色谱分析讲座幻灯片.ppt

色谱分析讲座第1页，共101页，编辑于2022年，星期二一、概论一、概论俄国植物学家Tswett于1901年发现：利用吸附原理分离植物色素1903年发表文章：On a new category of adsorption phenomena and their application to biochemical analysis1906年Tswett 创立“chromatography”“色谱法”新名词1907年在德国生物会议上第一次向世界公开展示显现彩色环带的柱管（一）色谱分析法的历史（一）色谱分析法的历史第2页，共101页，编辑于2022年，星期二1930年R.Kuhn用色谱柱分离出胡萝卜素1935年Adams and Holmes 发明了苯酚-甲醛型离子交换树脂，进一步发明了离子色谱1938年Izmailov 发明薄层色谱1941年Martin&Synge 发明了液-液分配色谱1944年Consden,Gordon&Martin 发明纸色谱1952年Martin&Synge 发明气-液色谱1953年Janak发明气-固色谱1954年Ray发明热导检测器1957年Martin&Golay 发明毛细管色谱第3页，共101页，编辑于2022年，星期二1959年Porath&Flodin 发明凝胶色谱1960年液相色谱技术完善1954年我国研究成功第一台色谱仪（二）色谱方法的分类（二）色谱方法的分类定义：色谱分离技术是借助色谱分离原理而使混合物中各组分分离的技术；将色谱分离技术应用于分析化学，称为色谱分析。第4页，共101页，编辑于2022年，星期二色谱法的分类按物理状态分类根据流动相的物态：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)根据固定相的物态：气-固色谱法、气-液色谱法、液-固色谱法、液-液色谱法按使用的形式分类(1)柱色谱、(2)纸色谱、(3)薄层色谱按分离机理分类(1)吸附色谱、(2)分配色谱、(3)离子交换色谱、(4)凝胶色谱第5页，共101页，编辑于2022年，星期二3.色谱法的特点(1)高选择性、(2)高效能、(3)高灵敏度可以分析质量分数为10-610-9数量级、检出限量低至10-1l g的物质，适于微量和痕量分析、4.色谱法的应用(1)色谱分析广泛应用于极为复杂的混合物成分分析；(2)液相色谱法，在糖类、氨基酸、农药、染料、贵金属、有机金属化合物等方面得到了广泛的应用。(3)色谱分离是一种非常有效的提纯物质的技术，常用于制备分离，得到高纯样品。(4)色谱质谱联用仪已成为研究分子结构的重要手段。第6页，共101页，编辑于2022年，星期二二、气相色谱分析二、气相色谱分析Gas Chromatography,GCGas Chromatography,GC （一）气相色谱法的特点高效能填充柱都有几千块理论塔板毛细管柱可达104块105块理论塔板，可以分析沸点十分相近的组分和极为复杂的多组分混合物高选择性可分离同系物、同分异构化合物。第7页，共101页，编辑于2022年，星期二高灵敏度可以检测出10-11g10-13g物质痕量杂质分析：可以测出超纯气体、高分子单体、高纯试剂中质量分数为10-610-10数量级的杂质大气污染物分析：可以直接检出质量分数为10-9数量级的痕量毒物农药残留物的分析：可以检出农副产品、食品、水质中质量分数为10-610-9数量级的氯、硫、磷化合物分析速度快一般分析可在几分到几十分内可以完成，某些快速分析1s内可以分析数个组分。第8页，共101页，编辑于2022年，星期二 （二）气相色谱法的基本概念1色谱常用术语色谱图各组分的浓度随流出时间而分布的曲线称为色谱曲线，常称为色谱曲线图或色谱图。第9页，共101页，编辑于2022年，星期二基线没有试样进入检测器时，记录仪记录的是一条直线，这条直线称为基线。噪音：使基线发生细小的波动的现象基线是在实验操作条件下，反映检测器系统噪声随时间变化的曲线。色谱峰的高度、宽度、半峰宽度峰高(h)：峰高h指色谱峰最高点到基线的距离，一般用cm为单位。第10页，共101页，编辑于2022年，星期二峰宽(Y)与半峰宽Y1/2)从色谱峰两侧的转折点(拐点)作切线，在基线上的截距叫峰底宽(y)；简称峰宽；峰高一半处色谱峰的宽度叫半峰宽(y1/2)。由于色谱峰顶呈圆孤形，色谱峰的半峰宽并不等于峰底宽的一半。第11页，共101页，编辑于2022年，星期二例4.2.1 已知记录纸的速度是2.5cmmin-1，测得某色谱峰的峰底宽度为3.2cm，用时间表示的色谱峰宽度为多少?