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层析分离法层析分离法第1页，共136页，编辑于2022年，星期日层析分离法层析分离法22 22 层析分离法（第一讲）层析分离法（第一讲）第一讲概述概述 特点：特点：（1 1）纯化倍数高纯化倍数高（2 2）操作规模小，放大困难操作规模小，放大困难（3 3）终产品纯化终产品纯化（4 4）适用于价格昂贵的产品适用于价格昂贵的产品第2页，共136页，编辑于2022年，星期日层析分离分类（层析分离分类（1 1）层析分离法层析分离法第一讲按溶质分子与固定相相互作用机理按溶质分子与固定相相互作用机理吸附层析（范德华力，氢键，静电力，共价力）吸附层析（范德华力，氢键，静电力，共价力）分配层析（溶质在两液相间分配系数不同）分配层析（溶质在两液相间分配系数不同）凝胶过滤（分子大小与形状）凝胶过滤（分子大小与形状）实验技术分类实验技术分类低压（小于低压（小于0.5 Mpa)0.5 Mpa)中压中压 (0.5-5 Mpa)(0.5-5 Mpa)高压高压 (5-40 Mpa)(5-40 Mpa)电泳电泳 (溶质在电场中移动）溶质在电场中移动）第3页，共136页，编辑于2022年，星期日层析分离分类（层析分离分类（2 2）层析分离法层析分离法第一讲根据固定相形状分类根据固定相形状分类柱层析柱层析纸层析纸层析薄层层析薄层层析根据流动相分类根据流动相分类气相层析气相层析液相层析液相层析超临界流体层析超临界流体层析按操作方式分类按操作方式分类迎头法（迎头法（frontal analysis)frontal analysis)顶替法顶替法 （displacement analysis)displacement analysis)洗脱分析（洗脱分析（elution analysis)elution analysis)第4页，共136页，编辑于2022年，星期日基本概念基本概念层析分离法层析分离法第一讲（1 1）分配系数）分配系数 溶质在固定相与流动相浓度比值溶质在固定相与流动相浓度比值（2 2）解离常数）解离常数 吸附质浓度与吸附剂浓度乘积与吸吸附质浓度与吸附剂浓度乘积与吸 附复合物浓度比值附复合物浓度比值（3 3）分离因素）分离因素某一瞬间被吸附溶质量占总量的分数某一瞬间被吸附溶质量占总量的分数 (4)(4)阻滞因子阻滞因子分配层析溶质移动速度与理想流动分配层析溶质移动速度与理想流动 相移动速度（距离）比值相移动速度（距离）比值 (5)(5)溶出体积溶出体积 在柱色层分离中，使溶质从柱中流在柱色层分离中，使溶质从柱中流 出时所通过的流动相体积出时所通过的流动相体积 (6)(6)分辨率分辨率 两峰之间的距离与两峰宽的平均什之比两峰之间的距离与两峰宽的平均什之比 (7)(7)理论塔板理论塔板流动相与固定相平均浓度达传质平衡流动相与固定相平均浓度达传质平衡 时的一段柱高时的一段柱高（8 8）溶量因子）溶量因子固定相中溶质总量与流动相中溶质总之比固定相中溶质总量与流动相中溶质总之比第5页，共136页，编辑于2022年，星期日第一讲层析分离法层析分离法第6页，共136页，编辑于2022年，星期日分配系数分配系数层析分离法层析分离法第一讲 K Kd d=C=C1 1/C/C1 1K K d d为分配系数为分配系数C C1 1，C C2 2为两液相中的溶质浓度。为两液相中的溶质浓度。