HPLC高效液相色谱技巧.ppt

SHIMADZU Solutions for Science Since 1875如何用好如何用好HPLC 得到好结果的技巧得到好结果的技巧!SHIMADZU Solutions for Science Since 1875流动相流动相缓冲液/溶剂选择,梯度优化,流速选择脱气，流速稳定,流动相制备 柱柱高柱效,二级作用力,柱间变异,温度控制检测检测灵敏度,选择性,温度波动影响样品样品提取方法选择,样品溶剂选择,氧气影响仪器仪器性能,稳定性,耐用性,易操作性综合评估综合评估分析技术的稳定性,可靠性,定量准确性HPLC如何得到好的结果如何得到好的结果 SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 流动相流动相 溶剂混和率及其制备溶剂混和率及其制备(1)下面的两种配制一样吗下面的两种配制一样吗?水/乙醇=1/1(v/v)50%(v/v)乙醇水溶液*混和有机溶剂时注意体积变化混和有机溶剂时注意体积变化混和液的密度不是两种溶剂密度的简单相加.25C 时，50mL 水和50ml乙醇混和,最终体积为96ml.SHIMADZU Solutions for Science Since 1875水/乙醇=1/1(v/v)分别量取500ml水和乙醇,然后混和混和体积不是 1L.50%(v/v)乙醇水溶液.加500ml乙醇于1L的容量瓶中,加水至刻度.水的比例更高.1LWaterEthanolEthanolWater 流动相流动相 溶剂混和率及其制备溶剂混和率及其制备(2)SHIMADZU Solutions for Science Since 1875流动相流动相 A:20mM 磷酸磷酸(Na)缓冲液缓冲液 /乙腈乙腈=9/1(v/v)流动相流动相 B:10%(v/v)乙腈乙腈/20mM 磷酸缓冲液磷酸缓冲液 12331AB 2Peaks 1:acetaminophen 2:dihydrocodeine 3:caffeine0246810minColumn:Shim-Pack VP-ODS(150mmL.x 4.6mmI.D.)Flow rate:1mL/minTemp.:40CDetection:UV-VIS(210nm)流动相流动相 溶剂混和率及其制备溶剂混和率及其制备(3)SHIMADZU Solutions for Science Since 1875配制配制:20mM 磷酸缓冲液磷酸缓冲液(pH2.5)流动相流动相 缓冲液比例及其制备缓冲液比例及其制备(1)A:“20mM”表示 磷酸浓度 加10mmol 磷酸和 10mmol 磷酸二氢钠,溶解于 1L水中 B:“20mM”表示 钠浓度 溶解 20mmol 磷酸二氢钠于1L 水中,加磷酸调 pH 至 2.5C:“20mM”表示 磷酸和钠的浓度,用高氯酸调节pH 溶解20mmol 磷酸二氢钠于 1L 水中,用高氯酸调节pH 至 2.5SHIMADZU Solutions for Science Since 1875Column:Shim-Pack VP-ODS(150mmL.x 4.6mmI.D.)Flow rate:1mL/minTemp.:40CDetection:UV-VIS(210nm)流动相流动相 A:A:磷酸浓度为磷酸浓度为 20mM 20mM流动相流动相 B:B:钠浓度为钠浓度为 20mM 20mM流动相流动相 C:C:磷酸，钠浓度均为磷酸，钠浓度均为 20mM,20mM,用高氯酸调节用高氯酸调节pHpH 流动相流动相 缓冲液比例及其制备缓冲液比例及其制备(2)min12331AB 2Peaks 1:acetaminophen 2:dihydrocodeine 3:caffeine0246810C31,2不一样的解释不一样的解释Dihyrocodeine 出峰位置不一出峰位置不一样样SHIMADZU Solutions for Science Since 1875流动相缓冲能力弱流动相缓冲能力弱pKa 与流动相与流动相pH相近的酸和碱的峰形相近的酸和碱的峰形变差变差.Column:STR ODS-II (150mmL.x 4.6mm I.D.)Mobile:20mM buffer solution(pH 4.5)phase /acetonitrile(3/1,v/v)Flow rate:1mL/minTemp.:40CDetection:UV-VIS(240nm)左图左图:柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液pH(4.5)作流动相作流动相右图右图:磷酸缓冲液磷酸缓冲液(pH 4.5)作流动相作流动相 流动相流动相 pH 缓冲能力和缓冲能力和 峰形峰形SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 吸光度 HPLC 级的乙腈在 UV低波长有很低的吸收 HPLC级的乙腈级的乙腈适用于适用于 UV低波长下高灵敏度的分析低波长下高灵敏度的分析!