第九章聚合酶链反应及相关技术精选PPT.ppt

第九章聚合酶链反应及相关技术第1页，本讲稿共86页聚合酶链反应于二十世纪聚合酶链反应于二十世纪8080年代由年代由K.MullisK.Mullis建立，并建立，并和定点突变的发明者和定点突变的发明者M.SmithM.Smith一起荣获一起荣获19931993年度年度 诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。代。第2页，本讲稿共86页第一节 聚合酶链反应第二节 以PCR为基础的相关技术第三节 PCR产物的检测第3页，本讲稿共86页第一节第一节 聚合酶链反应聚合酶链反应第4页，本讲稿共86页聚合酶链反应（聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCRpolymerase chain reaction,PCR）是）是DNADNA体外复制反应，基本原理与细胞内体外复制反应，基本原理与细胞内DNADNA的复制相似的复制相似 第一节 聚合酶链反应第5页，本讲稿共86页第一节 聚合酶链反应一、PCR反应原理、反应过程和特点二、PCR的反应体系三、PCR的反应条件四、PCR技术的质量控制第6页，本讲稿共86页一、一、PCRPCR反应原理和反应过程反应原理和反应过程1.1.原理原理 DNA DNA的体外复制包括的体外复制包括3 3个步骤：个步骤：变性（变性（denaturationdenaturation）:94:94 C C9595 C C退火（退火（annealingannealing）:40 :40 C C7070 C C 延伸（延伸（extensionextension）:72 :72 C C 第7页，本讲稿共86页变性变性:DNA:DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链分子作为双螺旋的氢键断裂，形成单链分子作为 反应的反应的模板模板 退火退火:引物与模板互补结合，形成杂交链引物与模板互补结合，形成杂交链 延伸延伸:按照模板链的序列以互补的方式依次把按照模板链的序列以互补的方式依次把dNTPdNTP加至引加至引物的物的3 3端，端，Taq DNATaq DNA聚合酶使杂交双链不断延伸，直至形聚合酶使杂交双链不断延伸，直至形成新的成新的DNADNA双链双链 一、一、PCRPCR反应原理和反应过程反应原理和反应过程第8页，本讲稿共86页5533d.NTPs耐热DNA聚合酶引物5353535353535353535353535353退火退火加入试管中加入试管中添加反应混合液及样本变性一、一、PCRPCR反应原理和反应过程反应原理和反应过程第9页，本讲稿共86页53535353535355TaqTaq353TaqTaq55循环循环延伸继续延伸一、一、PCRPCR反应原理和反应过程反应原理和反应过程第10页，本讲稿共86页5353535355335353第二个循环4个拷贝第三个循环8个拷贝53535353535353535353533553535353第n个循环2n个拷贝一、一、PCRPCR反应原理和反应过程反应原理和反应过程第11页，本讲稿共86页2.特点特异性强特异性强 引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性 灵敏度高灵敏度高 指数增长，从指数增长，从pg(10pg(10-12-12)可扩增至可扩增至 mg(10 mg(10-6-6)水平水平 简便、快速简便、快速 2 24 4 小时完成扩增反应小时完成扩增反应一、PCR反应原理和反应过程第12页，本讲稿共86页二、二、PCRPCR的反应体系的反应体系参与PCR反应的主要成份:1.模板2.引物3.脱氧核苷三磷酸4.Taq DNA聚合酶5.镁离子浓度6.其它反应因素第13页，本讲稿共86页1.1.模板（模板（templatetemplate）基因组基因组DNADNA、RNARNA、质粒、质粒DNADNA、线粒体、线粒体DNADNA等等RNARNA作为模板时，须先将作为模板时，须先将RNARNA逆转录为逆转录为cDNA cDNA 模板量：模板量：1000ng1000ng、500ng500ng、100ng100ng、50ng50ng反应体系中较低量的模板有利于提高扩增产反应体系中较低量的模板有利于提高扩增产量和减少非特异性扩增量和减少非特异性扩增 二、PCR的反应体系第14页，本讲稿共86页2.2.