应用条件：温度一定应用条件：温度一定 低浓度低浓度第7页，共136页，编辑于2022年，星期日分离度分离度层析分离法层析分离法第一讲第8页，共136页，编辑于2022年，星期日第一讲层析分离法层析分离法第9页，共136页，编辑于2022年，星期日 Rf=第一讲层析分离法层析分离法第10页，共136页，编辑于2022年，星期日洗脱容积洗脱容积层析分离法层析分离法第一讲第11页，共136页，编辑于2022年，星期日第一讲层析分离法层析分离法第12页，共136页，编辑于2022年，星期日理论塔板理论塔板第一讲r n E/(E+1)时 r max n E/(E+1)最大浓度塔板r max n E/(E+1)层析分离法层析分离法第13页，共136页，编辑于2022年，星期日第一讲层析分离法层析分离法第14页，共136页，编辑于2022年，星期日思考题思考题层析分离法层析分离法第一讲1 1 想解概念：解离常数，分离因素，阻滞因子，想解概念：解离常数，分离因素，阻滞因子，理论塔板高度，洗胶体积，分辨率理论塔板高度，洗胶体积，分辨率2 2 不同的层析分类方法各有何意义？不同的层析分类方法各有何意义？第15页，共136页，编辑于2022年，星期日层析分离法（第二讲）层析分离法（第二讲）第二讲层析分离法层析分离法第16页，共136页，编辑于2022年，星期日层析介质层析介质层析分离法层析分离法第二讲要求：要求：（1 1）不溶于流动相）不溶于流动相（2 2）化学稳定）化学稳定（3 3）机械强度）机械强度（4 4）大的表面积）大的表面积（5 5）粒度均匀）粒度均匀层析介质种类层析介质种类无机（氧化铝，硅胶，活性碳）无机（氧化铝，硅胶，活性碳）有机（琼脂糖，纤维素，聚丙烯酰胺）有机（琼脂糖，纤维素，聚丙烯酰胺）第17页，共136页，编辑于2022年，星期日常用层析介质常用层析介质层析分离法层析分离法第二讲氧化铝：氧化铝：（活性氧化铝）它是一种多孔性、高分散度固体（活性氧化铝）它是一种多孔性、高分散度固体（1 1）有很大的比表面积，其微孔表面具有吸附性能。）有很大的比表面积，其微孔表面具有吸附性能。（2 2）分子式）分子式AIAI2 2O O3 3简单，空间形态复杂，简单，空间形态复杂，8 8种以上的形态种以上的形态（3 3）同一形态宏观结构性质如密度、孔隙率、孔径）同一形态宏观结构性质如密度、孔隙率、孔径 分布、比表分布、比表 面积等存在差异面积等存在差异 （4 4）吸附量与含水量关系很大）吸附量与含水量关系很大制备：制备：由氢氧化铝加热脱水得到的。由氢氧化铝加热脱水得到的。吸附基团：吸附基团：铝离子铝离子种类：种类：碱性：由氢氧化铝高温脱水，用于碱性稳定的溶质碱性：由氢氧化铝高温脱水，用于碱性稳定的溶质酸性：碱性氧化铝经盐酸洗涤，用于在酸性稳定的溶质酸性：碱性氧化铝经盐酸洗涤，用于在酸性稳定的溶质中性：碱性氧化铝经水洗后活化制得中性：碱性氧化铝经水洗后活化制得应用：应用：有机溶剂中分离天然成分有机溶剂中分离天然成分第18页，共136页，编辑于2022年，星期日第二讲层析分离法层析分离法第19页，共136页，编辑于2022年，星期日硅胶硅胶层析分离法层析分离法第二讲硅胶是由多聚硅酸经分子间脱水而形成的一种多孔性物质硅胶是由多聚硅酸经分子间脱水而形成的一种多孔性物质（1 1）化学组成）化学组成 SiOSiO2 2.XH.XH2 20 0，（2 2）属于无定形结构，基本结构质点为）属于无定形结构，基本结构质点为SiSi一一O O四面体，相互堆四面体，相互堆 积形成硅胶的骨架。质点间的空间即为硅胶的孔隙。积形成硅胶的骨架。质点间的空间即为硅胶的孔隙。（3 3）硅胶中的水以羟基的形式和硅原子相连而覆盖于硅胶表面。）