结的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性构将解体，双链分开，这个过程称为变性 当温度缓慢降低后，两条彼此分离的当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNADNA链又链又会重新结合成双链会重新结合成双链 PCR PCR利用了利用了DNADNA的热变性原理，通过控制温度的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCRPCR仪实质上仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器也是一台能够自动调控温度的仪器 高温解决了打开双链的问题，但是，又导致高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNADNA聚合酶失活的问题，耐高温的聚合酶失活的问题，耐高温的Taq DNATaq DNA聚合酶解聚合酶解决了高温导致决了高温导致DNADNA聚合酶失活的问题，促成了聚合酶失活的问题，促成了PCRPCR技技术的自动化术的自动化4 4、Taq DNATaq DNA聚合酶的应用聚合酶的应用5 5、缓冲液需要为缓冲液需要为PCRPCR反应提供的物质反应提供的物质 DNA DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNADNA聚合酶，同时通聚合酶，同时通过控制温度使过控制温度使DNADNA复制在体外反复进行复制在体外反复进行 PCR PCR技术是技术是8080年代中期发展起来的体外核酸扩增年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。技术。它具有特异、敏感、产率高、它具有特异、敏感、产率高、快速、快速、简便、简便、重复性好、易自动化等突出重复性好、易自动化等突出 6 6、PCRPCR技术的特点技术的特点7 7、细胞内和细胞外细胞内和细胞外DNADNA复制环境的区别复制环境的区别体内体内DNADNA的复制的复制体外的模拟体外的模拟模板（母链）模板（母链）细胞内源细胞内源外源加入外源加入引物引物引物合成酶引物合成酶外源加入外源加入底物底物dNTPdNTP细胞内源细胞内源外源加入外源加入聚合酶聚合酶细胞内源细胞内源外源加入外源加入反应环境反应环境细胞内环境细胞内环境缓冲液缓冲液 PCR PCR过程需要的引物不是过程需要的引物不是RNARNA，而是人工合成，而是人工合成的的DNADNA单链，其长度通常为单链，其长度通常为20203030个脱氧核苷酸个脱氧核苷酸8 8、细胞内复制和、细胞内复制和PCRPCR不同点不同点 PCR PCR过程中过程中DNADNA的解旋不依靠解旋酶，而是通的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的过对反应温度的控制来实现的（五）（五）PCRPCR的反应过程的反应过程1 1、PCRPCR的反应步骤的反应步骤 PCR PCR一般经历三十多次循环，一般经历三十多次循环，每次循环可以分为每次循环可以分为三个基本步骤三个基本步骤变性、复性和延伸变性、复性和延伸变性（模板变性（模板DNADNA解旋）解旋）模板模板DNADNA经加热至经加热至90900 0C C以上。一定时间后，使模以上。一定时间后，使模板板DNADNA双链或经双链或经PCRPCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNADNA解离，使成为解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备2 2、循环过程、循环过程靶序列靶序列靶序列靶序列PCR PCR 循环第一步循环第一步 ：加热变性：加热变性复性（退火）复性（退火）模板模板DNADNA经加热变性成单链后，温度降到经加热变性成单链后，温度降到50500 0C C左左右，引物与模板右，引物与模板DNADNA单链的互补序列配对结合单链的互补序列配对结合靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物 引物引物 5 53 35 55 53 35 53 33 3PCR PCR 循环第二步循环第二步 ：引物与靶序列退火：引物与靶序列退火延伸延伸 DNA DNA模板引物结合物在模板引物结合物在TaqDNATaqDNA聚合酶的作用下聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNADNA链链靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物引物引物5 53 35 55 53 35 53 33 3Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶PCR PCR 循环第三步循环第三步 ：引物延伸：引物延伸靶序列靶序列 靶序列靶序列第第1 1个个 PCR PCR 循环完成后循环完成后 ：得到两个拷贝的靶序列：得到两个拷贝的靶序列循环循环次数次数DNADNA数量数量1 12 22 24 43 38 820201,048,5761,048,57630301,073,741,8241,073,741,8243 3、3030次循环后靶序列扩增的数量次循环后靶序列扩增的数量4 4、PCR PCR 循环的结果循环的结果 DNA DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的之间的DNADNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增 从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物为模板参与反应，并且由引物延伸而成的延伸而成的DNADNA单链单链会与引物会与引物结合，进行结合，进行DNADNA的延伸的延伸二、二、PCR