《SNP分型技术》PPT课件.ppt

SNP分型技术简介分型技术简介SNP概念概念 单核苷酸多核苷酸多态性性(single nucleotide polymorphism，SNP),主要是指主要是指在基因在基因组水平上由水平上由单个核苷酸的个核苷酸的变异所引起的异所引起的DNA序列多序列多态性。性。SNP在人在人类基因基因组中广泛存在，平均每中广泛存在，平均每5001000个碱基个碱基对中就中就有有1个，估个，估计其其总数可达数可达300万个甚至更多。万个甚至更多。包括单个碱基的转换、颠换、插入和缺失等转换：同型碱基之间 A-G 腺嘌呤-鸟嘌呤 T-C 胸腺嘧啶-胞嘧啶颠换：嘌呤与嘧啶之间A-T、A-C、C-G、G-T插入的图片人体人体许多表型差异、多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能物或疾病的易感性等等都可能与与SNP有关。有关。心脏病、癌症、糖尿病、精神病等复杂性疾病是心脏病、癌症、糖尿病、精神病等复杂性疾病是遗传和遗传和环境综合作用环境综合作用的结果。目前，发现这些多基因疾病微效的结果。目前，发现这些多基因疾病微效基因最有力的方法是对病例组和对照组等位基因频率进基因最有力的方法是对病例组和对照组等位基因频率进行统计学比较，行统计学比较，SNP是这种分析很好的一种标记。是这种分析很好的一种标记。SNP分型技术分型技术4其他检测方法其他检测方法质谱分析质谱分析SNaPshotLDR2基于荧光定量基于荧光定量PCR 的检测方法的检测方法TaqMan探针法探针法HRM3直接测序法直接测序法1基于电泳的检测方法基于电泳的检测方法PCR-RFLPPCR-SSCPAS-PCRPCR-RFLP由于碱基的变异可能导致酶切点的消失或新的切点出现，从由于碱基的变异可能导致酶切点的消失或新的切点出现，从而引起不同个体在用同一限制酶切时，而引起不同个体在用同一限制酶切时，DNA片段长度出现差片段长度出现差异，这种因内切酶切点变化所导致的异，这种因内切酶切点变化所导致的DNA片段长度的差异，片段长度的差异，称限制性片段长度多态性称限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymporphism,RFLP）。）。该技术应用的前提是该技术应用的前提是SNP的位点必须含有该限制内切酶的识的位点必须含有该限制内切酶的识别位点，它是别位点，它是SNP筛查中最经典的方法之一。筛查中最经典的方法之一。PCR-RFLPv原理：原理：v利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，用限制利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，用限制性内切酶作用于同一性内切酶作用于同一DNA片断，如果存在片断，如果存在SNP位位点，酶切片断的长度和数量则会出现差异，根据点，酶切片断的长度和数量则会出现差异，根据电泳的结果就可以判断是否电泳的结果就可以判断是否SNP位点。位点。PCR扩增扩增目的片段目的片段限制性内切酶限制性内切酶酶切目的片段酶切目的片段电泳分离电泳分离rs1800629PCR-RFLP分析rs1800629 RFLP 结果结果单链构象多态性法单链构象多态性法 PCR-SSCP原理：原理：单链单链DNA在中性条件下会形成二级结构，不同的二在中性条件下会形成二级结构，不同的二级结构在电泳中会出现不同的迁移率。级结构在电泳中会出现不同的迁移率。这种二级结构依赖于碱基的组成，单个碱基的改变这种二级结构依赖于碱基的组成，单个碱基的改变也会影响其构象，最终会导致在凝胶上迁移速度的也会影响其构象，最终会导致在凝胶上迁移速度的改变。改变。经经PCR扩增的目的片段在单链状态下，因其单个碱扩增的目的片段在单链状态下，因其单个碱基差异，所形成的空间构象不同，其在非变性聚丙基差异，所形成的空间构象不同，其在非变性聚丙稀酰胺凝胶中泳动速度不一样，从而显示出带型的稀酰胺凝胶中泳动速度不一样，从而显示出带型的差异，即多态型差异，即多态型保持在保持在单链状状态非非变性性凝胶凝胶电泳泳构象不同构象不同呈呈现多多态性性单链构象多态性法单链构象多态性法 PCR-SSCP单链构象多态性单链构象多态性(SSCP)分析分析14、79：野生型基因片段；5、6：两例Val384Asp携带者的样本，显示变异的SSCP带型等位基因特异等位基因特异 PCR(AS-PCR)原理：原理：根据根据 SNP位点设计特异位点设计特异性性引物引物。其中特异链的其中特异链的3末末端与端与 SNP位点的碱基互补位点的碱基互补(或相同或相同)，另一条普通链另一条普通链按常规方法进行设计按常规方法进行设计。因为特异引物在一种基因型中有扩增产物因为特异引物在一种基因型中有扩增产物，在另一在另一种基因型中没有扩增产物种基因型中没有扩增产物，用凝胶电泳就能够很容用凝胶电泳就能够很容易地分辨出扩增产物的有无易地分辨出扩增产物的有无，从而确定从而确定基因型。基因型。等位基因特异等位基因特异 PCR(AS-PCR)TaqMan 技术技术原理：原理：TaqMan 荧光探针是一种寡核苷酸探针，报告基团在探针的荧光探针是一种寡核苷酸探针，报告基团在探针的5末端，淬灭基团在末端，淬灭基团在3末端。末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针。针。PCR扩增时，探针酶切降解，报告基团和淬灭基团分离，扩增时，探针酶切降解，报告基团和淬灭基团分离，发出荧光信号。每扩增一条发出荧光信号。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。产物形成完全同步。如果探针与目标序列中存在错配碱基，就会影响其释放荧光如果探针与目标序列中存在错配碱基，就会影响其释放荧光的强度，可以通过检测反应液中的荧光强度确定基因型的强度，可以通过检测反应液中的荧光强度确定基因型TaqMan 技术技术HRMHRM的主要原理是根据的主要原理是根据DNA序列的序列的长度、度、GC含量以及碱基含量以及碱基互互补性差异，性差异，应用高分辨率熔解曲用高分辨率熔解曲线对样品品进行分析，其行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个个碱基差异的区分。碱基差异的区分。1、核酸提取与均一化、核酸提取与均一化2、PCR设计与与优化化 （引物、条件）（引物、条件）3、qRT-PCR4、Sample Melt(结果果检 查，HRM数据收集数据收集)5、数据分析、数据分析The HRM Analysis WorkflowHRM图图7 50%-95%AA模板熔解曲线图模板熔解曲线图 图图6 5%-50%AA模板熔解曲线图模板熔解曲线图HRM 敏感度敏感度直接测序法直接测序法SNP分型的金标准其他检测方法其他检测方法质谱分析质谱分析SNaPshot连接酶检测反应连接酶检测反应（LDR）?Thank You!