单向免疫扩散试验 (2)PPT讲稿.ppt

单向免疫扩散试验第1页，共12页，编辑于2022年，星期五沉淀反应（沉淀反应（precipetaiton）是可溶性抗原与）是可溶性抗原与相应抗体特异性结合所出现的反应。相应抗体特异性结合所出现的反应。1905 凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验 1946 试管免疫扩散技术试管免疫扩散技术 1965 单向免疫扩散技术单向免疫扩散技术 1967 散射比浊法散射比浊法第2页，共12页，编辑于2022年，星期五在琼脂胶中混入一定量抗体，使待测的抗在琼脂胶中混入一定量抗体，使待测的抗原溶液从局部向琼脂内自由扩散，在抗原原溶液从局部向琼脂内自由扩散，在抗原抗体比例合适区域内形成可见的沉淀环。抗体比例合适区域内形成可见的沉淀环。(抗原抗体反应时，只有其中一种成分发生抗原抗体反应时，只有其中一种成分发生扩散）扩散）根据试验形式可分为试管法和平板法两种。根据试验形式可分为试管法和平板法两种。第3页，共12页，编辑于2022年，星期五第4页，共12页，编辑于2022年，星期五测量沉淀环的直径或计算环的面积。沉淀测量沉淀环的直径或计算环的面积。沉淀环直径或面积的大小与抗原量相关，但不环直径或面积的大小与抗原量相关，但不是直线相关，而是对数关系。同时，这种是直线相关，而是对数关系。同时，这种沉淀环与分子量和扩散时间有关。沉淀环与分子量和扩散时间有关。第5页，共12页，编辑于2022年，星期五试剂与器材试剂与器材1.羊抗人羊抗人IgG诊断血清诊断血清2.人人IgG标准液（标准液（30g/L）3.待测人血清待测人血清4.琼脂粉琼脂粉5.生理盐水生理盐水6.载玻片载玻片(玻璃板）、三角烧瓶、吸管、加样玻璃板）、三角烧瓶、吸管、加样器、打孔器、水浴箱、湿盒、直尺等器、打孔器、水浴箱、湿盒、直尺等第6页，共12页，编辑于2022年，星期五操作方法操作方法1.制备琼脂凝胶制备琼脂凝胶 （1）生理盐水配制琼脂凝胶（）生理盐水配制琼脂凝胶（15g/L），煮沸），煮沸溶化至澄清，置溶化至澄清，置56水浴中备用。水浴中备用。（2）取适量溶化琼脂，以琼脂）取适量溶化琼脂，以琼脂 抗体抗体4 1比比例吸取相应抗体，与琼脂充分混合，置例吸取相应抗体，与琼脂充分混合，置56水水浴中备用。浴中备用。第7页，共12页，编辑于2022年，星期五2.制板制板 （1）取洁净干燥玻片，置于水平台上）取洁净干燥玻片，置于水平台上 （2）用吸管吸取）用吸管吸取4ml琼脂（含抗体），于琼脂（含抗体），于载玻片载玻片1/3处浇注，使琼脂凝胶均匀铺满玻处浇注，使琼脂凝胶均匀铺满玻片，不要留有气泡。片，不要留有气泡。3.打孔打孔 待琼脂凝固后，用直径待琼脂凝固后，用直径3mm的打的打孔器打孔，孔距孔器打孔，孔距1012mm第8页，共12页，编辑于2022年，星期五4.加样加样 用微量加样器吸取待检血清用微量加样器吸取待检血清10l,加入相应加入相应的试验孔中，做好标记。的试验孔中，做好标记。将人将人IgG标准液（标准液（30g/L）用生理盐水分别）用生理盐水分别做如下稀释：原倍做如下稀释：原倍，1:2，1:5，1:10，1:20，1:30，用微量加样器吸取稀释标准液用微量加样器吸取稀释标准液10l,加入相应的试验孔中，做好标记。加入相应的试验孔中，做好标记。第9页，共12页，编辑于2022年，星期五5.扩散扩散 将加样的琼脂凝胶板平放于湿盒内，置将加样的琼脂凝胶板平放于湿盒内，置3724h后观察结果。后观察结果。第10页，共12页，编辑于2022年，星期五结果判断结果判断 精确测量各试验孔沉淀环的直径，以沉淀精确测量各试验孔沉淀环的直径，以沉淀环直径为横坐标，相应孔中环直径为横坐标，相应孔中IgG含量的对数含量的对数为纵坐标，绘制标准曲线。为纵坐标，绘制标准曲线。(logC/d=K)第11页，共12页，编辑于2022年，星期五注意事项注意事项1.玻片须干燥、洁净，边缘无破损。置水平玻片须干燥、洁净，边缘无破损。置水平处。处。2.浇制琼脂板时动作要匀速浇制琼脂板时动作要匀速3.打孔时避免水平移动打孔时避免水平移动4.加样时避免气泡或加至孔外，加样要准确加样时避免气泡或加至孔外，加样要准确5.应同步绘制标准曲线应同步绘制标准曲线6.抗血清与溶化琼脂混合时，温度应控制在抗血清与溶化琼脂混合时，温度应控制在56第12页，共12页，编辑于2022年，星期五