引物引物(primer)(primer)化学合成的寡核苷酸化学合成的寡核苷酸与模板特异地结合与模板特异地结合决定产物的特异性和长度决定产物的特异性和长度二、PCR的反应体系第15页，本讲稿共86页设计引物的原则设计引物的原则(一一)两条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正两条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补负链序列互补长度为长度为18182525个核苷酸个核苷酸二条引物之间避免形成引物二聚体二条引物之间避免形成引物二聚体引物浓度：引物浓度：0.10.10.20.2mol/Lmol/L，浓度过高容易生成引物，浓度过高容易生成引物二聚体二聚体二、PCR的反应体系第16页，本讲稿共86页设计引物的原则设计引物的原则(二二)引物的碱基组成应平衡，引物的碱基组成应平衡，C+G C+G 碱基含量在引物中的碱基含量在引物中的比例一般以比例一般以45%45%55%55%为宜为宜 引物退火温度计算：引物退火温度计算：Tm=2Tm=2（A+TA+T）+4+4（C+GC+G）引物的引物的5 5端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记）生物素等标记）二、PCR的反应体系第17页，本讲稿共86页3.3.脱氧核苷三磷酸（脱氧核苷三磷酸（dNTPdNTP）dATPdATP、dCTPdCTP、dGTPdGTP和和dTTPdTTP的混合物的混合物 反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致 浓度过高虽能加快反应速度，但非特异性扩浓度过高虽能加快反应速度，但非特异性扩增也随之增加增也随之增加 最适浓度：最适浓度：2020200mol/L200mol/L二、PCR的反应体系第18页，本讲稿共86页4.4.Taq Taq DNADNA聚合酶聚合酶 从一种生活在热泉（从一种生活在热泉（80809090）中的水栖噬）中的水栖噬热菌（热菌（Thermus aquaticus,TaqThermus aquaticus,Taq）中提取，有很高的）中提取，有很高的耐热稳定性耐热稳定性 二、PCR的反应体系第19页，本讲稿共86页Taq Taq 酶的作用酶的作用:在模板指导下，以在模板指导下，以dNTPdNTP为原料，在引物为原料，在引物3 3-OH-OH末端加上末端加上脱氧单核苷酸，形成脱氧单核苷酸，形成3 3,5,5-磷酸二酯键，使磷酸二酯键，使DNADNA链沿链沿5 5 3 3方向延伸，催化方向延伸，催化DNADNA合成合成 最适酶量：最适酶量：1 12.5U2.5U二、PCR的反应体系第20页，本讲稿共86页Taq DNATaq DNA聚合酶无聚合酶无3 3 5 5外切酶活性，因而无校正功外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配能，在复制新链的过程中会发生碱基错配 Taq DNATaq DNA聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为1/300001/30000，碱基替换率为，碱基替换率为1/80001/8000，因此扩增的片段越长，错配的机，因此扩增的片段越长，错配的机率越高率越高 二、二、PCRPCR的反应的反应体系体系第21页，本讲稿共86页耐热的高保真耐热的高保真 DNA DNA多聚合酶：多聚合酶：Pwo DNA polymerase Pwo DNA polymerase Tth DNA polymerase Tth DNA polymerase Pfu DNA polymerase Pfu DNA polymerase高热稳定性，高保真性，能降低碱基错配率高热稳定性，高保真性，能降低碱基错配率二、二、PCRPCR的反应体系的反应体系第22页，本讲稿共86页5.5.镁离子浓度镁离子浓度对反应系统本身、稳定核苷酸和提高对反应系统本身、稳定核苷酸和提高Taq Taq 酶的活性有酶的活性有直接影响直接影响PCRPCR反应体系中反应体系中dNTPdNTP、引物、模板、引物、模板DNADNA及鳌合剂均可与及鳌合剂均可与MgMg2+2+结合，降低游离结合，降低游离MgMg2+2+的浓度，影响酶的活性的浓度，影响酶的活性dNTPdNTP浓度为浓度为200mol/L200mol/L时，时，MgClMgCl2 2浓度为浓度为1.5mmol/L1.5mmol/L较宜较宜二、PCR的反应体系第23页，本讲稿共86页6.6.