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药物分析第八章第1页，共130页，编辑于2022年，星期二第一节第一节 无菌检查无菌检查uu无菌技术指在整个微生物检验过程中，控无菌技术指在整个微生物检验过程中，控制微生物污染的一系列操作方法和措施制微生物污染的一系列操作方法和措施 。包括包括紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法无菌实验器材无菌实验器材无菌环境无菌环境无菌操作无菌操作第2页，共130页，编辑于2022年，星期二1 1、无菌环境、无菌环境 （1 1）定义）定义用各种方法控制实验空间内微生物数量，使其达用各种方法控制实验空间内微生物数量，使其达到无菌要求。到无菌要求。（2 2）净化工作台净化工作台包括包括无菌实验室无菌实验室无菌柜无菌柜第3页，共130页，编辑于2022年，星期二2 2、无菌实验器材、无菌实验器材包括包括灭菌器材灭菌器材消毒器材消毒器材玻璃器皿、接种玻璃器皿、接种针、注射器、试针、注射器、试管、培养基等管、培养基等凳子。试管架、凳子。试管架、天平、工作台、天平、工作台、容器、工作人容器、工作人员手等员手等第4页，共130页，编辑于2022年，星期二一、概述一、概述1 1、概念、概念指检查药典要求无菌药品、医疗器具、原指检查药典要求无菌药品、医疗器具、原料、辅料、及其它品种是否无菌的一种方料、辅料、及其它品种是否无菌的一种方法。法。2 2、检查意义检查意义是药品安全性检查项目之一是药品安全性检查项目之一 ，保证人民用药，保证人民用药安全安全 无菌检查无菌检查 第5页，共130页，编辑于2022年，星期二包括包括紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法烧伤或严重创伤的软膏烧伤或严重创伤的软膏剂与乳膏剂剂与乳膏剂植入剂植入剂注射剂注射剂眼用制剂眼用制剂烧伤或创伤气雾剂、喷雾烧伤或创伤气雾剂、喷雾剂、散剂剂、散剂3 3、范围、范围不得检出细菌、放线菌、霉菌及酵母菌等活菌。不得检出细菌、放线菌、霉菌及酵母菌等活菌。第6页，共130页，编辑于2022年，星期二包括包括需氧菌、厌氧菌培养基需氧菌、厌氧菌培养基（硫乙醇酸盐培养基）（硫乙醇酸盐培养基）选择性培养基选择性培养基一、检查前的准备工作一、检查前的准备工作（一）培养基（一）培养基真菌培养基真菌培养基第7页，共130页，编辑于2022年，星期二（一）相关规定（一）相关规定1.1.检验数量检验数量 一次试验所用供试品最小包装一次试验所用供试品最小包装容器的数量容器的数量2 2。检验量。检验量 一次检验所用供试品总量一次检验所用供试品总量三、供试品的检查三、供试品的检查 第8页，共130页，编辑于2022年，星期二3 3、阳性对照、阳性对照目的：是检查阳性菌在加入供试品的培养目的：是检查阳性菌在加入供试品的培养基中能否生长基中能否生长,以验证供试品有无抑菌活性以验证供试品有无抑菌活性物质和试验条件是否符合要求。物质和试验条件是否符合要求。4 4、阴性对照、阴性对照 不得有菌生长不得有菌生长第9页，共130页，编辑于2022年，星期二包括包括直接接种法直接接种法薄膜过滤法薄膜过滤法（二）检查方法（二）检查方法第10页，共130页，编辑于2022年，星期二（一）直接接种法（一）直接接种法1 1、供试品制备供试品制备液体试样液体试样固体试样固体试样青霉素类药青霉素类药放射性药试样放射性药试样第11页，共130页，编辑于2022年，星期二2 2、检查操作、检查操作 取供试品接种取供试品接种需氧菌、厌氧菌培养基需氧菌、厌氧菌培养基6 6管管阳性对照：金黄色葡萄球菌对照用菌液阳性对照：金黄色葡萄球菌对照用菌液1ml1ml另供试品接种另供试品接种真菌培养基真菌培养基5 5管管3030353520202525培培养养7 7天天观察记录观察记录：是否有菌生长：是否有菌生长阳性对照管在阳性对照管在2424小时內应有菌生长小时內应有菌生长 第12页，共130页，编辑于2022年，星期二（二）薄膜过滤法（二）薄膜过滤法1 