硅胶中的水以羟基的形式和硅原子相连而覆盖于硅胶表面。硅胶的分类硅胶的分类（常以孔径大小来分），（常以孔径大小来分），(1)(1)特细孔硅胶特细孔硅胶 (0.8nm(0.8nm以下以下)。(2)(2)细孔硅胶（细孔硅胶（1.52.0nm)1.52.0nm)(3)(3)中孔硅胶中孔硅胶 (4.0(4.0一一5.0nm)5.0nm)(4)(4)粗孔硅胶粗孔硅胶 (10.nm(10.nm以上以上)应用：吸附层析剂与分配层析剂应用：吸附层析剂与分配层析剂 优先吸附极性分子及不饱和的碳氢化合优先吸附极性分子及不饱和的碳氢化合物，用于天然产物分离，物，用于天然产物分离，可用在水溶液中或有机溶剂中可用在水溶液中或有机溶剂中第20页，共136页，编辑于2022年，星期日琼脂糖琼脂糖层析分离法层析分离法第二讲由海洋生物琼脂提取得到的主要成分由海洋生物琼脂提取得到的主要成分 （1 1）中性不带电）中性不带电（2 2）水溶性线状多糖）水溶性线状多糖（3 3）高亲水性，含大量羟基）高亲水性，含大量羟基（4 4）能制成多孔性凝胶，分离大分子）能制成多孔性凝胶，分离大分子制备：制备：（1 1）去除带电琼胶成分）去除带电琼胶成分（2 2）将溶化的琼脂糖采用悬浮）将溶化的琼脂糖采用悬浮,乳化或喷珠的方法制乳化或喷珠的方法制 得珠状介质。得珠状介质。（3 3）采用交联剂增加介质的机械强度）采用交联剂增加介质的机械强度第21页，共136页，编辑于2022年，星期日 琼脂糖的基本结构单位和亲水性凝胶结构琼脂糖的基本结构单位和亲水性凝胶结构a a 琼脂糖结构琼脂糖结构 b b 亲水性凝胶结构亲水性凝胶结构 第二讲层析分离法层析分离法第22页，共136页，编辑于2022年，星期日琼脂糖（琼脂糖（2 2）层析分离法层析分离法第二讲介质商品种类介质商品种类Sepharose 2B,Sepharose 2B,Sepharose 4B,Sepharose 4B,Sepharose 6BSepharose 6B。经过交联而增加机械强度的琼脂糖经过交联而增加机械强度的琼脂糖Sepharose CL-2B,Sepharose CL-2B,Sepharose CL-4B,Sepharose CL-4B,Sepharose CL-6B Sepharose CL-6B 应用应用 水溶液中分离蛋白质水溶液中分离蛋白质第23页，共136页，编辑于2022年，星期日葡聚糖葡聚糖 层析分离法层析分离法第二讲-1,6-1,6 相连的葡萄糖聚合物，由环氧氯丙烷交联得到珠粒相连的葡萄糖聚合物，由环氧氯丙烷交联得到珠粒性质：性质：（1 1）亲水性比琼脂糖高（羟基数多）亲水性比琼脂糖高（羟基数多）（2 2）化学稳定性及热稳定性好）化学稳定性及热稳定性好（3 3）孔度与机械强度与交联度有关）孔度与机械强度与交联度有关（4 4）用于凝胶过滤分子筛）用于凝胶过滤分子筛应用：应用：水溶液中分离蛋白质等水溶液中分离蛋白质等第24页，共136页，编辑于2022年，星期日纤维素纤维素层析分离法层析分离法第二讲-1,4-1,4 相连的相连的D-D-葡萄糖（偶而有葡萄糖（偶而有1 1，6 6 键合）线性天然高聚键合）线性天然高聚物物（1 1）亲水）亲水（2 2）微晶与无定型两部分组成，缺乏孔度）微晶与无定型两部分组成，缺乏孔度大孔珠状纤维素大孔珠状纤维素（1 1）高孔度）高孔度（2 2）高机械强度）高机械强度（3)3)亲水性强亲水性强 应用：应用：离子交换分离蛋白质介质离子交换分离蛋白质介质第25页，共136页，编辑于2022年，星期日聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺层析分离法层析分离法第二讲性质：性质：（1 