其它反应因素其它反应因素pHpH：反应所需的最适：反应所需的最适pHpH值在值在7.27.2左右左右 盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物与模盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物与模板杂交板杂交 基质：牛血清白蛋白、明胶、基质：牛血清白蛋白、明胶、Tween20Tween20、DTTDTT等等 二、PCR的反应体系第24页，本讲稿共86页三、三、PCRPCR的反应条件的反应条件 1.反应温度（变性、退火、延伸）2.反应时间（变性、退火、延伸）3.循环次数（PCR效率及产物量）4.PCR过程的实时监测第25页，本讲稿共86页1.1.反应温度反应温度 变性温度：变性温度：94949797退火温度：低于引物退火温度：低于引物Tm Tm 55左右左右 温度过高：降低扩增效率温度过高：降低扩增效率 温度过低：增加非特异性扩增温度过低：增加非特异性扩增延伸温度：延伸温度：7272三、PCR的反应条件第26页，本讲稿共86页2.2.反应时间反应时间 第一次变性应给予足够时间第一次变性应给予足够时间每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，时间每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，时间过长易导致非特异性扩增过长易导致非特异性扩增三、PCR的反应条件第27页，本讲稿共86页3.3.循环次数循环次数 一般设为一般设为25253535个循环个循环每一个循环使一个分子的模板被复制为二个，产物每一个循环使一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长量以指数形式增长三、PCR的反应条件第28页，本讲稿共86页一个分子的模板经过一个分子的模板经过3030个循环，理论上即可得个循环，理论上即可得2 23030(约约10109 9)个拷贝产物个拷贝产物 实际反应中，每个循环的扩增效率大多约为实际反应中，每个循环的扩增效率大多约为85%85%左左右右三、三、PCRPCR的反应条件的反应条件第29页，本讲稿共86页扩增反应的平台效应：扩增反应的平台效应：PCR PCR反应产物呈指数性增长，但这种增长形式在扩反应产物呈指数性增长，但这种增长形式在扩增增25253535个循环以后便放慢直至停止，达到反应个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而平台，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长。呈指数增长。三、三、PCRPCR的反应条件的反应条件第30页，本讲稿共86页n指数增长期n线形增长期n平台期循环数 理论值 实际值Log 产物DNA4.PCR实时监测三、PCR的反应条件第31页，本讲稿共86页平台出现得迟早与模板的初始量有关，模板初始量平台出现得迟早与模板的初始量有关，模板初始量越多，平台出现得越早越多，平台出现得越早平台效应产生的因素：平台效应产生的因素：引物二聚体的产生引物二聚体的产生 反应体系各组分的消耗反应体系各组分的消耗 引物和已扩增的引物和已扩增的DNADNA片段间的竞争等片段间的竞争等三、三、PCRPCR的反应条件的反应条件第32页，本讲稿共86页四、四、PCRPCR技术的质量控制技术的质量控制1.1.实验室的规范化设置实验室的规范化设置试剂贮存和准备区试剂贮存和准备区 标本制备区标本制备区 扩增反应区扩增反应区 产物分析区产物分析区 第33页，本讲稿共86页2.2.