1、滤器准备滤器准备全封闭过滤系统全封闭过滤系统开放式薄膜过滤器开放式薄膜过滤器 第13页，共130页，编辑于2022年，星期二2 2、过滤操作、过滤操作 有抗菌供试品有抗菌供试品0.90.9NaCl NaCl 薄膜过滤薄膜过滤无抗菌供试品无抗菌供试品薄膜过滤薄膜过滤阳性对照管：阳性对照管：细菌细菌：30303535培养培养242448h48h真菌真菌：20202525培养培养242472h72h有菌有菌生长生长第14页，共130页，编辑于2022年，星期二四、无菌检查结果判定四、无菌检查结果判定1 1、若供试品均、若供试品均澄清澄清或虽或虽显混浊，但显混浊，但经证明无菌生长经证明无菌生长阳性对照管显混浊有菌生长，阴性对照管澄清阳性对照管显混浊有菌生长，阴性对照管澄清符合规定符合规定2.2.如供试品中任何如供试品中任何1 1管显混浊管显混浊并并确确证有菌生长证有菌生长不符合规定不符合规定第15页，共130页，编辑于2022年，星期二第二节第二节 药品的微生物限度检查药品的微生物限度检查 一、概述一、概述 1 1、定义、定义系指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度系指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法。的一种检查方法。2 2、检查意义、检查意义是保证药品有效性、安全性，保证药品质量的重要是保证药品有效性、安全性，保证药品质量的重要错施。错施。第16页，共130页，编辑于2022年，星期二3 3、范围、范围包括常用口服制剂与一般外用制剂及其原、辅料包括常用口服制剂与一般外用制剂及其原、辅料。4 4、检查内容、检查内容（1 1）染菌量检查）染菌量检查:细菌数、霉菌数及酵母菌数测细菌数、霉菌数及酵母菌数测定定（2 2）控制菌检查：大肠杆菌、沙门菌、金黄色控制菌检查：大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌葡萄球菌及铜绿假单胞菌 5 5、限度标准、限度标准 不得捡出控制菌不得捡出控制菌 第17页，共130页，编辑于2022年，星期二5 5、试验前的准备、试验前的准备 1.1.开启紫光灯和空气过滤装置，至少开启紫光灯和空气过滤装置，至少30min30min。检查环境洁净度。检查环境洁净度1000010000级下的局部级下的局部洁净度洁净度100100级的单向流空气区域进行。级的单向流空气区域进行。2.2.人员穿戴无菌服，进入无菌操作室。人员穿戴无菌服，进入无菌操作室。4.4.操作前操作前 乙醇棉球消毒乙醇棉球消毒启封启封检查瓶盖、瓶口有检查瓶盖、瓶口有无生霉、长螨无生霉、长螨第18页，共130页，编辑于2022年，星期二二、供试液制备二、供试液制备 1 1、取样、取样随机抽样，一般为检验量的随机抽样，一般为检验量的3 3倍量。倍量。每批供试品检验量一般为每批供试品检验量一般为10g10g或或10ml10ml2 2、方法、方法 ：稀释处理：稀释处理 第19页，共130页，编辑于2022年，星期二三、检查法三、检查法 1 1、细菌、霉菌及酵母菌计数、细菌、霉菌及酵母菌计数通常以每通常以每g g或每或每mlml供试药品作为计量单位供试药品作为计量单位 计数方法计数方法 ：平皿菌落计数法：平皿菌落计数法取系列稀释的供试品接种在适宜的琼脂平板培取系列稀释的供试品接种在适宜的琼脂平板培养基上，以适宜的温度进行培养，观察肉眼可养基上，以适宜的温度进行培养，观察肉眼可见的细菌霉菌及酵母菌菌落数见的细菌霉菌及酵母菌菌落数第20页，共130页，编辑于2022年，星期二 2 2、控制菌检查、控制菌检查（1 1）大肠杆菌检查）大肠杆菌检查 药品中检出大肠杆菌表明该药受粪便污染，服用后药品中检出大肠杆菌表明该药受粪便污染，服用后有可能被肠道致病菌或寄生虫卵等病原体感染有可能被肠道致病菌或寄生虫卵等病原体感染 原理原理 利用目标菌所共有的限定酶作用底物产生的利用目标菌所共有的限定酶作用底物产生的分解产物具有颜色或荧光，以此作为指示系统来鉴定目标分解产物具有颜色或荧光，以此作为指示系统来鉴定目标菌菌 第21页，共130页，编辑于2022年，星期二366nm366nm紫外线下观察紫外线下观察左左:供试品管供试品管 