CR技术及其应用.ppt

PCR技术及其应用PCR的定义：的定义：PCR（polymerasechainreaction)：聚合酶链式反应，又称体外聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增扩增技术。技术。n n聚合酶链式反应聚合酶链式反应于于1983年由美国年由美国科学家科学家K.Mullis建立建立，荣获荣获19931993年度诺贝尔化学奖，年度诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。为生命科学领域的研究开创了崭新时代。PCR技术原理5 Primer15 Primer2Cycle2Cycle15 5 5 5 5 5 TemplateDNA5 5 5 5 5 5 5 5 一、基本工作原理一、基本工作原理目目录录Cycle35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。目目录录Target AmplificationNo.ofNo.Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle=2 Amplicon2 cycle=4 Amplicon3 cycle=8 Amplicon4 cycle=16 Amplicon5 cycle=32 Amplicon6 cycle=64 Amplicon7 cycle=128 Ampliconn模板模板DNAn特异性引物特异性引物n耐热耐热DNA聚合酶聚合酶ndNTPsnMg2+PCRPCR体系基本组成成分体系基本组成成分PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5CPCR仪仪PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点实验仪器电泳仪电泳仪琼脂糖凝胶电泳槽琼脂糖凝胶电泳槽琼脂糖凝胶电泳槽琼脂糖凝胶电泳槽电泳技术电泳技术（）鉴定（）鉴定DNA分子量分子量(3)(3)胶回收纯化胶回收纯化DNAlow-melt agarose实验结果PCR结果。1、对照(无模板)；26、PCR产物（5ul样品）凝胶成像系统凝胶成像系统凝胶成像系统凝胶成像系统PCRPCR的类型的类型巢式巢式PCR PCR 原位原位PCRPCR多重多重PCR PCR 定量定量PCRPCR不对称不对称PCR PCR 差异显示差异显示PCRPCR共享引物共享引物PCR PCR 重组重组PCRPCR锚定锚定PCR (PCR (十一十一)RT-PCR)RT-PCR彩色彩色PCRPCR (十二十二)RAPD)RAPD-锚定锚定PCRPCR：使用一条锚定引物就一条特异性引物扩增已知一端使用一条锚定引物就一条特异性引物扩增已知一端使用一条锚定引物就一条特异性引物扩增已知一端使用一条锚定引物就一条特异性引物扩增已知一端序列的目的序列的目的序列的目的序列的目的DNADNADNADNA。增效增效PCRPCR（booster PCRbooster PCR）当当扩增少于扩增少于10001000拷贝的模板拷贝的模板DNADNA时会遇到两个时会遇到两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增，问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增，消耗了引物和酶，而特异扩增片段产量降低。对消耗了引物和酶，而特异扩增片段产量降低。对于这种情况，可设置二步于这种情况，可设置二步PCRPCR，先用较低浓度的引，先用较低浓度的引物进行初级物进行初级PCRPCR，此时由于引物少，形成引物二聚，此时由于引物少，形成引物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，只体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，只是由于引物少产量不高。约经是由于引物少产量不高。约经15152020个循环后补个循环后补充产物量，以初级充产物量，以初级PCRPCR产物为模板进行扩增，靶序产物为模板进行扩增，靶序列的产量将相应增加。列的产量将相应增加。n n在同一在同一PCRPCR体系中加入数对体系中加入数对PCRPCR引物，如果引物，如果这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增多个多个DNADNA片段。片段。n n多重多重PCRPCR常用来检测同一基因的多个外显子常用来检测同一基因的多个外显子的缺失。的缺失。多重多重PCRPCR巢式巢式PCRPCR：利用两套利用两套利用两套利用两套PCRPCRPCRPCR引物引物引物引物对对进行进行进行进行两两两两轮轮PCRPCRPCRPCR扩扩增反增反增反增反应组应组成，在第一成，在第一成，在第一成，在第一轮扩轮扩增中，外引物用以增中，外引物用以增中，外引物用以增中，外引物用以产产生生生生扩扩增增增增产产物，此物，此物，此物，此产产物在在内引物的存在下物在在内引物的存在下物在在内引物的存在下物在在内引物的存在下进进行第二行第二行第二行第二轮扩轮扩增。