解：3.2cm(2.5cmmin-1)1.28min答：色谱峰的宽度为1.28min。保留值：表示被测组分从进样到色谱柱后出现浓度最大值所需要的时间(或所需载气的体积)，叫做保留值。第12页，共101页，编辑于2022年，星期二 保留时间(tR):是指被测组分从进样开始到柱后出现浓度最大值时所需的时间，=组分在流动相中停留的时间+在固定相中所停留的时间 调 整 保 留 时 间(tR)：组 分 的 保 留 时 间 与 死 时 间 的 差 值：tR=tR-t0它表示与固定相发生作用的组分比载气在色谱柱中多滞留的时间，实际上是组分在固定相中所滞留的时间。第13页，共101页，编辑于2022年，星期二 保留体积（VR）：从进样开始到柱后出现浓度最大值所需要的载气体积 VR=F0tR 调整保留体积（VR）：指扣除死体积后的保留体积VR=t0F0 死体积（V0）：不与固定相作用的组分从进样到柱后出现浓度最大值所需要的载气体积。若载气的体积流速为F0，则死体积为V0=F0t0第14页，共101页，编辑于2022年，星期二相对保留值()表示组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比：2.分配系数与分配比定义：组分在固定相和流动相之间发生的吸附与脱附或者溶解与挥发的过程叫分配过程。值越大，两组分的色谱峰相距越远，分离得越好第15页，共101页，编辑于2022年，星期二分配系数(K):当组分在流动相和固定相两相中达到分配平衡时，组分在两相中的浓度之比，称为分配系数(K)：K溶解度或吸附能力，组分在固定相中的量，在气相中的量。K进入固定相的组分，组分在固定相中滞留的时间越长，流出色谱柱所需的时间也就越长。组分在固定相中的质量浓度(gmL-1)组分在流动相中的质量浓度(gmL-1)第16页，共101页，编辑于2022年，星期二 分配比(k)定义：分配比是在一定温度、压力下，组分在两相间达到分配平衡时，两相间组分的质量比：k=ms/mm分配比又称为容量因子或容量比分配比k的大小由下式计算：k=tR/t0通过实验来测定分配比k的数值k值越大，保留时间越长。k=0的组分，其保留时间即为死时间。第17页，共101页，编辑于2022年，星期二分配系数与分配比的关系相比：表示流动相体积与固定相体积之比第18页，共101页，编辑于2022年，星期二（三）气相色谱法的基本理论1.塔板理论假设：将一根色谱柱视为一个精馏塔色谱柱是由一系列连续的、水平的塔板构成每一块塔板的高度为H组分气体以脉冲的方式进入塔板组分在每一块塔板上迅速达到分配平衡分配系数在各塔板上是常数气体的纵向扩散可以忽略不计第19页，共101页，编辑于2022年，星期二色谱峰的形状理论上：应得到正态分布的平滑曲线第20页，共101页，编辑于2022年，星期二混合组分的分离第21页，共101页，编辑于2022年，星期二色谱柱的柱效能塔板高度：H=L/n理论塔板数色谱柱长同长度的色谱柱塔板数越多，塔板高度H越小，分离效果越好。色谱柱的理论塔板数按下式计算：第22页，共101页，编辑于2022年，星期二保留时间越长，Y或Y1/2越小，色谱峰越窄，理论塔板数越多，组分在两相间达到分配平衡的次数也越多，分离能力越强，柱效也就越高。例4.2.2 某色谱柱长2.1m，测得某组分的保留时间为5min42s，在色谱纸上量得色谱峰的宽度为1.2cm，已知纸速为2cmmin-1，求塔板高度。解：将色谱峰的宽度换算成时间：第23页，共101页，编辑于2022年，星期二答：塔板高度为1.45cm。第24页，共101页，编辑于2022年，星期二有效塔板数：使用调整保留时间tR计算塔板数：有效塔板数扣除了死时间的影响，较为真实地反映了柱效能的好坏。塔板理论的优点：理论直观，能解释流出曲线的形状和浓度极大点(色谱峰)的位置，应用广泛。缺点：理论建立在几点假设之上，不能解释塔板高度量受哪些因素的影响，也不能指出降低塔板高度的途径。第25页，共101页，编辑于2022年，星期二2.速率理论范第姆特方程式：H=A+B/U+CU式中：U为流动相平均线速度，A为涡流扩散项，B/U为分子扩散项，CU为传质阻力项。减少A，B/U，CU三项的值，可以降低塔板高度量，减少色谱峰的扩张，提高柱效。涡流扩散项(A)：A 的大小，与填充物的平均颗粒直径dp(单位为cm)有关，也与固定相填充不均匀因子有关：第26页，共101页，编辑于2022年，星期二分子扩散项(B/U)试样分子沿色谱柱纵的方向扩散，系数B的大小与气体路径弯曲因子和组分在气体中的扩散系数Dg(单位为cm2.s-1)有关：毛细管柱：=1填充柱：1第27页，共101页，编辑于2022年，星期二传质阻力项(CU)定义：被测组分由于浓度不均匀而发生物质迁移过程，称为传质过程。