中中:阳性对照管阳性对照管 右右:MUG:MUG培养基本底对照管培养基本底对照管第22页，共130页，编辑于2022年，星期二3 3、结果判断、结果判断 MUGMUGIndoleIndole结果结果阴性阴性阴性阴性报告未检出大肠杆菌报告未检出大肠杆菌阳性阳性阳性阳性报告检出大肠杆菌报告检出大肠杆菌阳性阳性阴性阴性需要进一步做检查需要进一步做检查阴性阴性阳性阳性需要进一步做检查需要进一步做检查第23页，共130页，编辑于2022年，星期二 （2 2）铜绿假单胞菌检查（绿脓杆菌）铜绿假单胞菌检查（绿脓杆菌）常常见见化化脓脓性性感感染染菌菌，可可造造成成眼眼角角膜膜溃溃疡疡、失失 明明，引起败血症等严重疾患引起败血症等严重疾患 检验程序检验程序增菌增菌分离分离纯培养纯培养革兰染色镜检革兰染色镜检生化实验生化实验第24页，共130页，编辑于2022年，星期二 （3 3）金黄色葡萄球菌检查（绿脓杆菌）金黄色葡萄球菌检查（绿脓杆菌）致病力最强，能引起局部及全身化脓性炎症，致病力最强，能引起局部及全身化脓性炎症，严重时可导致败血症严重时可导致败血症 第25页，共130页，编辑于2022年，星期二验证：计数方法的验证验证：计数方法的验证验证：计数方法的验证验证：计数方法的验证当建立药品的微生物限度检查法时，应进行细当建立药品的微生物限度检查法时，应进行细当建立药品的微生物限度检查法时，应进行细当建立药品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。定。定。定。若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。验结果时，计数方法应重新验证。验结果时，计数方法应重新验证。验结果时，计数方法应重新验证。验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。对各试验菌菌计数所规定的方法及下列要求进行。对各试验菌菌计数所规定的方法及下列要求进行。对各试验菌菌计数所规定的方法及下列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。的回收率应逐一进行验证。的回收率应逐一进行验证。的回收率应逐一进行验证。第26页，共130页，编辑于2022年，星期二菌种菌种菌种菌种验证试验所用的菌株传代次数不得超过验证试验所用的菌株传代次数不得超过验证试验所用的菌株传代次数不得超过验证试验所用的菌株传代次数不得超过5 5 5 5代代代代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0 0 0 0代）代）代）代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。生物学特性。生物学特性。生物学特性。验证方法验证方法验证方法验证方法验证试验至少应进行验证试验至少应进行验证试验至少应进行验证试验至少应进行3 3 3 3次独立的平行试次独立的平行试次独立的平行试次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。验验验验证试验也可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同证试验也可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同证试验也可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同证试验也可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。时进行。时进行。时进行。第27页，共130页，编辑于2022年，星期二 包括平皿法和薄膜过滤法。包括平皿法和薄膜过滤法。（一）细菌、霉菌及酵母菌计数（一）细菌、霉菌及酵母菌计数 目的：检测药物在单位质量或体积内所存在目的：检测药物在单位质量或体积内所存在的活菌数量，常用平皿法。的活菌数量，常用平皿法。