增。增。增。差别显示：差别显示：是根据绝大多数真核细胞是根据绝大多数真核细胞是根据绝大多数真核细胞是根据绝大多数真核细胞mRNA3mRNA3mRNA3mRNA3端具有的多聚腺苷酸尾（端具有的多聚腺苷酸尾（端具有的多聚腺苷酸尾（端具有的多聚腺苷酸尾（polyApolyApolyApolyA）结构，因）结构，因）结构，因）结构，因此可用含此可用含此可用含此可用含oligooligooligooligo（dTdTdTdT）的寡聚核苷酸为引物将不同的）的寡聚核苷酸为引物将不同的）的寡聚核苷酸为引物将不同的）的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNAmRNAmRNAmRNA反转录成反转录成反转录成反转录成cDNAcDNAcDNAcDNA。不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究 高浓度引物低浓度引物原位原位PCR技术技术原位PCRHasse等于等于1990年建立。年建立。是指在组织细胞里进行是指在组织细胞里进行PCR反应，它结合反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的异敏感的PCR技术的优点。技术的优点。原位原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，分子水又能标出靶序列在细胞内的位置，分子水平和细胞水平研究并重。平和细胞水平研究并重。原位原位PCR的实验过程：的实验过程：实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细胞等。其基本方法为多聚甲醛固脱落细胞、血细胞等。其基本方法为多聚甲醛固定组织或细胞，蛋白酶消化处理组织；在组织细定组织或细胞，蛋白酶消化处理组织；在组织细胞胞玻片玻片上滴加上滴加PCR反应液进行扩增，覆盖并加液反应液进行扩增，覆盖并加液体石蜡后，在体石蜡后，在原位原位PCR仪仪上进行上进行PCR循环扩增，循环扩增，PCR扩增结束后用标记的探针进行原位杂交，最扩增结束后用标记的探针进行原位杂交，最后显微镜观察结果。后显微镜观察结果。16块载玻片及24个0.2ml管的样品block 反转录反转录PCR技术技术基因mRNAmRNA蛋白质多肽链蛋白质多肽链逆转录酶聚合酶mRNAmRNAcDNAcDNA杂化双链杂化双链PCR扩增常规常规PCR方法的局限性分析：方法的局限性分析：无法对起始模板准确定量无法对起始模板准确定量,只能对终产物进只能对终产物进行分析行分析必须在扩增后用电泳方法分析必须在扩增后用电泳方法分析,费时费力而费时费力而且且EB有毒有毒无法对扩增反应实时检测无法对扩增反应实时检测PCRPhasesLogDNALogDNACycle#Cycle#GeometricGeometricLinearLinearPlateauPlateauy=x(1+e)nTraditionalPCRdetectiony=x 2n实时荧光定量实时荧光定量PCR （real-time PCR）非特异性的嵌入荧光染料（Non-specific DNA binding dyes）SYBR Green ISYBR GoldEthidium Bromide Extension53535353Extension ContinuedApply ExcitationWavelength535355TaqTaq353TaqTaq55RepeatDNA binding dyesBDBDBDBDBDBDBDBDBDBDlllll实时实时PCRPCR技术原理技术原理目目录录非特异性的嵌入荧光染料评价n n优点：与特异性的荧光探针相比价格便宜 只需要设计PCR引物 缺点：由于它和模板的结合是非特异性 的，它可以和所有的双链DNA包括引 物和非特异性扩增产物结合，不能真 实反映目 的基因的扩增情况。TaqMan 探针 评价n n优点：荧光信号强 与其它探针相比设计简单 可用于多通道检测 可用于SNP的检测n n缺点：比DNA结合染料价格高Ct value and Real-Time Quantitative PCR TheoryCtCt值值值值（Threshold Threshold CycleCycle）PCR扩增过扩增过程中，扩增产物程中，扩增产物荧光信号超过基荧光信号超过基线值（进入指数线值（进入指数增长期）时的循增长期）时的循环数。环数。模板起始浓度越高，Ct值越小 Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系Ct值与模板起始浓度的关系值与模板起始浓度的关系 如果模板浓度增加1倍，Ct值就提前1个循环到达 如果模板浓度减少1倍，Ct值就滞后1个循环到达绝对定量可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。