柱压 乙腈更低.相同流速下相同流速下,引起的柱压更低引起的柱压更低.洗脱能力 乙腈更强.一些化合物甲醇容易洗脱一些化合物甲醇容易洗脱.(胡萝卜素胡萝卜素,胆固醇胆固醇)选择性 不同.峰形 不同.聚合物基底的柱子聚合物基底的柱子,乙腈更好乙腈更好.流动相脱气效率 与水混和时要注意甲醇甲醇 发热发热 气体溢出气体溢出 乙腈乙腈 吸热吸热 气体溶解气体溶解 流动相流动相 甲醇和乙腈的不同甲醇和乙腈的不同 SHIMADZU Solutions for Science Since 1875保留时间改变峰面积改变 定量错误!对绝对量响应的检测器 流速不影响峰面积.对浓度响应的检测器 流速影响峰面积.*几乎所有的 LC 检测器均为浓度型检测器 流动相流动相 流速变化的影响流速变化的影响(1)SHIMADZU Solutions for Science Since 18751.009729145912886547n-butylparaben1.009826520872626362n-propylparaben1.009627710872744605ethylparaben1.009539382133901107methylparabenB/AB(0.99mL/min)A(1.00mL/min)面积比峰面积Column:Shim-Pack VP-ODS (150mm L.x 4.6mm I.D.)Mobile phase:methanol/water =6/4(v/v)Flow rate:A;1.00mL/min B;0.99mL/minTemperature:40CDetection:UV-VIS(260nm)流动相流动相 流速变化的影响流速变化的影响(2)SHIMADZU Solutions for Science Since 1875两台泵进行混和时ABA:一台泵输送预先混和好溶剂一台泵输送预先混和好溶剂B:两台泵分别输送两种溶剂并混和两台泵分别输送两种溶剂并混和Peaks 1:methylparaben 2:ethylparaben 3:propylparaben123 流动相流动相 高压梯度时流速变化的影响高压梯度时流速变化的影响(1)保留时间和预先混和好的溶剂不同保留时间和预先混和好的溶剂不同SHIMADZU Solutions for Science Since 18751.01330752593035538n-butylparaben1.01327971802761054n-propylparaben1.01329225562885602ethylparaben1.01341518764100127methylparabenB/ABA面积比峰面积Column:Shim-Pack VP-ODS (150mmL.x 4.6mm I.D.)Mobile phase:methanol/water(6/4,vol/vol)Flow rate:1.00mL/minTemperature:40CDetection:UV-VIS(260nm)流动相流动相 高压梯度时流速变化的影响高压梯度时流速变化的影响(1)A:一台泵输送预先混和好溶剂一台泵输送预先混和好溶剂B:两台泵分别输送两种溶剂并混和两台泵分别输送两种溶剂并混和SHIMADZU Solutions for Science Since 1875气泡出现的原因当溶解的空气超过空气的溶解度时.原因:溶剂温度升高,压力降低,溶剂混和等.气泡可能引起的问题流动相,泵保留时间波动,流动相流量不稳定柱峰变形,柱效降低检测器产生噪声解决方法:离线和在线脱气 然而然而,问题不仅由于气泡引起问题不仅由于气泡引起,而且由于溶解的空气引起而且由于溶解的空气引起.流动相流动相 流动相中的气泡引起的问题流动相中的气泡引起的问题SHIMADZU Solutions for Science Since 1875荧光检测器氧气引起荧光猝灭 改变峰面积 吸光型检测器改变背景吸收 基线波动(特别是在梯度洗脱时)氧气吸收峰出现示差折光检测器基线波动 流动相流动相 流动相中的空气对检测器的影响流动相中的空气对检测器的影响SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 Degassed Not degassed*荧光检测器分析bisphenol A脱气:氦脱气 流动相流动相 荧光检测中脱气的影响荧光检测中脱气的影响(1)流动相脱气可能影响荧光检测的灵敏度流动相脱气可能影响荧光检测的灵敏度.SHIMADZU Solutions for Science Since 1875脱气时间对气液半透膜脱气时间对气液半透膜 脱气效果的影响脱气效果的影响.0123450102030405060脱气开始时间脱气开始时间(min)Peak Area Value (106)Degasser OFFDegasser ONColumn :Shim-Pack VP-ODS (150mm L x 4.6mm I.D.)Mobile Phase:acetonitrile/H2O=4/1(v/v)Flow rate :1mL/minTemperature :40CAnalyte:PyreneDetection:Fluorescence (Ex 310nm,Em 390nm)Degassing:Gas-liq.separation membrane 流动相流动相 荧光检测中脱气的影响荧光检测中脱气的影响(2)SHIMADZU Solutions for Science Since 1875甲醇吸收光谱图甲醇吸收光谱图如果溶解的氧气浓度高，如果溶解的氧气浓度高，有机溶剂的吸光度液也高有机溶剂的吸光度液也高.