验证：验证试验至少应进行验证：验证试验至少应进行3 3次独立的平行次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。率。第28页，共130页，编辑于2022年，星期二（1 1）试验组）试验组 平皿法计数时，取试验可能用平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液的最低稀释级供试液1ml 1ml 和和50100cfu50100cfu试试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备基，每株试验菌平行制备2 2个平皿，按平皿个平皿，按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时，取规定法测定其菌数。薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入冲洗，在最后一次的冲洗液中加入5010050100cfucfu试验菌，过虑，按薄膜过滤法测定其菌试验菌，过虑，按薄膜过滤法测定其菌数。数。第29页，共130页，编辑于2022年，星期二（2 2 2 2）菌液组）菌液组）菌液组）菌液组 测定所加的试验菌数。测定所加的试验菌数。测定所加的试验菌数。测定所加的试验菌数。（3 3 3 3）供试品对照组）供试品对照组）供试品对照组）供试品对照组 取规定量供试液，按菌落取规定量供试液，按菌落取规定量供试液，按菌落取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。计数方法测定供试品本底菌数。计数方法测定供试品本底菌数。计数方法测定供试品本底菌数。（4 4 4 4）稀释剂对照组）稀释剂对照组）稀释剂对照组）稀释剂对照组 若供试液制备需要分散、乳若供试液制备需要分散、乳若供试液制备需要分散、乳若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时，可用相应的稀释液替代供试影响的程度。试验时，可用相应的稀释液替代供试影响的程度。试验时，可用相应的稀释液替代供试影响的程度。试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每品，加入试验菌，使最终菌浓度为每品，加入试验菌，使最终菌浓度为每品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml1ml1ml1ml供试液含供试液含供试液含供试液含50100cfu50100cfu50100cfu50100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落，按试验组的供试液制备方法和菌落，按试验组的供试液制备方法和菌落，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。计数方法测定其菌数。计数方法测定其菌数。计数方法测定其菌数。第30页，共130页，编辑于2022年，星期二结果判断结果判断结果判断结果判断在在在在3 3 3 3次独立的平行试验中，稀释剂对照次独立的平行试验中，稀释剂对照次独立的平行试验中，稀释剂对照次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于组的平均菌落数的百分率）应均不低于组的平均菌落数的百分率）应均不低于组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%70%70%70%。若。若。若。若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于的百分率）均不低于的百分率）均不低于的百分率）均不低于70%70%70%70%，照该供试液制备方法，照该供试液制备方法，照该供试液制备方法，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于任一次试验中试验组的菌回收率低于任一次试验中试验组的菌回收率低于任一次试验中试验组的菌回收率低于70%70%70%70%，应采，应采，应采，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。