PCR 的实验操作的实验操作1 1、PCRPCR仪仪（一）设备及用具（一）设备及用具实质上一台能够实质上一台能够自动调控温度自动调控温度的仪器的仪器2 2、微量离心管、微量离心管一种一种薄壁塑料管薄壁塑料管，总容积为，总容积为0.5ml0.5ml3 3、微量移液器、微量移液器 用于用于定量转移定量转移PCRPCR配方中的配方中的液体，液体，其上的其上的一次性吸液枪头用一次更换一次一次性吸液枪头用一次更换一次PCRPCR仪仪微量离心管微量离心管微量移液器微量移液器1 1、准备、准备2 2、移液、移液（二）实验操作步骤（二）实验操作步骤 按照按照PCRPCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上在实验桌上 用微量移液器按照用微量移液器按照PCRPCR反应体系配方往微量反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂离心管里面加入各种试剂过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁击管壁注意：注意：3 3、混合、混合 B B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀使反应液混合均匀 A A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢落或液体外溢将离心管放入将离心管放入PCRPCR仪上，设置好仪上，设置好PCRPCR仪的循环程序仪的循环程序过程：将微量离心管放在离心机上过程：将微量离心管放在离心机上,离心约离心约10s10s4 4、离心、离心5 5、反应、反应离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果应效果循环数循环数变性变性复性复性延伸延伸第一次第一次949410min10min3030次次4430s30s555530s30s72721min1min最后一次最后一次441min1min555530s30s72721min1min PCR PCR技术技术高度灵敏，高度灵敏，为了避免外源为了避免外源DNADNA等因素的等因素的污染而造成干扰实验，污染而造成干扰实验，PCRPCR操作时要注意做到：操作时要注意做到：6 6、注意事项、注意事项 隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头（一）理论上（一）理论上DNADNA扩增数目的计算扩增数目的计算三、三、课题成果评价课题成果评价1 1、一条一条DNADNA，复制，复制n n次，次，DNADNA为为2 2 n n2 2、a a条条DNADNA，复制，复制n n次，次，DNADNA为为a x2 a x2 n n（二）实验中（二）实验中DNADNA含量的测定含量的测定1 1、原理、原理 可以通过计算可以通过计算DNADNA含量来评价扩增的效果，含量来评价扩增的效果，DNADNA在在260nm260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与小与DNADNA的含量有关的含量有关2 2、过程过程稀释稀释 2uLPCR 2uLPCR反应液，加入反应液，加入98uL98uL蒸馏水，即将样品蒸馏水，即将样品进行进行5050倍稀释倍稀释对照调零对照调零 以蒸馏水作为空白对照，在波长以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm260nm处，将紫处，将紫外分光光度计的读数调节至零外分光光度计的读数调节至零 取取DNADNA稀释液稀释液100uL100uL至比色杯中，测定至比色杯中，测定260nm260nm处的处的光吸收值光吸收值计算计算计算计算DNADNA含量（含量（g g）50 x(260nm50 x(260nm的读数）的读数）x x 稀释倍数稀释倍数5050：1 1 g g/ml/ml的的DNADNA在厚度为在厚度为1cm1cm比色杯中的吸光值为比色杯中的吸光值为0.020.02比色杯比色杯四、四、课题延伸课题延伸 例如：例如：PCRPCR产物每轮循环增加一倍，产物每轮循环增加一倍，3030轮循环轮循环扩增量达扩增量达2 23030个拷贝（个拷贝（10109 9拷贝）拷贝）PCR PCR技术是技术是8080年代中期发展起来的体外核酸扩增年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。技术。它具有特异、敏感、产率高、它具有特异、敏感、产率高、快速、快速、简便、简便、重复性好、易自动化等突出特点重复性好、易自动化等突出特点五、实验小结五、实验小结 PCRPCR仪仪加加热热使使（）变变性性,复复性性使使引引物物与与模模板板DNADNA（）,延延伸伸需需将将反反应应温温度度升升至至中中温温(),),在在（）的的作作用用下下,以以（）为为原原料料,以以（）为为复复制制的的起起点点,合合成成新新链链。如如此此重重复复改改变变反反应应温温度度,经经（）三三个个阶阶段段为为一一个个循循环环,每每一一次次循循环环使使特特异异区区段段的的基基因因拷拷贝贝数数放放大大一一倍倍,一一般般样样品品是是经经过过3030次次循循环环,最最终终使使基基因因放放大大了了数数百百万万倍倍;将将扩扩增增产产物物进进行行电电泳泳,经经溴溴化化乙乙锭锭染染色色,在在紫紫外外灯灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNADNA带。带。模板模板互补互补TaqTaq聚合酶聚合酶四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸引物引物变性、复性和延伸变性、复性和延伸7272