防污染体系：防污染体系：正确设置实验室、严格规范实验操作、完整有效正确设置实验室、严格规范实验操作、完整有效的去污染措施的去污染措施 反应体系中以反应体系中以dUTPdUTP取代取代dTTPdTTP，加入尿嘧啶糖苷酶，加入尿嘧啶糖苷酶（UNGUNG），破坏以往的扩增产物），破坏以往的扩增产物 每次实验完毕后须用每次实验完毕后须用1g/L1g/L次氯酸钠清洁实验台面，次氯酸钠清洁实验台面，或用或用254nm254nm波长的紫外光近距离充分照射波长的紫外光近距离充分照射 四、四、PCRPCR技术的质量控制技术的质量控制第34页，本讲稿共86页3.PCR3.PCR技术的质量保证技术的质量保证基因扩增检验的全过程的质量保证基因扩增检验的全过程的质量保证 分析前分析前 分析中分析中 分析后分析后室内质量控制和室间质量评价室内质量控制和室间质量评价四、PCR技术的质量控制第35页，本讲稿共86页第二节第二节 以以PCRPCR为基础的相关技术为基础的相关技术第36页，本讲稿共86页第二节第二节 以以PCRPCR为基础的相关技术为基础的相关技术一、逆转录PCR二、定量PCR三、多重PCR四、PCR诱导定点突变五、连接酶链式反应六、随机扩增多态性DNA第37页，本讲稿共86页一、逆转录一、逆转录PCRPCR（RT-PCRRT-PCR）以细胞内总以细胞内总RNARNA或或mRNAmRNA为材料进行体外扩增的为材料进行体外扩增的技术技术主要用于克隆主要用于克隆 cDNA cDNA、合成、合成cDNAcDNA探针，检测探针，检测RNARNA病毒、分析基因表达等病毒、分析基因表达等第38页，本讲稿共86页逆转录合成逆转录合成cDNAcDNA所用的引物：所用的引物：以以PCRPCR扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物以以oligo(dT)oligo(dT)作为引物作为引物以人工合成的随机序列（六核苷酸混合物）作为引以人工合成的随机序列（六核苷酸混合物）作为引物物一、逆转录PCR（RT-PCR）第39页，本讲稿共86页一、逆转录一、逆转录PCRPCR第40页，本讲稿共86页二、定量二、定量PCR(quantitative PCR)PCR(quantitative PCR)对对DNADNA或或RNARNA样本的靶序列进行定量分析样本的靶序列进行定量分析主要用于基因表达的分析、病原体核酸的检测等主要用于基因表达的分析、病原体核酸的检测等第41页，本讲稿共86页荧光定量荧光定量PCRPCR（fluorescence quantitative PCR,FQ-fluorescence quantitative PCR,FQ-PCRPCR），又称实时），又称实时PCR(real-time PCR)PCR(real-time PCR)FQ-PCRFQ-PCR通过荧光信号对通过荧光信号对PCRPCR过程中的产物量进行实过程中的产物量进行实时监测，精确计算出时监测，精确计算出PCRPCR的初始模板量的初始模板量 二、定量二、定量PCRPCR第42页，本讲稿共86页荧光信号的检测方法荧光信号的检测方法二、定量PCR1.DNA结合染料技术2.水解探针技术3.杂交探针技术4.分子信标技术第43页，本讲稿共86页1.DNA1.DNA结合染料技术结合染料技术PCRPCR反应体系中加入反应体系中加入SYBR Green ISYBR Green I染料，能选择性地染料，能选择性地掺入至双链掺入至双链DNADNA分子中，并且产生强烈荧光分子中，并且产生强烈荧光 PCRPCR过程中，过程中，SYBR Green ISYBR Green I染料结合到新合成的双染料结合到新合成的双链链DNADNA分子中，结合的荧光信号和分子中，结合的荧光信号和DNADNA含量成正比含量成正比 二、定量PCR第44页，本讲稿共86页二、定量PCR第45页，本讲稿共86页优点：成本较低，无须对引物或探针进行特殊的荧光标记，优点：成本较低，无须对引物或探针进行特殊的荧光标记，操作亦比较简单操作亦比较简单 缺点：特异性不够，染料分子会结合到非特异性扩增产生缺点：特异性不够，染料分子会结合到非特异性扩增产生的双链分子和引物二聚体中，使反应体系中的荧光本底较的双链分子和引物二聚体中，使反应体系中的荧光本底较高高 二、定量PCR第46页，本讲稿共86页2.2.