菌活性，并重新进行方法验证。菌活性，并重新进行方法验证。菌活性，并重新进行方法验证。第31页，共130页，编辑于2022年，星期二操作要点：操作要点：操作要点：操作要点：1.1.1.1.一个细菌、霉菌或酵母菌的菌落均可由一个或多一个细菌、霉菌或酵母菌的菌落均可由一个或多一个细菌、霉菌或酵母菌的菌落均可由一个或多一个细菌、霉菌或酵母菌的菌落均可由一个或多个菌细胞生长繁殖而成，因此供试品中所测得的菌个菌细胞生长繁殖而成，因此供试品中所测得的菌个菌细胞生长繁殖而成，因此供试品中所测得的菌个菌细胞生长繁殖而成，因此供试品中所测得的菌落数，实际为菌落形成单位数（落数，实际为菌落形成单位数（落数，实际为菌落形成单位数（落数，实际为菌落形成单位数（cfu cfu cfu cfu）2.2.2.2.供试品检验的全过程必须符合无菌技术要求。供试品检验的全过程必须符合无菌技术要求。供试品检验的全过程必须符合无菌技术要求。供试品检验的全过程必须符合无菌技术要求。3.3.3.3.培养基、稀释剂、实验器具等的灭菌，按灭菌法培养基、稀释剂、实验器具等的灭菌，按灭菌法培养基、稀释剂、实验器具等的灭菌，按灭菌法培养基、稀释剂、实验器具等的灭菌，按灭菌法的要求采用验证合格的灭菌程序灭菌。的要求采用验证合格的灭菌程序灭菌。的要求采用验证合格的灭菌程序灭菌。的要求采用验证合格的灭菌程序灭菌。4.4.4.4.作供试品稀释时，每一稀释级都要更换吸管。作供试品稀释时，每一稀释级都要更换吸管。作供试品稀释时，每一稀释级都要更换吸管。作供试品稀释时，每一稀释级都要更换吸管。5.5.5.5.细菌培养细菌培养细菌培养细菌培养48h48h48h48h，真菌培养，真菌培养，真菌培养，真菌培养72h72h72h72h，计数。如菌落，计数。如菌落，计数。如菌落，计数。如菌落极小，不易辨认可适当延长培养时间。再点计菌落极小，不易辨认可适当延长培养时间。再点计菌落极小，不易辨认可适当延长培养时间。再点计菌落极小，不易辨认可适当延长培养时间。再点计菌落数。数。数。数。第32页，共130页，编辑于2022年，星期二6.6.6.6.含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵菌数，并且合并计数。基测定酵菌数，并且合并计数。基测定酵菌数，并且合并计数。基测定酵菌数，并且合并计数。7.7.7.7.若同一稀释级两个平板的菌落平均数不小于若同一稀释级两个平板的菌落平均数不小于若同一稀释级两个平板的菌落平均数不小于若同一稀释级两个平板的菌落平均数不小于15151515，则两个平板的菌落数不能相差，则两个平板的菌落数不能相差，则两个平板的菌落数不能相差，则两个平板的菌落数不能相差1 1 1 1 倍或以上。倍或以上。倍或以上。倍或以上。8.8.8.8.使用灭菌吸管时，管尖不要接触可能污染的任使用灭菌吸管时，管尖不要接触可能污染的任使用灭菌吸管时，管尖不要接触可能污染的任使用灭菌吸管时，管尖不要接触可能污染的任何容器或用具。何容器或用具。何容器或用具。何容器或用具。9.9.9.9.供试液稀释及注皿时应振摇后取均匀的供试供试液稀释及注皿时应振摇后取均匀的供试供试液稀释及注皿时应振摇后取均匀的供试供试液稀释及注皿时应振摇后取均匀的供试液，以免造成实验误差。液，以免造成实验误差。液，以免造成实验误差。液，以免造成实验误差。第33页，共130页，编辑于2022年，星期二10.10.10.10.培养基的分装量不得超过容器的培养基的分装量不得超过容器的培养基的分装量不得超过容器的培养基的分装量不得超过容器的2/32/32/32/3以免灭菌时以免灭菌时以免灭菌时以免灭菌时溢出。包装时，塞子必须塞紧，以免松动或脱落造成溢出。包装时，塞子必须塞紧，以免松动或脱落造成溢出。包装时，塞子必须塞紧，以免松动或脱落造成溢出。包装时，塞子必须塞紧，以免松动或脱落造成染菌。染菌。染菌。染菌。11.11.11.11.培养基配制后应在培养基配制后应在培养基配制后应在培养基配制后应在2h2h2h2h内灭菌，避免细菌繁殖。