“Real-Time PCR”is“sequence detection”in a closed-tube cap PCR vesselthermal block samplelens0.000.100.200.300.400.500.600.700.800.900510152025303540PCR cycle numberBaseline regionThresholdCTNo Template control SampleNormalised reporter fluorescence(Rn)Geometric PhasePCR Efficiency1CT:ThresholdcycleThe calculated fractional cycle number at which the fluorescence passes the fixed threshold实时荧光定量实时荧光定量 PCR技术的应用技术的应用 n n1.DNA 1.DNA 或或 RNA RNA 的绝对定量分析的绝对定量分析 。包括。包括 病原微生物或病原微生物或病毒含量的检测病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测，转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAiRNAi 基因失活率的检测等。基因失活率的检测等。n n2.2.基因表达差异分析。例如比较基因表达差异分析。例如比较 经过不同处理样本之间经过不同处理样本之间特定基因的表达差异特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理如药物处理、物理处理、化学处理等等)，特定基因在不同时相的表达差异以及，特定基因在不同时相的表达差异以及 cDNA cDNA 芯片芯片或差显结果的确证或差显结果的确证 n n3.3.基因分型。例如基因分型。例如 SNP SNP 检测，甲基化检测等。检测，甲基化检测等。PCR技术应用研究 基因克隆，DNA测序，分析突变(制备杂交探针制备杂交探针)遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱诊断遗传疾病肿瘤感染性疾病，传染性流行病判断个体疾病易感性器官移植组织配型法医学中个体识别、亲子鉴定,犯罪现场标本分析PCR技术的主要用途技术的主要用途1、目的基因的克隆目的基因的克隆：PCR技术为在重组技术为在重组DNA过程中获得目的基过程中获得目的基因片段提供了简便快速的方法。因片段提供了简便快速的方法。2、基因的体外突变基因的体外突变：可以随意设计引物在体外对目的基因片段可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。进行嵌和、缺失、点突变等改造。3、DNA序列测定：序列测定：PCR技术的引入使技术的引入使DNA测序工作大大简化，测序工作大大简化，也提高了测序的速度。也提高了测序的速度。4、基因突变分析：基因突变分析：利用利用PCR与一些技术的结合可以大大提高与一些技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。基因突变检测的敏感性。5、DNA和和RNA的微量分析：的微量分析：PCR技术高度敏感，对模板的含量技术高度敏感，对模板的含量要求很低，是要求很低，是DNA和和NA微量分析的最好方微量分析的最好方法。法。诊断诊断肿瘤感染性疾病，传染性流行病判断个体疾病易感性器官移植组织配型法医学中个体识别、亲子鉴定,犯罪现场标本分析大肠杆菌大肠杆菌胰岛素胰岛素重组体+胰岛素胰岛素基因基因基因基因基因工程产品基因工程产品Mst酶切位点酶切位点(GCTNAGG)53正常基因正常基因53突变基因突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析+0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突变携带着突变携带着患者患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析PCR/单链构象多态性分析单链构象多态性分析(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，借此可分析确常基因和变异基因的迁移位置不同，借此可分析确定致病基因的存在。定致病基因的存在。PCR-SSCPPCR-SSCP过程：过程：-primer-32P-dNTP掺入掺入PCR扩增扩增产物产物变性变性单链单链DNA中性聚丙烯酰胺凝胶电泳中性聚丙烯酰胺凝胶电泳1 2 3 4 5自显影自显影 1.为正常结果分析结果分析2、4、5纯合患者 3.为杂合子 .解链构像DAN原 理过 程