C 称为传质阻力系数。传质过程分为：气相传质过程与液相传质过程传质阻力系数C等于气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数Cl之和：C=Cg+C1第28页，共101页，编辑于2022年，星期二A，B/U，CU越小，色谱柱的塔板高度H 越小，柱效率越高。改善柱效率的因素：选择颗粒较小的均匀填料选用较低的柱温操作降低担体表面液层的厚度选用合适的载气及载气流速：流速较小时，分子扩散项成为色谱峰扩张的主要因素，宜用相对分子质量较大的载气；流速较大时，传质项为控制因素，宜用相对分子质量较小的载气。总结：范第姆特方程H=A+B/U+CU第29页，共101页，编辑于2022年，星期二（四）色谱分离条件的选择1.分离度和影响分离的因素分离度R及的计算定义：两相邻组分保留时间之差与两峰底宽度和之半的比值：色谱柱的选择性越强，两组分的色谱峰相距越远；柱效能越高，色谱峰越窄。第30页，共101页，编辑于2022年，星期二R1时，分离程度为98.7%R1.5时，分离程度可达99.7%R1.5作为完全分开的标志若两组分分离效果较差，可用半峰宽(Y1/2)代替峰底宽(Y)计算分离度：第31页，共101页，编辑于2022年，星期二色谱分离基本方程式由上式可知：(1)增加塔板数可以提高分离度(2)k值的最佳范围是：1k10(3)相对保留值增大，能显著地提高分离度两根同种色谱柱的相互关系式：第32页，共101页，编辑于2022年，星期二例4.2.3 如果柱长L2为1m时，分离度及为0.8，要实现完全分离(R1.5)，色谱柱Ll至少应有多长?答：色谱柱至少应有3.52m长。例4.2.4 用3m长的填充 柱得到如图4.2.6所示的色谱流出曲线，为了得到R1.5的分辨率，填充柱最短需要多少米?第33页，共101页，编辑于2022年，星期二塔板高度为：代入公式，得：解：第34页，共101页，编辑于2022年，星期二2.分离条件的选择载气及其最佳流速的选择 载气的选择 热导池检测器常用氢气、氦气作载气 氢火焰检测器宜用氮气作载载气流速的选择范第姆特方程式H=A+B/U+CU中，A，B，C与载气线速度无关。载气的最佳流速：第35页，共101页，编辑于2022年，星期二柱温的选择柱温改变时，柱效率、分离度R、选择性及色谱柱的稳定性都将产生相应的改变。汽化温度的选择 比汽化室高3070或：比试样组分中最高的沸点高3050进样时间和进样量 在0.1s内把试样样进完 液体进样量为0.1L5L 气体进样量为0.1mL5mL第36页，共101页，编辑于2022年，星期二（五）固定相及其选择1气固色谱固定相吸附物理化学过程吸附剂分类：(1)非极性吸附剂：如活性炭，适用于低沸点的碳氢化合物的分析。(2)弱极性吸附剂：如氧化铝吸附剂，适用于分析C1C4烃类及异构体。(3)强极性吸附剂：如分子筛，适于分析N2，O2，CO，H2等气体和正异构烷烃。(4)氢键型吸附剂：如硅胶吸附剂，适用于分析有氢键或极性的化合物。第37页，共101页，编辑于2022年，星期二2.气-液色谱固定相气-液色谱的优点：(1)固定液的品种繁多，可选择范围大；(2)固定液的用量可以任意变化；可以根据需要选用合适的固定液用量，以改善分离效果；(3)气-液色谱在通常操作条件下有良好的对称峰；寿命长。担体担体的作用是提供一个很大的惰性表面，使固定液以薄膜状态分布在其表面上有白色硅藻土担体和红色硅藻土担体两类第38页，共101页，编辑于2022年，星期二担体的选择的基本原则(1)固定液用量在5%以上的，采用硅藻土型担体；固定液用量在5%以下的，采用表面处理过的担体。(2)高沸点组分的分离，由于控制的柱温(色谱柱温度)较高，使用玻璃微球作担体。(3)对高腐蚀性的组分，应选用抗腐蚀性强的聚四氮乙烯担体(氟担体)。担体的粒度常选用60目80目或80目100目，高效柱可选用100目120目。固定液对固定液的要求：(1)难以挥发，热稳定性好。在工作柱温下，固定液粘度小，能均布在担体表面上形成液膜。第39页，共101页，编辑于2022年，星期二(3)对被测组分有一定的溶解度且有较高的选择性。化学稳定性好，在操作条件下，固定液不与载气、担体、被测组分发生不可逆的化学反应。