内灭菌，避免细菌繁殖。内灭菌，避免细菌繁殖。内灭菌，避免细菌繁殖。12.12.12.12.灭菌后的培养基应保存在灭菌后的培养基应保存在灭菌后的培养基应保存在灭菌后的培养基应保存在2-25 2-25 2-25 2-25 防止被污染，防止被污染，防止被污染，防止被污染，可在三周内用毕。可在三周内用毕。可在三周内用毕。可在三周内用毕。13.13.13.13.已溶化的培养基应一次用完，一般开启后不宜再已溶化的培养基应一次用完，一般开启后不宜再已溶化的培养基应一次用完，一般开启后不宜再已溶化的培养基应一次用完，一般开启后不宜再用，更不要反复加热溶化用，更不要反复加热溶化用，更不要反复加热溶化用，更不要反复加热溶化 。第34页，共130页，编辑于2022年，星期二14.14.14.14.注皿时培养基应在注皿时培养基应在注皿时培养基应在注皿时培养基应在451451451451，高于，高于，高于，高于45454545时易造时易造时易造时易造成细菌受损或致死，低于成细菌受损或致死，低于成细菌受损或致死，低于成细菌受损或致死，低于45454545时易凝固，影响混时易凝固，影响混时易凝固，影响混时易凝固，影响混匀，因此使用前可用水浴保温效果较好。匀，因此使用前可用水浴保温效果较好。匀，因此使用前可用水浴保温效果较好。匀，因此使用前可用水浴保温效果较好。15.15.15.15.倾注培养基于平皿中与样品摇匀时，切勿溅到倾注培养基于平皿中与样品摇匀时，切勿溅到倾注培养基于平皿中与样品摇匀时，切勿溅到倾注培养基于平皿中与样品摇匀时，切勿溅到皿盖边和皿盖上，以免影响实验结果。皿盖边和皿盖上，以免影响实验结果。皿盖边和皿盖上，以免影响实验结果。皿盖边和皿盖上，以免影响实验结果。第35页，共130页，编辑于2022年，星期二16.16.16.16.采用薄膜过滤法时，水溶性供试液过滤前先将少采用薄膜过滤法时，水溶性供试液过滤前先将少采用薄膜过滤法时，水溶性供试液过滤前先将少采用薄膜过滤法时，水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为膜，每张滤膜每次冲洗量为膜，每张滤膜每次冲洗量为膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml100ml100ml100ml，冲洗液、冲洗，冲洗液、冲洗，冲洗液、冲洗，冲洗液、冲洗量及冲洗方法同方法验证试验。每片滤膜的总过滤量量及冲洗方法同方法验证试验。每片滤膜的总过滤量量及冲洗方法同方法验证试验。每片滤膜的总过滤量量及冲洗方法同方法验证试验。每片滤膜的总过滤量不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。第36页，共130页，编辑于2022年，星期二17.17.17.17.每张滤膜取相当于每张滤膜取相当于每张滤膜取相当于每张滤膜取相当于1g1g1g1g或或或或1ml1ml1ml1ml供试品的供试液直供试品的供试液直供试品的供试液直供试品的供试液直接过滤或加至适量稀释剂中混匀，过滤，用适宜的接过滤或加至适量稀释剂中混匀，过滤，用适宜的接过滤或加至适量稀释剂中混匀，过滤，用适宜的接过滤或加至适量稀释剂中混匀，过滤，用适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法及冲洗量同冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法及冲洗量同冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法及冲洗量同冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法及冲洗量同“计数方法的计数方法的计数方法的计数方法的验证验证验证验证”，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜，滤膜贴于平板上时不得有空隙或气泡，否则滤膜，滤膜贴于平板上时不得有空隙或气泡，否则滤膜，滤膜贴于平板上时不得有空隙或气泡，否则滤膜，滤膜贴于平板上时不得有空隙或气泡，否则影响微生物生长影响微生物生长影响微生物生长影响微生物生长。