在短波长区影响更为明显在短波长区影响更为明显.流动相流动相 UV 检测器的背景变化检测器的背景变化饱和空气饱和空气脱气脱气SHIMADZU Solutions for Science Since 1875进流动相引起出峰!?流动相流动相 溶解的空气引起溶解的空气引起UV检测器的出峰检测器的出峰Detection:UV-210nm流动相和样品溶剂中溶解气体量不同引起出峰流动相和样品溶剂中溶解气体量不同引起出峰流动相脱气流动相脱气流动相没脱气流动相没脱气Oxygen bubblingAir saturationHe bubblingOxygen bubblingAir saturationHe bubblingSHIMADZU Solutions for Science Since 1875放大 流动相流动相 溶解空气引起的溶解空气引起的RID检测器出峰检测器出峰Column :SCR-101CMobile phase:Water Flow rate :0.5mL/minTemperature :85CDetection :RID detectorDegasser :Gas-liq.Membrane Separ.(DGU-14A)Sample :0.5%mannitol流动相和样品溶剂中溶解气体量流动相和样品溶剂中溶解气体量不同引起出峰不同引起出峰.SHIMADZU Solutions for Science Since 1875一般一般,环境温度影响光谱图的形状环境温度影响光谱图的形状.波长高温下的光谱图高温下的光谱图由于温度变化引起的吸光度差异由于温度变化引起的吸光度差异低温下的光谱图低温下的光谱图吸光度 检测检测 UV 检测器池温度的影响检测器池温度的影响(1)SHIMADZU Solutions for Science Since 1875不控制温度时峰面积比较(34C)0.9680.985p-toluic acid0.9860.991Benzoic acid0.9910.994Phenol50C40C与 34C时的峰面积比Column :Shim-Pack VP-ODS (150mm L.x 4.6mm I.D.)Mobile phase :10mM acetic acid(sodium)buffer solution(pH 4.5)/Methanol=7/3,(v/v)Flow rate :1mL/minTemperature :40CDetection :UV-VIS(260nm)检测检测 UV 检测器池温度的影响检测器池温度的影响(2)SHIMADZU Solutions for Science Since 1875无温度控制无温度控制(RF-10AXLsuper)(RF-10AXLsuper)2025C面积降低了面积降低了13.5%2025C面积降低了面积降低了2.2%检测检测 池温度对荧光检测器的影响池温度对荧光检测器的影响(1)正常情况下,温度越高,荧光灵敏度越低.氮蒽分析结果(温度对荧光灵敏度的影响)无温度控制无温度控制(RF-10AXL)(RF-10AXL)SHIMADZU Solutions for Science Since 18750.779110171185514LEU0.7711266831457340ILE0.777900131026839MET0.7812260421565440VAL0.78138426177078CYS0.7712035291558560ALA0.7919249002440772GLY0.86436522505373PRO0.7710177681315462GLU0.7712042731570743SER0.7711439251478447THR0.7811657571500427ASP40C20C面积比面积比A40/A20峰面积面积比面积比A40/A20峰面积40C20C0.768391831105530ARG0.69336837487433LYS0.7914316651819675HIS0.769958321315479PHE0.748509761156850TYR仪器:Shimadzu 氨基酸分析系统 (用OPA作柱后衍生)检测:RF-10AXL Super(Ex 350nm,Em 450nm)(池温度;20C,40C)检测检测 池温度对荧光检测器的影响池温度对荧光检测器的影响(2)SHIMADZU Solutions for Science Since 1875Bisphenol A 在各种溶剂中的荧光光谱(激发波长 270nm,使用背景校正)检测检测 溶剂对荧光灵敏度的影响溶剂对荧光灵敏度的影响甲醇甲醇乙腈乙腈波长SHIMADZU Solutions for Science Since 1875不冷却时不冷却时,抗坏血酸逐渐降解抗坏血酸逐渐降解.