固定液的分类主要是按固定液的极性分级：“0”级非极性固定液“+1”与“+2”级弱极性固定液“+3”级中等极性固定液“+4”与“+5”级强极性固定液第40页，共101页，编辑于2022年，星期二固定液的选择原则：(1)非极性试样，用非极性固定液；(2)极性试样，使用极性固定液；(3)极性与非极性的混合物，一般选用极性固定液；(4)能形成氢键的试样，选用极性或形成氢键的固定液；(5)复杂的多组分混合试样，常用两种或两种以上的混合固定液。第41页，共101页，编辑于2022年，星期二（六）气相色谱仪1.气相色谱议的基本部件与作用气相色谱仪的工作过程气相色谱仪分为：载气系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统共五个主要组成部分第42页，共101页，编辑于2022年，星期二进样系统第43页，共101页，编辑于2022年，星期二2.气相色谱检测器气相色谱检测器可分为浓度型检测器与质量型检测器：浓度型检测器的响应值和组分的浓度成正比，质量型检测器的响应值和单位时间内进入检测器的质量成正比。常用的浓度型检测器有：热导池检测器(TCD)、电子捕获检测器(ECD)常用的质量型检测器有：氢火焰电离检测器(FID)、火焰光度检测器(FPD)第44页，共101页，编辑于2022年，星期二热导池检测器的结构及测量原理热导检测器的依据是组分和载气分别具有不同的热导系数，它的特点是结构简单，稳定性好，操作容易，灵敏度适中，对无机试样和有机试样都能响应，是应用最广泛、最成熟的一种通用型检测器。第45页，共101页，编辑于2022年，星期二氢火焰检测器的结构原理特点：灵敏度比热导池检测器高出三个数量级，具有结构简单、灵敏度高、响应速度快、应用广泛，适宜于痕量分析。离子化机理：有机物在氢火焰中发生化学电离火焰中的正离子以H3O+最多，约占90%；其他还有CHO+，CH3O+，C3H+等。对在氢火焰中不电离的无机化合物，例如CO，CO2，SO2，N2等，不能进行检测。第46页，共101页，编辑于2022年，星期二3.检测器的性能指标气相色谱分析对检测器的要求:测量准确，响应快，稳定性好，灵敏度高，适应范围广。衡量检测器性能的主要指标:灵敏度、检测限和检测器的线性范围。灵敏度以响应信号R对进样量Q作图，得到一条通过原点的直线，其斜率为：第47页，共101页，编辑于2022年，星期二(2)对于质量型检测器(1)对于浓度型检测器质量型检测器的灵敏度与载气的流速无关第48页，共101页，编辑于2022年，星期二检测限(敏感度)检测限D定义为某组分的峰高(mV)恰为噪音的2倍时，单位体积(或时间)引入检测器的试样量。浓度型检测器质量型检测器检测限D越小，说明噪音越小，检测器的灵敏度越高，所需的试样量越少。第49页，共101页，编辑于2022年，星期二例4.2.6 为到定氢焰检测器的灵敏度，注入含苯0.05%(体积分数)的CS2 溶液1L，苯的色谱峰高为10cm，半峰宽为0.5cm，记录纸速为1cm.min-1，记 录纸的灵敏度为0.2mV.cm-1，检测器噪音为0.02mV。计算该检测器的灵敏度和检测限。解：氢焰检测器为质量型检测器，因此应用公式：常温下，苯和CS2均为液体，查得液体苯的密度为0.879gmL-1=879mgmL-1，苯的质量为：第50页，共101页，编辑于2022年，星期二检测器的线性范围：最大检测量与最小检测量之比如检测上限为b=10-1，检测下限为a=10-8，检测器的线性范围为：检测器的线性范围越宽，越能适应不同浓度范围分析的需要，越有利于准确定量。（七）气相色谱分析1.气相相色谱的定性方法依据：利用色谱图确定各色谱峰所代表的化合物。常用的方法：纯物质对照定性、利用保留值定性、利用检测器的选择性定性等。第51页，共101页，编辑于2022年，星期二根据色谱保留值进行定性分析各种物质在一定的条件下(固定相、操作条件)，均有确定不变的保留值利用已知成分的纯物质与未知试样的色谱峰对照进行定性分析利用保留值定性 当已知某试样推测为某化合物(例如已用其他方法确定)时，用相应化合物的纯物质进行比较，有相同的峰形和保留值的则为同一种化合物。特点：气相色谱定性最可靠的方法混合物中丙醇的定性：在同一色谱柱中，注入色谱纯丙醇 第52页，共101页，编辑于2022年，星期二注意：如果保留时间相同，峰形不同，仍不能认为是同一种物质时，将试样与纯物质混合后注入色谱柱，若色谱峰增高而半峰宽并不相应增加，则两者可能是同一种物质。缺点：重复性较差利用相对保留值定性定义：相对保留值是组分i与基准物S的调整保留值之比：优点：可以消除某些操作条件的影响，只要柱温、固定相不变，即使柱径、柱长、填充情况及流动相的流速有所变化，相对保留值仍然不变，它是色谱定性分析的重要参数。