第37页，共130页，编辑于2022年，星期二 18.18.18.18.菌落数在菌落数在菌落数在菌落数在100100100100以内时按实有数据报告。菌落以内时按实有数据报告。菌落以内时按实有数据报告。菌落以内时按实有数据报告。菌落数大于数大于数大于数大于100100100100时，取两位有效数字报告，第三位按时，取两位有效数字报告，第三位按时，取两位有效数字报告，第三位按时，取两位有效数字报告，第三位按数字修约规则处理。数字修约规则处理。数字修约规则处理。数字修约规则处理。第38页，共130页，编辑于2022年，星期二第三节第三节 抗生素效价的微生物测定法抗生素效价的微生物测定法 抗生素微生物检定法是国际上通用抗生素微生物检定法是国际上通用的、经典的抗生素效价测定方法。自的、经典的抗生素效价测定方法。自2020世纪世纪4040年代建立至今，在各国药典中被年代建立至今，在各国药典中被普遍采用。虽然伴随着普遍采用。虽然伴随着HPLCHPLC等化学分析等化学分析技术的发展，一些抗生素品种的效价测技术的发展，一些抗生素品种的效价测定已被化学方法所取代，但由于以下原定已被化学方法所取代，但由于以下原因：因：第39页，共130页，编辑于2022年，星期二uu微生物检定法可直观、特异地反映出抗生微生物检定法可直观、特异地反映出抗生素药品的抗菌活性；素药品的抗菌活性；uu多组分抗生素由于不同活性组分生物活性多组分抗生素由于不同活性组分生物活性的差异，化学测定结果难以准确表征组分的差异，化学测定结果难以准确表征组分组成、含量和生物活性间的关系；组成、含量和生物活性间的关系；uu许多抗生素品种由于各种原因目前没有适许多抗生素品种由于各种原因目前没有适当的化学分析方法表征其活性。当的化学分析方法表征其活性。所所所所以以以以抗抗抗抗生生生生素素素素微微微微生生生生物物物物检检检检定定定定法法法法目目目目前前前前在在在在各各各各国国国国药药药药典典典典中中中中仍仍仍仍占占占占有有有有重重重重要要要要地地地地位位位位，且且且且短短短短期期期期内内内内化化化化学学学学分分分分析析析析法法法法不不不不可可可可能能能能取取取取代代代代微微微微生生生生物物物物检检检检定定定定法。法。法。法。第40页，共130页，编辑于2022年，星期二 一、概述一、概述 物理、化学方法：简便、快速，本身纯度物理、化学方法：简便、快速，本身纯度不高，采用该法会引起偏差，因此，只有在不高，采用该法会引起偏差，因此，只有在纯度较高时才用此法。纯度较高时才用此法。微生物法：原理和临床应用的相一致，直微生物法：原理和临床应用的相一致，直接反映出抗生素的疗效，且灵敏度较高，需接反映出抗生素的疗效，且灵敏度较高，需用量较小，广泛应用。用量较小，广泛应用。第41页，共130页，编辑于2022年，星期二1.1.定义抗生素效价定义定义抗生素效价定义l l“活性活性”重量单位：以抗生素中所含特定重量单位：以抗生素中所含特定的抗菌（抗肿瘤细胞、抗病毒）活性部分的抗菌（抗肿瘤细胞、抗病毒）活性部分的重量作为效价单位。的重量作为效价单位。如碱性抗生素，以纯碱的量作为有效部分如碱性抗生素，以纯碱的量作为有效部分的量；酸性抗生素，以纯酸的量作为有效的量；酸性抗生素，以纯酸的量作为有效部分的量。部分的量。第42页，共130页，编辑于2022年，星期二uu在抗生素的生产、研究和应用等方面，均在抗生素的生产、研究和应用等方面，均以抗生素活性成分的以抗生素活性成分的“活性活性”重量计量抗生重量计量抗生素素的效价单位，采用活性成分的的效价单位，采用活性成分的“活性活性”重量重量1 1g g1 1效价单位的方法表示。效价单位的方法表示。uu抗生素效价以抗生素效价以“单位（单位（u u）”或或“微克微克（g g）”表示表示。第43页，共130页，编辑于2022年，星期二例：硫酸链霉素例：硫酸链霉素 抗菌活性是以链霉素效价单位表示的，其抗菌活性是以链霉素效价单位表示的，其链霉素的效价单位是以具活性成分链霉素碱链霉素的效价单位是以具活性成分链霉素碱的的“活性活性”重量表示的，即重量表示的，即1 1链霉素效价单位链霉素效价单位1 1微克链霉素碱，这里是微克链霉素碱，这里是“活性微克活性微克”而不是而不是“重量微克重量微克”。