1）丙烯酰胺与交联剂）丙烯酰胺与交联剂N,N-N,N-甲叉双丙烯酰甲叉双丙烯酰 胺共聚胺共聚（2 2）烷烃骨架与酰胺侧链）烷烃骨架与酰胺侧链（3 3）控制交联剂比例可控制网格孔度）控制交联剂比例可控制网格孔度（4 4）亲水好，但不如多糖介质）亲水好，但不如多糖介质 (5)(5)机械强度差机械强度差应用：应用：（1 1）凝胶过滤）凝胶过滤 （2 2）电泳介质电泳介质第26页，共136页，编辑于2022年，星期日亲和层析亲和层析 层析分离法层析分离法第二讲亲和层析亲和层析(Affinity Chromatography)(Affinity Chromatography)是利用生物体内存在是利用生物体内存在的特异性相互作用的分子对而设计的层析方法。的特异性相互作用的分子对而设计的层析方法。生物体内相互作用的分子对：生物体内相互作用的分子对：(1)(1)酶酶底物或抑制剂底物或抑制剂(2)(2)抗原抗原抗体。抗体。(3)(3)激素激素受体。受体。(4)(4)糖蛋白与凝集素糖蛋白与凝集素,(5)(5)生物素生物素生物素结合蛋白等生物素结合蛋白等 第27页，共136页，编辑于2022年，星期日 基质活化方法与配基偶联基质活化方法与配基偶联 层析分离法层析分离法第二讲活活化化(activation):(activation):基基质质（matrixmatrix）上上的的化化学学基基团团是是不不活活泼泼的的,无无法法与与配配基基直直接接偶偶联联,通通过过化化学学反反应应使使介介质质上上化化学学基基团团处处于活化状态。于活化状态。(1)(1)大分子配基如蛋白质等可与活化基质直接偶联。大分子配基如蛋白质等可与活化基质直接偶联。(2)(2)小小分分子子配配基基,在在基基质质与与配配基基之之间间插插入入若若干干碳碳原原子子手手臂臂(spacer),(spacer),然后再与配基偶联。然后再与配基偶联。(3)(3)环环氧氧氯氯丙丙烷烷,1,41,4丁丁二二醇醇缩缩水水甘甘油油醚醚本本身身是是活活化化剂剂亦亦具有手臂作用。具有手臂作用。第28页，共136页，编辑于2022年，星期日活化方法（活化方法（1 1）层析分离法层析分离法第二讲A A 溴化氰法溴化氰法溴溴化化氰氰在在碱碱性性条条件件下下与与多多糖糖上上的的羟羟基基反反应应导导入入氰氰酯酯键键或或亚亚氨氨碳酸酯到基质上碳酸酯到基质上,进而与配基偶联进而与配基偶联优点优点:（1 1）适用于含羟基多糖及含羟基的合成基质适用于含羟基多糖及含羟基的合成基质（2 2）用于含伯氨基小分子配基及伯氨基大分子配基的偶联）用于含伯氨基小分子配基及伯氨基大分子配基的偶联（3 3）操作步骤简单）操作步骤简单,重现性好。重现性好。（4 4）偶联条件温和）偶联条件温和,特别适用于偶联敏感性生物大分子。特别适用于偶联敏感性生物大分子。缺点：缺点：（1 1）形成的异脲键易产生非特异性吸附）形成的异脲键易产生非特异性吸附,（2 2）共价键不稳定）共价键不稳定,配基容易脱落配基容易脱落,（3 3）活化操作危险性大，反应后的残余液需经处理再排放）活化操作危险性大，反应后的残余液需经处理再排放 第29页，共136页，编辑于2022年，星期日溴化氰活化与配基偶联化学反应式溴化氰活化与配基偶联化学反应式 第二讲层析分离法层析分离法第30页，共136页，编辑于2022年，星期日 活化方法（活化方法（2 2）层析分离法层析分离法第二讲B B 环氧氯丙烷活化环氧氯丙烷活化 （1 1）所形成的共价键稳定）所形成的共价键稳定,配基不易落脱配基不易落脱（2 2）自动引入手臂）自动引入手臂,（3 3）有更小的非特异性吸附）有更小的非特异性吸附,（4 4）活化操作简单易行）活化操作简单易行,危险性相对较小危险性相对较小缺点：缺点：在强碱性条件反应，不适用于碱敏感物质。