水解探针技术技术水解探针技术技术 荧光素标记探针荧光素标记探针 探针的探针的5 5端和端和3 3端分别标记荧光报告基团端分别标记荧光报告基团R R和荧光淬灭和荧光淬灭基团基团Q Q 探针完整时探针完整时R R基团与基团与Q Q基团分别位于探针的二端，基团分别位于探针的二端，Q Q基团抑制基团抑制R R基团使其不能发射荧光基团使其不能发射荧光 二、定量PCR第47页，本讲稿共86页荧光信号检测荧光信号检测 PCR PCR过程中，过程中，Taq DNATaq DNA聚合酶沿模板移动，其聚合酶沿模板移动，其 5 533外切核酸酶活性，可逐个水解脱氧核外切核酸酶活性，可逐个水解脱氧核 苷三磷酸，苷三磷酸，R R基团与基团与Q Q基团随之分离基团随之分离 R R基团不再受基团不再受Q Q基团的抑制便发射荧光，基团的抑制便发射荧光，R R基团信基团信 号强弱的程度与号强弱的程度与PCRPCR反应产物的拷贝数成正比反应产物的拷贝数成正比 二、定量PCR第48页，本讲稿共86页水水 解解 探探 针针 技技 术术二、定量PCR第49页，本讲稿共86页二、定量PCR第50页，本讲稿共86页3.3.杂交探针技术（杂交探针技术（hybridization probehybridization probe）反应体系需要反应体系需要2 2条探针条探针 探探针针A A的的3 3端端标标以以荧荧光光素素作作为为荧荧光光染染料料供供体体；探探针针B B的的5 5端标以另一种染料，作为荧光染料受体。端标以另一种染料，作为荧光染料受体。2 2个个探探针针的的序序列列头头尾尾排排列列，并并且且相相距距仅仅间间隔隔1 1个个碱碱基基，从而能够进行荧光共振能量的转移从而能够进行荧光共振能量的转移 二、定量PCR第51页，本讲稿共86页外外来来光光源源首首先先刺刺激激供供体体荧荧光光染染料料，供供体体便便发发光光刺刺激激附附近近的的受受体体荧荧光光染染料料，使使后后者者再再发发射射出出具具另另一一种波长的信号而被检测系统接收种波长的信号而被检测系统接收 受受体体荧荧光光染染料料在在2 2个个探探针针都都与与模模板板杂杂交交时时才才会会被被激激发而发射荧光信号发而发射荧光信号 二、定量PCR第52页，本讲稿共86页分子信标是一段荧光素标记的寡核苷酸分子信标是一段荧光素标记的寡核苷酸环状区环状区(15(153030个核苷酸个核苷酸)柄区柄区(5(58 8个碱基对个碱基对)组成组成5 5末端标记荧光基团末端标记荧光基团3 3末端标记淬灭基团末端标记淬灭基团4.分子信标技术（molecular beacon）二、定量PCR第53页，本讲稿共86页在自由状态下，分子信标的结构呈发夹状，两端的在自由状态下，分子信标的结构呈发夹状，两端的基团相距较近，荧光基团将能量转移给淬灭基团而基团相距较近，荧光基团将能量转移给淬灭基团而使荧光淬灭，荧光本底极低使荧光淬灭，荧光本底极低 当分子信标与序列互补的靶分子结合时，分子信标的构当分子信标与序列互补的靶分子结合时，分子信标的构型发生变化，柄部被打开，从而使荧光基团远离淬灭基型发生变化，柄部被打开，从而使荧光基团远离淬灭基团而发射荧光团而发射荧光 二、定量PCR第54页，本讲稿共86页分子信标技术原理R二、定量PCR第55页，本讲稿共86页定量 PCR参照系统二、定量PCR1.外参照系统的设置2.内参照系统的设置第56页，本讲稿共86页1.1.外参照系统外参照系统CtCt值值(cycle threshold)(cycle threshold)扩扩增增曲曲线线与与荧荧光光本本底底基基线线的的交交叉叉点点处处相相应应的的反反应应循循环环数数,即即每每个个反反应应管管内内的的荧荧光光信信号号到到达达设设定定的的域域值值时时所所经经历历的的循环数循环数 CtCt值值与与模模板板的的起起始始拷拷贝贝数数的的对对数数存存在在线线性性反反比比关关系系，起起始拷贝数越多，始拷贝数越多，CtCt值越小值越小 二、定量PCR第57页，本讲稿共86页相同模板进行96次扩增的扩增曲线图二、定量PCR第58页，本讲稿共86页利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值 获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数 二、定量PCR第59页，本讲稿共86页2.2.