第53页，共101页，编辑于2022年，星期二利用检测器的选择性进行定性分析热导池检测器(FCD)：对有机化合物和无机化合物均有响应，但灵敏度较低；氢焰检测器(FID)：对有机化合物灵敏度高，对无机气体、水分等响应很小；电子捕获检测器(ECD)：对卤素、氧、氯等电负性强的组分有很高的灵敏度，对不含卤素、氧、氮等电负性强的组分灵敏度很低，甚至不产生响应；火焰光度检测器(FPD)：只对含S，P的物质有信号。利用检测器定性，可以大致判断被测物的类型。第54页，共101页，编辑于2022年，星期二2.气相色谱定量方法依依据据：在一定的条件下，被测组分i的质量mi或其在载气中的浓度与检测器的响应信号(色谱上表现为峰面积Ai或峰高Hi)成正比：色谱峰面积测量方法峰高乘半峰宽法峰高乘平均峰宽法在峰高0.15处与峰高0.85处测量峰的宽度，然后取平均值，乘以峰的高度：第55页，共101页，编辑于2022年，星期二定量校正因子定量校正因子原因：为了使检测器的响应信号能真实地反映物质的含量，就要对色谱峰面积进行校正，因此引入定量校正因子。物理意义是每单位峰面积所代表物质的多少 绝对校正因子在一定的操作条件下，组分i的进样量m与峰的面积Ai成正比：绝对校正因子第56页，共101页，编辑于2022年，星期二进样量：质量m、摩尔n、体积V例4.2.7 某试样合有5g乙醇，测得相应的色谱峰面积为150mm2，求乙醇的fi。解：答：乙酵的绝对校正因子fi为3.310-2gmm-2。即每平方毫米色谱峰面积代表3.310-2g乙醇。第57页，共101页，编辑于2022年，星期二绝绝对对校校正正因因子子fifi的的大大小小主主要要由由操操作作条条件件和和仪仪器器的的灵灵敏敏度度所所决决定定，既既不不容容易易准准确确测测量量，也也无无统统一一标标准准；当当操操作作条条件件波波动动时时，fifi也也发发生生变变化化。故故fifi无无法法直直接接应用，定量分析时，一般采用相对校正因子。应用，定量分析时，一般采用相对校正因子。相对校正因子定义：规定某一个组分为标准物，计算其他组分的绝对校正因子与此标准物绝对校正因子的比值。第58页，共101页，编辑于2022年，星期二例4.2.8 准确称取一定质量的色谱纯对二甲苯、甲苯、苯及仲丁醇，混合后稀释，采用氢焰检测器，定量进样并测量各物质所对应的峰面积，数据如下：物质 苯 仲丁醇 甲苯 对二甲苯 m/g 0.4720 0.6325 0.8149 0.4547 A/cm2 2.60 3.40 4.10 2.20以仲丁醇为标准，计算各物质的相对质量校正因子。第59页，共101页，编辑于2022年，星期二法1：法2：同理：第60页，共101页，编辑于2022年，星期二相对响应值(相对灵敏度)物质i与标准物质S的响应值(灵敏度)之比。当单位相同时，它与相对校正因子互为倒数。相相对对响响应应值值和和相相对对校校正正因因子子只只与与试试样样、标标准准物物质质以以及及检检测测器器类类型型有有关关，与与操操作作条条件件、柱柱温温、载载气气流流速速、固固定定液液浓浓度度及及载载气气的的性性质质等因素无关，因而是能够通用的常数。等因素无关，因而是能够通用的常数。第61页，共101页，编辑于2022年，星期二定量计算方法归一化法、内标法、内标标准曲线法、外标法等归一化法设有几个组分，每个组分的质量分别为m1,m2,m3，测得色谱峰的面积分别为：A1，A2，A3，。各组分的绝对校正因子为：设以第二个组分为标准物，则各组分的相对校正因子为：第62页，共101页，编辑于2022年，星期二各组分的质量分数为：各组分的质量分数之和等于1，即：优点：归一化法很直观，容易接受，计算简便、准确，当操作条件如进样量、流速等发生变化时，对计算结果的影响很小，是一种常用的计算方法。缺点是：必需所有组分都出峰。第63页，共101页，编辑于2022年，星期二内标法当只需测定试样中某几个组分，或试样中所有组分不可能全部出峰时，可采用内标法。内标法是将一定质量的纯物质(非被测组分的纯物质)作为内标物，加入到准确称取的试样中，根据被测物质和内标物的质量及其在色谱图上相应峰面积之比，求出被测组分的质量分数。第64页，共101页，编辑于2022年，星期二设样品的质量为m，则待测组分i的质量分数为选择内标物应遵循的原则：试样中不存在的纯物质，否则会使色谱峰重叠而无法准确测定试样的色谱峰面积；内标物的物理及物理化学性质应与被测物相近，当操作条件发生变化时，内标物与被测物均受到相应的影响两者相对校正因子基本不变；色谱峰位于被测物色谱峰的附近，且能与被测物色谱峰完全分离；内标物的浓度应与被测物的浓度相近。