在强碱性条件反应，不适用于碱敏感物质。第31页，共136页，编辑于2022年，星期日环氧氯丙烷活化反应式 第二讲层析分离法层析分离法第32页，共136页，编辑于2022年，星期日 环氧基的氨化及偶联配基反应环氧基的氨化及偶联配基反应 第二讲层析分离法层析分离法第33页，共136页，编辑于2022年，星期日思考题思考题层析分离法层析分离法第二讲1 1 常用的层析介质有哪些？各适用于何种状况下的分离？常用的层析介质有哪些？各适用于何种状况下的分离？2 2 亲和层析的机理是什么？亲和层析的机理是什么？第34页，共136页，编辑于2022年，星期日层析法（第三讲）层析法（第三讲）第三讲层析分离法层析分离法第35页，共136页，编辑于2022年，星期日活化方法（活化方法（3）层析分离法层析分离法第三讲C C 对甲苯磺酰氯活化对甲苯磺酰氯活化 （1 1）用于活化含羟基基质）用于活化含羟基基质,将羟基转化为磺酰将羟基转化为磺酰 基基,在配基偶联后容易脱落在配基偶联后容易脱落,不引入电荷。不引入电荷。（2 2）配基与羟基间形成稳定化学键。）配基与羟基间形成稳定化学键。（3 3）活化操作需在无水丙酮环境中进行。偶联）活化操作需在无水丙酮环境中进行。偶联 配基根据情况配基根据情况,既可在有机相中进行既可在有机相中进行,亦可在水亦可在水相中进行相中进行第36页，共136页，编辑于2022年，星期日对甲苯磺酰氯活化反应式第三讲层析分离法层析分离法第37页，共136页，编辑于2022年，星期日手臂（手臂（spacer)spacer)层析分离法层析分离法第三讲作用作用 ：减少亲和作用空间位阻：减少亲和作用空间位阻 连接：通过化学反应与活化基团连接连接：通过化学反应与活化基团连接手臂化合物：手臂化合物：乙二胺乙二胺 NHNH2 2-CH-CH2 2-CH-CH2 2-NH-NH2 2已二胺已二胺 NHNH2 2-CH-CH2 2-CH-CH2 2-CH-CH2 2-CH-CH2 2-NH-NH2 26-6-氨基已酸氨基已酸NHNH2 2-CH-CH2 2-CH-CH2 2-CH-CH2 2-CH-CH2 2-COOH-COOH环氧氯丙烷环氧氯丙烷 1 1，4-4-丁二醇缩水甘油醚丁二醇缩水甘油醚第38页，共136页，编辑于2022年，星期日D D 残余电荷的掩蔽残余电荷的掩蔽层析分离法层析分离法第三讲目的：目的：防止产生非特异性吸附防止产生非特异性吸附原理：原理：通过化学反应消除基团上的电荷通过化学反应消除基团上的电荷方法：方法：（1 1）自发水解）自发水解（2 2）氨基：醋酸酐）氨基：醋酸酐（3 3）羧基：水溶性碳二亚胺）羧基：水溶性碳二亚胺第39页，共136页，编辑于2022年，星期日手臂氨末端的掩蔽手臂氨末端的掩蔽 第三讲层析分离法层析分离法第40页，共136页，编辑于2022年，星期日残留羧基掩蔽反应残留羧基掩蔽反应 第三讲层析分离法层析分离法第41页，共136页，编辑于2022年，星期日E E 活化基团与配基密度测定活化基团与配基密度测定 层析分离法层析分离法第三讲方法：方法：（1 1）氨基或羧基可用酸碱滴定。）氨基或羧基可用酸碱滴定。（2 2）有紫外吸收特征的）有紫外吸收特征的,可用紫外分光法测定。可用紫外分光法测定。