柱 :SCR-101N (250mmL.x 7.9mm I.D.)流动相 :10mM 草酸钠缓冲液(pH 3.8)，含有 1mM EDTA2Na 流速:1mL/min温度 :40C检测:UV-VIS(245nm)抗坏血酸峰面积的变化 样品样品 冷却可以防止样品降解冷却可以防止样品降解冷却未冷却SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 样品样品 样品溶剂对峰形的影响样品溶剂对峰形的影响(1)流路方向 甲醇溶剂被分析物流路方向 水溶剂被分析物*水水/甲醇作流动相的反相色谱甲醇作流动相的反相色谱不同样品溶剂对理论塔板数的 影响.水溶剂甲醇/H2O甲醇溶剂样品:10ul 咖啡因柱:Shim-pack CLC-ODS(150mmL.x 6mm I.D.)流动相:甲醇/H2O=3/7流速:1mL/min温度:室温.检测:270nm理论塔板数进样体积进样体积SHIMADZU Solutions for Science Since 1875左图左图.:.:样品溶剂样品溶剂 水水/乙腈乙腈=3/1(v/v)=3/1(v/v)右图右图.:.:样品溶剂样品溶剂 -乙腈乙腈Column :STR ODS-II(150mm L.x 4.6mm I.D.)Mobile :20mM citric acid(sodium)bufferPhase :solution(pH 4.5)/acetonitile=3/1(v/v)Flow rate:1mL/minTemp.:40CDetection:UV-VIS(240nm)样品样品 样品溶剂对峰形的影响样品溶剂对峰形的影响(2)如果样品溶剂比流动相强如果样品溶剂比流动相强,峰形恶化峰形恶化.SHIMADZU Solutions for Science Since 1875提高分析的准确度提高分析的准确度离线前处理很难保证完全一致,可能降低准确度简化操作简化操作离线处理需要很强的技能提高处理效率提高处理效率晚上也能进行自动前处理,可以极大的提高处理效率 样品样品 自动样品前处理的优点自动样品前处理的优点 SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 样品样品 HPLC柱切换系统柱切换系统 血样直接进样血样直接进样(Co-Sense for BA)泵分析柱自动进样反相内表面预处理柱反相内表面预处理柱Shim-Pack MAYI-ODSShim-Pack MAYI-ODS泵检测器流动相流动相稀释流路多聚体，例如蛋白 药物膜药物和内表面示意图SHIMADZU Solutions for Science Since 187508.517Time(min)蛋白蛋白蛋白蛋白异丙基异丙基异丙基异丙基肾肾肾肾上腺素上腺素上腺素上腺素进样体积 :100L流动相(进样路):0.1%磷酸/乙腈 =95/5(v/v)检测 :异丙基肾上腺素；275nm 血浆基质；280nm 样品样品 用用 Co-Sense对生物样品分析进行自动样品前处理对生物样品分析进行自动样品前处理 添加了添加了异丙基异丙基肾肾上腺素上腺素的血浆分析的血浆分析SHIMADZU Solutions for Science Since 1875血浆中分别添加血浆中分别添加 2mg/mL ketoprofen 和和naproxen 的回收率比较的回收率比较(50mL进样进样.)手动预处理手动预处理(添加乙腈添加乙腈)用用Co-Sense进行自动预处理进行自动预处理 样品样品 不同预处理方法的回收率比较不同预处理方法的回收率比较SHIMADZU Solutions for Science Since 1875原因:由于离子作用力或 配位异构力引起的对 金属离子的吸附(离子或者碱性化合物)清除吸附的化合物（洗针）控制吸附产生（使针惰性化）原因:由于树脂氢键力引起的吸附(脂溶性化合物)使用有机溶剂清洗转子密封槽改变转子密封材料来降低吸附 样品样品 过载的原因及控制过载的原因及控制使用自动进样器时交叉污染的原因及控制手段使用自动进样器时交叉污染的原因及控制手段SHIMADZU Solutions for Science Since 1875清洗此表面是重要的针清洗状态清洗状态进样状态进样状态样品环样品环泵泵柱柱洗针口洗针口针针针密封 样品样品 洗针机理洗针机理(全量进样全量进样)SHIMADZU Solutions for Science Since 1875若控制由于离子作用力或 配位异构力引起的对 金属离子的吸附(离子或者碱性化合物)酸化.