第65页，共101页，编辑于2022年，星期二例4.2.9 取二甲苯生产母液1500mg，母液中合有乙苯、对二甲苯、邻二甲苯、间二甲苯及溶剂和少量苯甲酸，其中苯甲酸不能出峰。以150mg壬烷作内标物，测得有关数据如下：物质 壬烷 乙苯 对二甲苯 间二甲苯 邻二甲苯 Ai/cm2 98 70 95 120 80 fm 1.02 0.97 1.00 0.96 0.98求各组分的含量。解：母液中苯甲酸不能出峰，所以只能用内标法计算。由各组分的绝对校正因子计算得壬烷、乙苯、对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯的相对校正因子分别为1.00，0.95，0.98，0.94，0.96。根据内标法计算公式，对于乙苯有：同样可以计算出对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯的质量分数分别为9.5%，11.5%，7.84%。第66页，共101页，编辑于2022年，星期二内标法的优点：不要求各组分全部出峰，无归一化法的限制，即只要被测组分能出峰，不和其他峰重叠，不管其他组分是否出峰或是否重叠，都可以用内标法进行定量分析，而且定量准确，受操作条件影响较小。缺点：选用合适的内标物较为困难，每次都要淮确称量样品和内标物的量，不宜作快速分析。第67页，共101页，编辑于2022年，星期二内标标准曲线法从内标公式可知：如果每次称取同样量(m)的试样，每次加入相等量(ms)的内标物，则上式中m，ms均为常数，计算公式可写为：第68页，共101页，编辑于2022年，星期二三、高效液相色谱分析High Performence Liquid Chro-matography,HPLC气相色谱法适用于分析相对分子质量较小、沸点较低、热稳定性好的物质，这些物质约占有机化合物总数的25%30%。对于稳定性差、相对分子质量大(400以上)、沸点高的物质，宜用高效液相色谱法进行分析。高效液相色谱法是用液体作为流动相的色谱法。第69页，共101页，编辑于2022年，星期二现代高效液相色谱法具有下列特点：(1)高压：液相色谱法使用液体作为流动相(简称载液)，液体流过色谱柱时，所遇到的阻力很大，为了使载液迅速通过色谱柱，必须对载液施加高压。高效液相色谱法工作压力高达20MPa30MPa。(2)高速：高效液相色谱法的分析时间较经典的液相色谱所需的时间要少得多，分离一个样品只需几分钟至几十分钟，仅为经典液相色谱的几十分之一。(3)高效：一般气相色谱法的色谱往是数千塔板米，高效液相色谱法的塔板数可达约3万塔板/米，使分离效率大大提高。第70页，共101页，编辑于2022年，星期二三、高效液相色谱分析High Performence Liquid Chro-matography,HPLC气相色谱法适用于分析相对分子质量较小、沸点较低、热稳定性好的物质，这些物质约占有机化合物总数的25%30%。对于稳定性差、相对分子质量大(400以上)、沸点高的物质，宜用高效液相色谱法进行分析。高效液相色谱法是用液体作为流动相的色谱法。第71页，共101页，编辑于2022年，星期二现代高效液相色谱法的特点：三高(1)高压：高效液相色谱法工作压力高达20MPa30MPa。(2)高速：分离一个样品只需几分钟至几十分钟，仅为经典液相色谱的几十分之一。(3)高效：一般气相色谱法的色谱往是数千塔板米，高效液相色谱法的塔板数可达约3万塔板/米，使分离效率大大提高。(4)高灵敏度：紫外光度检测器的检测限可达109g，荧光检测器的灵敏度可达1011g。第72页，共101页，编辑于2022年，星期二五个部分：高压输液系统、进样系统、色谱柱、检测系统、记录仪。（一）高效液相色谱仪第73页，共101页，编辑于2022年，星期二 1.高压输液系统 高压输液系统由贮液器、高压泵、梯度洗提装置组成，核心部分是高压泵。贮液器及流动相 高效液相色谱的流动相应满足如列要求：(1)应具有足够的纯度，一般选用色谱纯试剂。(2)流动相与固定液应互不相溶。(3)流动相对试样各组分应有适当的溶解度。(4)粘度小。(5)检测器对流动相不产生响应。第74页，共101页，编辑于2022年，星期二梯度洗提装置应用梯度洗提，可以提高分离效果。