（3 3）通过测定反应余液中配基残留量推算（偶）通过测定反应余液中配基残留量推算（偶 联率较高的情况）联率较高的情况）（4 4）某些情况下需将亲和胶样品分解破坏测定）某些情况下需将亲和胶样品分解破坏测定第42页，共136页，编辑于2022年，星期日F F 亲和介质吸附容量测定亲和介质吸附容量测定层析分离法层析分离法第三讲 方法：方法：（1 1）流出曲线法：流出曲线法：流出液中目标蛋白浓度达到进流出液中目标蛋白浓度达到进 口浓度的口浓度的90%90%（2 2）Langmiur Langmiur 吸附等温线法吸附等温线法第43页，共136页，编辑于2022年，星期日 层析装置与操作层析装置与操作层析分离法层析分离法第三讲装置装置 1 1 普通普通 2 2 高级高级柱操作柱操作（1 1）装柱：均匀，无气泡）装柱：均匀，无气泡（2 2）平衡（）平衡（equilibrium)equilibrium)：缓冲液：缓冲液,pH,pH,盐浓度盐浓度（3 3）上样）上样(loading)(loading)：蛋白浓度，：蛋白浓度，pH,pH,盐浓度，缓冲液盐浓度，缓冲液（4 4）洗涤）洗涤(washing)(washing)：pH,pH,盐浓度，洗涤剂，缓冲液盐浓度，洗涤剂，缓冲液（5 5）洗脱）洗脱(elution)(elution)：条件与吸附相反：条件与吸附相反（6 6）清洗）清洗(cleaning)(cleaning)：弱酸，弱碱，蛋白质变性剂（尿：弱酸，弱碱，蛋白质变性剂（尿 素，素，盐酸胍，硫氰酸盐盐酸胍，硫氰酸盐（7 7）再生：与平衡条件相同）再生：与平衡条件相同第44页，共136页，编辑于2022年，星期日柱层析分离法的有关装置柱层析分离法的有关装置 第三讲层析分离法层析分离法第45页，共136页，编辑于2022年，星期日 Pharmacia KTA Pharmacia KTA 层析系统层析系统 第三讲层析分离法层析分离法第46页，共136页，编辑于2022年，星期日装置装置层析分离法层析分离法第三讲泵泵混合器混合器层析柱层析柱检测器检测器记录仪记录仪分部收集器分部收集器第47页，共136页，编辑于2022年，星期日装柱装柱层析分离法层析分离法第三讲调糊：调糊：50%50%一次连续加入悬胶液一次连续加入悬胶液打开出口阀：层析剂沉降打开出口阀：层析剂沉降排除空气排除空气检查均匀度检查均匀度第48页，共136页，编辑于2022年，星期日上样上样层析分离法层析分离法第三讲样品处理：样品处理：(1(1）溶解）溶解A A 调整浓度调整浓度B B 盐盐C pH C pH(2)(2)过滤：除去不溶物过滤：除去不溶物流速：流速：根据样品浓度与吸附速度而定根据样品浓度与吸附速度而定上样量：上样量：80%80%吸附容量吸附容量第49页，共136页，编辑于2022年，星期日淋洗淋洗层析分离法层析分离法第三讲盐浓度盐浓度pH pH 表面活性剂（表面活性剂（0.1-0.5%)0.1-0.5%)淋洗体积：根据流出液杂蛋白浓度而定淋洗体积：根据流出液杂蛋白浓度而定防止产物丢失又要除去杂质防止产物丢失又要除去杂质第50页，共136页，编辑于2022年，星期日洗脱方法洗脱方法层析分离法层析分离法第三讲按操作方式按操作方式a a 恒定洗脱恒定洗脱 (isocratic elution)(isocratic elution)b b 分步洗脱分步洗脱 (stage elution)(stage elution)c c 梯度洗脱梯度洗脱 (gradient elution)(gradient elution)按洗脱机理按洗脱机理专一性洗脱（专一性洗脱（specific