内参照系统内参照系统内标准品内标准品:一段人为地引入了突变序列的靶基因片段一段人为地引入了突变序列的靶基因片段 内标准品加入被检样品中一起抽提、扩增内标准品加入被检样品中一起抽提、扩增 内标准品和靶基因的探针分别用内标准品和靶基因的探针分别用2 2种不同的荧光染种不同的荧光染料标记，二者探针杂交的序列不同料标记，二者探针杂交的序列不同 二、定量PCR第60页，本讲稿共86页同一对引物同时扩增靶基因和内标准品，双通道荧光检测同一对引物同时扩增靶基因和内标准品，双通道荧光检测系统可以特异地同时检测出内标准品和靶基因的扩增产物，系统可以特异地同时检测出内标准品和靶基因的扩增产物，计算出靶基因起始拷贝数计算出靶基因起始拷贝数 内参照系统避免了由于不同抽提效率导致的样本间的差异，内参照系统避免了由于不同抽提效率导致的样本间的差异，使结果的重复性更好，定量更为准确使结果的重复性更好，定量更为准确,但仍不能监控内但仍不能监控内标准品和靶基因是否有一致的扩增效率标准品和靶基因是否有一致的扩增效率 二、定量PCR第61页，本讲稿共86页三、多重三、多重PCR(multiplex PCR)PCR(multiplex PCR)在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增一份在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增一份 DNA DNA样本中多个靶片段样本中多个靶片段第62页，本讲稿共86页四、四、PCRPCR诱导定点突变诱导定点突变1.1.引入点突变引入点突变ABABP2P1PCR用酶A和B消化，将突变位点引入PCR产物第63页，本讲稿共86页2.引入大片段缺失四、PCR诱导定点突变第64页，本讲稿共86页五、连接酶链反应(LCR）空隙LCR 引物与模板特异性互补引物A和B之间、a和b之间有一段空隙空隙在DNA聚合酶的作用下特异性延伸连接酶连接缺口 第65页，本讲稿共86页六、随机扩增多态性六、随机扩增多态性DNA(RAPD)DNA(RAPD)RAPDRAPD是一种在整个基因组是一种在整个基因组DNADNA内进行随机扩增而获得多态内进行随机扩增而获得多态性长度性长度DNADNA片段的技术片段的技术 用一条随机序列的引物与模板用一条随机序列的引物与模板DNADNA序列作随机配对，反应过序列作随机配对，反应过程中随机引物只有在与模板程中随机引物只有在与模板DNADNA互补后，在足够近的间距互补后，在足够近的间距(200(2002000bp)2000bp)内、方向相对的两个引物片段之间的模内、方向相对的两个引物片段之间的模板板DNADNA序列才能被扩增序列才能被扩增 第66页，本讲稿共86页六、随机扩增多态性六、随机扩增多态性DNADNA不同个体不同个体DNADNA序列之间存在差异或发生突变，经扩增序列之间存在差异或发生突变，经扩增所得到的产物片段长度会有所不同，经过电泳分离便所得到的产物片段长度会有所不同，经过电泳分离便可以发现这种差异，从而可了解和比较两个生物体之可以发现这种差异，从而可了解和比较两个生物体之间基因组间基因组DNADNA的结构等信息的结构等信息 第67页，本讲稿共86页 随机扩增多态性DNA六、随机扩增多态性六、随机扩增多态性DNADNA第68页，本讲稿共86页RAPDRAPD的应用的应用种群生物学研究种群生物学研究基因组基因组DNADNA图谱构建图谱构建遗传鉴定遗传鉴定临床致病菌的流行病学检测和分型临床致病菌的流行病学检测和分型DNADNA指纹鉴定指纹鉴定 六、随机扩增多态性六、随机扩增多态性DNADNA第69页，本讲稿共86页第三节第三节 PCR PCR产物的检测产物的检测第70页，本讲稿共86页第三节第三节 PCR PCR产物的检测产物的检测一、PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）二、等位基因特异性寡核苷酸（ASO）三、单链构象多态性（SSCP）四、变性梯度凝胶电泳（DGGE）五、融点曲线分析(melting curve analysis)六、PCR产物的序列分析（sequencing）第71页，本讲稿共86页一、一、PCR-限制性片段长度多态性PCR-RFLPPCR-RFLP是对是对PCRPCR产物作限制性片段长度多态性分产物作限制性片段长度多态性分析析根据根据PCRPCR产物的突变序列是否位于限制性内切酶的酶切产物的突变序列是否位于限制性内切酶的酶切位点内而设计位点内而设计突变点在某一限制性内切酶的酶切位点序列时，可突变点在某一限制性内切酶的酶切位点序列时，可在突变点的二侧设计引物，或通过改变引物序列使在突变点的二侧设计引物，或通过改变引物序列使扩增产物产生（或消失）酶切位点扩增产物产生（或消失）酶切位点第72页，本讲稿共86页用相应的内切酶对扩增产物进行水解并作电泳分离，用相应的内切酶对扩增产物进行水解并作电泳分离，PCRPCR产物能（或不能）被酶水解而产生不同长度的片产物能（或不能）被酶水解而产生不同长度的片段段根据水解片段的大小和相