第44页，共130页，编辑于2022年，星期二uu在制成盐类或其他衍生物后，其相应的折在制成盐类或其他衍生物后，其相应的折算效价，可以从分子量折算而得。算效价，可以从分子量折算而得。uu如：硫酸链霉素的折算效价为如：硫酸链霉素的折算效价为第45页，共130页，编辑于2022年，星期二l l重量折算单位：以特定的纯抗生素制品的重量折算单位：以特定的纯抗生素制品的某一重量为某一重量为1 1单位而加以折算。单位而加以折算。如：青霉素如：青霉素G G钠钠 以青霉素单位也称牛津单位（以青霉素单位也称牛津单位（Oxford Oxford unitunit）表示其抗菌活性，最初的定义为）表示其抗菌活性，最初的定义为“1 1个个青霉素效价单位（青霉素效价单位（u u）为能在）为能在5050毫升肉汤培养毫升肉汤培养基中完全抑制金黄色葡萄球菌标准菌株发育基中完全抑制金黄色葡萄球菌标准菌株发育的最小青霉素剂量的最小青霉素剂量”。第46页，共130页，编辑于2022年，星期二uu抗生素微生物检定法可分为：抗生素微生物检定法可分为：（1 1）稀释法）稀释法 （2 2）比浊法）比浊法 （3 3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）uu各各国国药药典典通通常常采采用用后后两两种种方方法法测测定定抗抗生生素素的的效价。效价。第47页，共130页，编辑于2022年，星期二1.1.定义稀释法定义稀释法uu通过监测等量的试验菌菌液在不同浓度的通过监测等量的试验菌菌液在不同浓度的抗生素液体培养基中的生长情况，观察含不抗生素液体培养基中的生长情况，观察含不同浓度抗生素的液体培养基中有无细菌的生同浓度抗生素的液体培养基中有无细菌的生长，从而测定抗生素最低抑菌浓度（长，从而测定抗生素最低抑菌浓度（MICMIC）的）的方法，常用于新药研制及临床药敏试验等方方法，常用于新药研制及临床药敏试验等方面。面。第48页，共130页，编辑于2022年，星期二1.定义比浊法uu通过监测等量的试验菌菌液在不同浓度的通过监测等量的试验菌菌液在不同浓度的通过监测等量的试验菌菌液在不同浓度的通过监测等量的试验菌菌液在不同浓度的抗生素液体培养基中的生长情况，利用分光光度法抗生素液体培养基中的生长情况，利用分光光度法抗生素液体培养基中的生长情况，利用分光光度法抗生素液体培养基中的生长情况，利用分光光度法测定含不同浓度的抗生素的液体培养基的浊度，从测定含不同浓度的抗生素的液体培养基的浊度，从测定含不同浓度的抗生素的液体培养基的浊度，从测定含不同浓度的抗生素的液体培养基的浊度，从而衡量抗生素抑菌效力的方法，可用于抗生素药物而衡量抗生素抑菌效力的方法，可用于抗生素药物而衡量抗生素抑菌效力的方法，可用于抗生素药物而衡量抗生素抑菌效力的方法，可用于抗生素药物的含量（效价）测定。的含量（效价）测定。的含量（效价）测定。的含量（效价）测定。第49页，共130页，编辑于2022年，星期二1.1.定义（琼脂）扩散法定义（琼脂）扩散法uu通过测定由不同浓度的抗生素溶液在含有通过测定由不同浓度的抗生素溶液在含有试验菌固体培养基中的扩散，而在其表面所试验菌固体培养基中的扩散，而在其表面所产生的抑菌圈的大小，衡量抗生素抑菌效力产生的抑菌圈的大小，衡量抗生素抑菌效力的方法，多用于抗生素药物的含量（效价）的方法，多用于抗生素药物的含量（效价）测定。测定。第50页，共130页，编辑于2022年，星期二抗生素微生物检定方法比较：抗生素微生物检定方法比较：第51页，共130页，编辑于2022年，星期二定义管碟法l l此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价小，计算出供试品的效价。第52页，共130页，编辑于2022年，星期二2.2.原理抑菌圈的形成原理抑菌圈的形成uu两种互动作用：一种是抗生素溶液向培养两种互动作用：一种是抗生素溶液向培养基内呈球面状扩散作用；另一种是试验菌基内呈球面状扩散作用；另一种是试验菌的生长作用。的生长作用。uu当培养到一定时间，琼脂培养基