elutionspecific elution）非专一性洗脱（非专一性洗脱（nonspecific elutionnonspecific elution）添加剂：乙二醇添加剂：乙二醇,NaCNS,NaCNS、脲素、盐酸胍、脲素、盐酸胍 洗脱体积：洗脱体积：5 5倍床体积倍床体积第51页，共136页，编辑于2022年，星期日怛定洗脱怛定洗脱 第三讲层析分离法层析分离法第52页，共136页，编辑于2022年，星期日分步洗脱分步洗脱 第三讲层析分离法层析分离法第53页，共136页，编辑于2022年，星期日(c)(c)梯度洗脱梯度洗脱第三讲层析分离法层析分离法第54页，共136页，编辑于2022年，星期日清洗与再生清洗与再生层析分离法层析分离法第三讲弱酸：弱酸：HACHAC碱：氨水碱：氨水促溶剂：促溶剂：1-3M KCNS1-3M KCNS，6-8 M 6-8 M 尿素，尿素，6 M6 M盐酸胍盐酸胍极性溶剂：极性溶剂：20%20%乙醇乙醇表面活性剂：吐温表面活性剂：吐温-80-80缓冲液平衡缓冲液平衡第55页，共136页，编辑于2022年，星期日思考题思考题层析分离法层析分离法第三讲1 1 配基偶联后残留电荷对分离有何影响？配基偶联后残留电荷对分离有何影响？如何消除？如何消除？2 2 小分子配基为何需插入手臂？小分子配基为何需插入手臂？3 3 层析柱洗脱方式有几种？各适用于何种情况？层析柱洗脱方式有几种？各适用于何种情况？第56页，共136页，编辑于2022年，星期日层析分离法（第四讲）层析分离法（第四讲）第四讲层析分离法层析分离法第57页，共136页，编辑于2022年，星期日无机吸附剂无机吸附剂层析分离法层析分离法第四讲羟基磷辚石羟基磷辚石(hydroxyapatite,Ca(hydroxyapatite,Ca1010(PO(PO4 4)6 6(OH)(OH)2 2)（1 1）纯化蛋白质的无机介质。）纯化蛋白质的无机介质。（2 2）廉价，易于大规模应用，）廉价，易于大规模应用，（3 3）使用后易于清洁）使用后易于清洁 吸附机理与规律：吸附机理与规律：偶极离子作用而不是离子交换作用偶极离子作用而不是离子交换作用(1)(1)每一个正电荷区周围都有负电荷区，反之亦然每一个正电荷区周围都有负电荷区，反之亦然 .（2 2）蛋白质在中性）蛋白质在中性pHpH范围具有最大的形成毗邻正负离子的可能性。范围具有最大的形成毗邻正负离子的可能性。第58页，共136页，编辑于2022年，星期日第四讲层析分离法层析分离法第59页，共136页，编辑于2022年，星期日工艺条件工艺条件层析分离法层析分离法第四讲吸附：吸附：(1)pH(1)pH在在6969之间之间 （2 2）低浓度缓冲液离子（通常是磷酸盐）低浓度缓冲液离子（通常是磷酸盐）（3 3）低盐浓度）低盐浓度 洗脱：洗脱：（1 1）增加缓冲液浓度）增加缓冲液浓度（2 2）高盐浓度中进行）高盐浓度中进行（3 3）盐可以采）盐可以采 用恒定或梯度形式应用。用恒定或梯度形式应用。