梯度洗提法：在分离的过程中，应用梯度洗提装置，按一定的程序改变两种或两种以上不同极性的溶剂之间的比例，使流动相的成分和极性产生相应的变化，从而改变复杂物质中不同极性的组分的相对保留值，提高分离效果，加快分析速度。第75页，共101页，编辑于2022年，星期二高压泵 高效液相色谱仪的重要组成部分，应具备如下性能（1）有足够的输出压力，使流动相能顺利地通过颗粒很细的色谱柱，通常在14.7MPa44MPa之间；（2）输出流量恒定无脉动，其流量精度在1%2%之间；（3）输出流动相的流量范围广且流速可调，对分析仪器，一般为3mL/min；制备仪器为1020mL/min。（4）压力平稳，脉动小。第76页，共101页，编辑于2022年，星期二2.进样装置注射器进样装置优点：可以任意改变进样体积，注射快速，不易造成峰扩张缺点：重现性较差，试液容易渗漏高压定量进样阀(六通阀)由阀芯、阀体、定量管组成。优点：进样量的可变范围大，耐高压，易于自动化缺点：容易造成色谱峰扩张第77页，共101页，编辑于2022年，星期二3.色谱柱常用内壁抛光过的不锈钢制成标准柱型：内径为4.6mm或3.9mm，长为15cm30cm的直形不锈钢柱。液相色谱填充柱的填充方法：干法和湿法两种颗粒直径大于20m的可用干法填充颗粒直径10m以下的采用湿法装柱湿法装柱每米柱效可达3万塔板第78页，共101页，编辑于2022年，星期二4.检测器应具有：灵敏度高、噪音低、线性范围宽、定量准确、适应范围广等特点，同时还应该对温度和载液流速的变化不敏感。v可用的检测器有：紫外、折光、电导、荧光、极谱等v常用的检测器有：紫外-可见光度检测器和差示折光检测器紫外-可见光度检测器一种小型的装有流动池的双光束光度计紫外-可见光度检测器灵敏度很高，检测限可达10-9gmL-1优点：这种检测器对温度和流速不敏感，适宜于梯度洗提缺点：不能用于对紫外-可见光完全不吸收的试样的检测第79页，共101页，编辑于2022年，星期二差示折光检测器 一种浓度型检测器，是通过连续测定测量池中溶液折射率的变化来测定组分的浓度。优点：凡与流动相折射率不同的组分，都可以用差示折光检测器来检测，所以差示折光检测器是一种通用型检测器。差示折光检测器的灵敏度可达10-7gmL-1。缺点：对温度和流速的波动很敏感。第80页，共101页，编辑于2022年，星期二5.记录仪 计算机，峰面积的积分、分析结果的计算、误差的分析或色谱图的输出记录的信号进行程序化、自动化处理。q液-固色谱法q液液色谱法q离子交换色谱法q凝胶色谱法（二）高效液相色谱法的分类及其分离原理第81页，共101页，编辑于2022年，星期二1.液-固色谱法（液-固吸附色谱法）固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的。液-固色谱法的作用机制吸附剂：一些多孔的固体颗粒物质，其表面常存在分散的吸附中心点。流动相中的溶质分子X(液相)被流动相S带入色谱柱后，在随载液流动的过程中，发生如下交换反应：X(液相)+nS(吸附)X(吸附)+nS(液相)其作用机制是溶质分子X(液相)和溶剂分子S(液相)对吸附剂活性表面的竞争吸附。第82页，共101页，编辑于2022年，星期二吸附反应的平衡常数K为：K值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附的溶质分子很少，先流出色谱柱。K值较大：表示该组分分子的吸附能力较强，后流出色谱柱。发生在吸附剂表面上的吸附-解吸平衡，就是液-固色谱分离的基础。第83页，共101页，编辑于2022年，星期二液-固色谱法的吸附剂和流动相 常用的液-固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等。一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂(如硅胶、氧化铜)之间的作用力很弱，分配比k较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强，分配比k大，保留时间长。第84页，共101页，编辑于2022年，星期二对流动相的基本要求：v试样要能够溶于流动相中v流动相粘度较小v流动相不能影响试样的检测常用的流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。第85页，共101页，编辑于2022年，星期二液-固色谱法的应用常用于分离极性不同的化合物、含有不同类型或不；数量官能团的有机化合物，以及有机化合物的不同的异构体；但液-固色谱法不宜用于分离同系物，因为液-固色谱对不同相对分子质量的同系物选择性不高。