大浓度的配位离子作离子对试剂.(例如)100mM 高氯酸水溶液/甲醇(或乙腈)由于疏水作用力引起的化合物吸附(树脂型化合物)有机溶剂清洗.*(例如)100%甲醇,乙腈,THF等.样品样品 洗针溶剂的选择洗针溶剂的选择SHIMADZU Solutions for Science Since 1875被分析物被分析物:氯乙醇氯乙醇(碱基化合物碱基化合物)进进 2 L 的标准溶液的标准溶液(含有含有 1.2mg/ml 溶解化合物的流动相溶解化合物的流动相),连续注射连续注射 2 L 的流动相的流动相,比较面积比较面积.柱：Shim-pack VP-ODS (150mmL.x 2.0mm I.D.)流动相：含有100mMNaClO4的 10mM 磷酸缓冲液(pH 2.6)/乙腈 =55/45(v/v)流速：0.2mL/min温度：40C检测：UV(260nm，using semi micro cell)样品样品 降低由于碱性物质引起的交叉污染降低由于碱性物质引起的交叉污染(1)0.04250.0004251W/O Wash0.07300.0007301W/Wash空白空白标准溶液标准溶液交叉污染交叉污染%相对峰面积相对峰面积针密封:SUS清洗液:流动相洗针程序:1.在洗针口浸洗 3 sec.2.吸样品液.3.在洗针口浸洗 3 sec.4.进样.SHIMADZU Solutions for Science Since 1875不同惰性化不同惰性化SUS针密封方法的比较针密封方法的比较0.00230.0000231特富龙涂层0.04250.0004251SUS0.00090.0000091特殊的金属涂层0.00210.0000211PEEK 涂层BlankStandard Solution交叉污染交叉污染%相对面积浸入洗液 3 sec.其他条件同上页相同.样品样品 降低由于碱性物质引起的交叉污染降低由于碱性物质引起的交叉污染(2)SHIMADZU Solutions for Science Since 1875进 2L 流动相的色谱图 样品样品 降低由于碱性物质引起的交叉污染降低由于碱性物质引起的交叉污染(3)在分析氯乙醇时在分析氯乙醇时(碱基化合物碱基化合物),通过浸洗针和针表面特殊的金属涂层，交通过浸洗针和针表面特殊的金属涂层，交叉污染从叉污染从 0.07%降低到降低到 0.001%!(随着化合物种类,浓度和进样体积变化而变化)进 2L 标准溶液的色谱图*色谱图纵坐标的满刻度不一样色谱图纵坐标的满刻度不一样.chlorohexidinchlorohexidinSHIMADZU Solutions for Science Since 1875疏水性化合物吸附被认为主要在通过样品的转子密封槽.由于流动相一直在洗这些吸附物,污染会逐渐流出.样品环样品环泵泵柱柱针针转子密封转子密封 样品样品 降低由于疏水物质引起的交叉污染降低由于疏水物质引起的交叉污染(1)SHIMADZU Solutions for Science Since 1875被分析物被分析物:Vitamin A Acetate 进进 10L 的标准溶液的标准溶液（10g/mL:甲醇溶解甲醇溶解）,然后进然后进 10L 的空白溶液的空白溶液(甲甲醇醇),并比较峰面积并比较峰面积.柱:Shim-Pack FC-ODS(75mmL.x 4.6mmI.D.）流动相:(A);水,(B);甲醇 0-2min,B 溶液 75%,保持 2-5min,B solution 75-100%,线性梯度 5-10min,B 溶液100%,保持流速:0.5mL/min温度:50C检测:UV(325nm)样品样品 降低由于疏水物质引起的交叉污染降低由于疏水物质引起的交叉污染(2)SHIMADZU Solutions for Science Since 1875使用使用 PEEK材质的转子密封材质的转子密封,甚至老化甚至老化 20 分钟后分钟后,几乎观察不到交叉污染几乎观察不到交叉污染.样品样品 降低由于疏水物质引起的交叉污染降低由于疏水物质引起的交叉污染(3)空白进样10L的色谱图标准溶液进样10L的色谱图*色谱图纵坐标的满刻度不一样色谱图纵坐标的满刻度不一样SHIMADZU Solutions for Science Since 1875 样品样品 高效自动进样器高效自动进样器 SIL-HT降低交叉污染降低交叉污染优化针优化针,转子密封等的材料转子密封等的材料.可以使用清洗模式可以使用清洗模式多样品处理多样品处理2 个样品架个样品架/4 微孔板微孔板最大样品数最大样品数:用用1.0mL瓶可放瓶可放350 个样品个样品 4个个384-孔的孔的 微孔板可放微孔板可放 1536个个 样品样品 高速进样高速进样15 秒进样一次秒进样一次(10 L)!具有高性能的计量装置具有高性能的计量装置全量进样模式全量进样模式 理想的理想的LC-MS自动进样器自动进样器