应电泳位置可区分野生根据水解片段的大小和相应电泳位置可区分野生型和突变型靶基因片段型和突变型靶基因片段一、一、PCR-限制性片段长度多态性第73页，本讲稿共86页EcoRI水解ABCABC一、一、PCR-限制性片段长度多态性第74页，本讲稿共86页二、二、等位基因特异性寡核苷酸用寡核苷酸探针和用寡核苷酸探针和PCRPCR产物进行杂交检测点突变的产物进行杂交检测点突变的技术技术被检靶片段经被检靶片段经PCRPCR扩增并经电泳分离后转移到膜上，扩增并经电泳分离后转移到膜上，分别与经标记的野生型和突变型靶基因序列的寡分别与经标记的野生型和突变型靶基因序列的寡核苷酸探针杂交核苷酸探针杂交第75页，本讲稿共86页PCRPCR产物仅与完全互补的探针进行杂交产物仅与完全互补的探针进行杂交含突变序列的产物仅与突变探针杂交含突变序列的产物仅与突变探针杂交根据有无杂交信号判断被检扩增片段中是否根据有无杂交信号判断被检扩增片段中是否带有突变点带有突变点二、等位基因特异性寡核苷酸第76页，本讲稿共86页二、二、等位基因特异性寡核苷酸第77页，本讲稿共86页不同顺序 不同构象 不同电泳行为三、三、单链构象多态性 单链单链DNADNA分子的空间构象，取决于该分子本身的碱基分子的空间构象，取决于该分子本身的碱基组成组成 突变突变DNADNA的的PCRPCR产物经变性后产生与正常产物经变性后产生与正常DNADNA空间构象空间构象不同的两条单链不同的两条单链 不同构象的单链片段具有不同的电泳迁移率，因而能区不同构象的单链片段具有不同的电泳迁移率，因而能区别正常与突变的别正常与突变的DNA DNA 第78页，本讲稿共86页 SSCP技术检测DNA突变三、三、单链构象多态性第79页，本讲稿共86页DGGEDGGE是一种筛选单碱基突变及多态性的方法是一种筛选单碱基突变及多态性的方法 DNADNA分子被加热至其融点温度时双链被部分解链。融点温分子被加热至其融点温度时双链被部分解链。融点温度取决于度取决于DNADNA分子本身的序列，野生型和突变型分子本身的序列，野生型和突变型DNADNA双链双链具有不同的融点温度具有不同的融点温度 四、变性梯度凝胶电泳第80页，本讲稿共86页设计引物时使被扩增的靶基因片段的二端含有不同的设计引物时使被扩增的靶基因片段的二端含有不同的TmTm值值 将将PCRPCR产物在含有梯度浓度变性剂的聚丙烯酰产物在含有梯度浓度变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中电泳胺凝胶中电泳 当泳动至变性剂相应浓度的位置时，产物片段中当泳动至变性剂相应浓度的位置时，产物片段中TmTm值较低一端的双链被部分解链，使该片段的电值较低一端的双链被部分解链，使该片段的电泳迁移率大大降低泳迁移率大大降低 四、变性梯度凝胶电泳第81页，本讲稿共86页野生序列的野生序列的PCRPCR产物片段与突变序列的产物片段与突变序列的PCRPCR产物片段产物片段的的TmTm不同，它们在电泳过程中被部分解链的先后不不同，它们在电泳过程中被部分解链的先后不同，经过一定时间的电泳后，可以发现这些产物片同，经过一定时间的电泳后，可以发现这些产物片段在凝胶中所处的位置也不同段在凝胶中所处的位置也不同 四、变性梯度凝胶电泳第82页，本讲稿共86页ABCABC四、变性梯度凝胶电泳第83页，本讲稿共86页五、熔点曲线分析五、熔点曲线分析DNADNA片段中突变碱基与正常碱基不能配对而形成片段中突变碱基与正常碱基不能配对而形成异源双链，所产生的异源双链，所产生的TmTm较完全配对的同源双链的较完全配对的同源双链的TmTm低，而显示出不同的曲线，从而将突变序列检低，而显示出不同的曲线，从而将突变序列检测出来测出来根据熔点曲线可判断野生型或突变型根据熔点曲线可判断野生型或突变型DNADNA片段片段第84页，本讲稿共86页五、熔点曲线分析第85页，本讲稿共86页六、六、PCRPCR产物的序列分析产物的序列分析主要用于分子克隆时对于目的基因扩增片段的序列鉴主要用于分子克隆时对于目的基因扩增片段的序列鉴定以及对致病基因检测时分析扩增片段中点突变的位定以及对致病基因检测时分析扩增片段中点突变的位置和性质置和性质 测序策略：测序策略：产物纯化后作为模板直接测序产物纯化后作为模板直接测序将将PCRPCR产物克隆入载体后再测序，后者测序的效果产物克隆入载体后再测序，后者测序的效果更好更好 ，如，如A-TA-T克隆克隆第86页，本讲稿共86页