2.液-液色谱法（液-液分配色谱法）将液体固定液涂渍在担体上作为固定相第86页，共101页，编辑于2022年，星期二液-液色谱法的作用机制 溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离的目的。液-液色谱法与液-液萃取法的基本原理相同，均服从分配定律：K值大的组分，保留时间长，后流出色谱柱。第87页，共101页，编辑于2022年，星期二正相色谱和反相色谱正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂(如苯、正己烷等)作流动相反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂(如水、甲醇、己腈等)作流动相一般地，正相色谱是固定液的极性大于流动相的极性，而反相色谱是固定相的极性小于流动相的极性。正相色谱适宜于分离极性化合物，反相色谱则适宜于分离非极性或弱极性化合物。第88页，共101页，编辑于2022年，星期二液-液色谱法的固定相常用的固定液为有机液体，如极性的，氧二丙腈(ODPN)，非极性的十八烷(ODS)和异二十烷(SQ)等。缺点：涂渍固定液容易被流动相冲掉采用化学键合固定相则可以避免上述缺点使固定浓与担体之间形成化学键，例如在硅胶表面利用硅烷化反应：形成SiOSiC型键，把固定液的分子结合到担体表面上第89页，共101页，编辑于2022年，星期二优点：v化学键合固定相无液坑，液层薄，传质速度快，无固定液的流失v固定液上可以结合不同的官能团，改善分离效能v固定液不会溶于流动相，有利于进行梯度洗提液-液色谱法的应用液-液色谱法既能分离极性化合物，又能分离非极性化合物，如烷烃、烯烃、芳烃、稠环、染料、留族等化合物。化合物中取代基的数目或性质不同，或化合物的相对分子质量不同，均可以用液-液色谱进行分离。第90页，共101页，编辑于2022年，星期二3.离子交换色谱法原理：离子交换色谱法是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的被测离子进行可逆交换，由于被测离子在交换剂上具有不同的亲和力(作用力)而被分离。第91页，共101页，编辑于2022年，星期二离子交换色谱法的作用机制聚合物的分子骨架上连接着活性基团，如SO3，N(CH3)3+等。为了保持离子交换树脂的电中性，活性基团上带有电荷数相同但正、负号相反的离子X，称为反离子。活性基团上的反离子可以与流动相中具有相同电荷的被测离子发生交换：K值越大，保留时间越长离子交换色谱的分配过程是交换与洗脱过程。交换达到平衡时：第92页，共101页，编辑于2022年，星期二溶剂和固定相 两种类型：多孔性树脂与薄壳型树脂多孔性树脂：极小的球型离子交换树脂，能分离复杂样品，进样量较大；缺点是机械强度不高，不能耐受压力。薄壳型离子交换树脂：在玻璃微球上涂以薄层的离子交换树脂，这种树脂柱效高，当流动相成分发生变化时，不会膨胀或压缩；缺点是但柱子容量小，进样量不宜太多。第93页，共101页，编辑于2022年，星期二离子交换色谱法的应用 主要用来分离离子或可离解的化合物，凡是在流动相中能够电离的物质都可以用离子交换色谱法进行分离。广泛地应用于：无机离子、有机化合物和生物物质(如氨基酸、核酸、蛋白质等)的分离。4.凝肤色谱法（空间排阻色谱法）凝胶是一种多孔性的高分子聚合体，表面布满孔隙，能被流动相浸润，吸附性很小。凝胶色谱法的分离机制是根据分子的体积大小和形状不同而达到分离目的。第94页，共101页，编辑于2022年，星期二凝胶色谱法的作用机制体积大于凝胶孔隙的分子，由于不能进入孔隙而被排阻，直接从表面流过，先流出色谱柱；小分子可以渗入大大小小的凝胶孔隙中而完全不受排阻，然后又从孔隙中出来随载液流动，后流出色谱柱；中等体积的分子可以渗入较大的孔隙中，但受到较小孔隙的排阻，介乎上述两种情况之间。凝胶色谱法是一种按分子尺寸大小的顺序进行分离的一种色谱分析方法。第95页，共101页，编辑于2022年，星期二凝胶色谱法的固定相软质凝胶、半硬质凝胶和硬质凝胶三种。凝胶色谱法的应用特点 保留时间是分子尺寸的函数，适宜于分离相对分子质量大的化合物，相对分子质量在4008105的任何类型的化合物保留时间短，色谱峰窄，容易检测固定相与溶质分子间的作用力极弱，趁于零，柱的寿命长不能分辨分子大小相近的化合物，分子量相差需在10%以上时才能得到分离第96页，共101页，编辑于2022年，星期二（三）高效