第60页，共136页，编辑于2022年，星期日层析分离法层析分离法第四讲 (1)(1)光合作用中重要的辅助色素光合作用中重要的辅助色素(2)(2)可作为荧光探针可作为荧光探针(3)(3)天然色素天然色素(4)(4)调节和激活免疫反应调节和激活免疫反应吸附：吸附：1mm,PH 6.81mm,PH 6.8磷酸缓冲液磷酸缓冲液 (I.8cm4cm)(I.8cm4cm)层析柱层析柱上样量上样量:2mL:2mL洗脱：磷酸盐缓冲液洗脱：磷酸盐缓冲液1 1、5 5、5050、l00l00、200mm200mm，PH 6.8PH 6.8，+0.1M+0.1M NaClNaCl溶液溶液洗脱速度洗脱速度:18mL/h:18mL/h分步收集洗脱液分步收集洗脱液(每管约每管约4mL)4mL)第61页，共136页，编辑于2022年，星期日第四讲层析分离法层析分离法第62页，共136页，编辑于2022年，星期日疏水层析疏水层析层析分离法层析分离法第四讲 将疏水性基团如丁烷、辛烷、苯固定化到介质上将疏水性基团如丁烷、辛烷、苯固定化到介质上,这些基团这些基团会与蛋白质生物大分子上的疏水区亲和会与蛋白质生物大分子上的疏水区亲和 介质制备：介质制备：琼脂糖在有机溶剂中用琼脂糖在有机溶剂中用CDI(CDI(羰基二咪唑羰基二咪唑)活化后活化后再与芳胺或烷胺形成酰胺键得到疏水层析介质再与芳胺或烷胺形成酰胺键得到疏水层析介质 介质配基密度介质配基密度:4080mol/ml4080mol/ml胶胶,吸附容量：吸附容量：牛血清蛋白牛血清蛋白(BSA)(BSA)大于大于40mg/ml40mg/ml第63页，共136页，编辑于2022年，星期日疏水层析介质制备过程示意图疏水层析介质制备过程示意图 第四讲层析分离法层析分离法第64页，共136页，编辑于2022年，星期日工艺条件工艺条件层析分离法层析分离法第四讲吸附：吸附：(1)(1)盐浓度：高盐，盐浓度：高盐，12M(NH12M(NH4 4)2 2SOSO4 4 或或NaClNaCl(2)pH:(2)pH:中性或偏酸性中性或偏酸性淋洗：淋洗：0.52%0.52%表面活性剂表面活性剂洗脱洗脱:(1)(1)低盐，低盐，0.10.5M NaCl,0.10.5M NaCl,再配合再配合pHpH变化。变化。(2)(2)低浓度促溶剂低浓度促溶剂,0.10.5%NaSCN,0.10.5%NaSCN,或或2040%2040%乙二醇乙二醇疏水层析实验方案：疏水层析实验方案：第65页，共136页，编辑于2022年，星期日第四讲层析分离法层析分离法第66页，共136页，编辑于2022年，星期日第四讲层析分离法层析分离法第67页，共136页，编辑于2022年，星期日第四讲层析分离法层析分离法第68页，共136页，编辑于2022年，星期日第四讲层析分离法层析分离法第69页，共136页，编辑于2022年，星期日第四讲层析分离法层析分离法第70页，共136页，编辑于2022年，星期日第四讲层析分离法层析分离法第71页，共136页，编辑于2022年，星期日第四讲层析分离法层析分离法第72页，共136页，编辑于2022年，星期日第四讲层析分离法层析分离法第73页，共136页，编辑于2022年，星期日第四讲层析分离法层析分离法第74页，共136页，编辑于2022年，星期日第四讲层析分离法层析分离法第75页，共136页，编辑于2022年，星期日第四讲层析分离法层析分离法第76页，共136页，编辑于2022年，星期日第四讲层析分离法层析分离法第77页，共136页，编辑于2022年，星期日第四讲层析分离法层析分离法第78页，共136页，编辑于2022年，星期日第四讲层析分离法层析分离法第79页，共136页，编辑于2022年，星期日第四讲层析分离法层析分离法第80页，共136页，编辑于2022年，星期日固定化金属离子亲和层析固定化金属离子亲和层析 （Immobilized Metal Ion Immobilized Metal Ion Affinity ChromatographyAffinity Chromatography）层析分离法层析分离法第四讲亚氨二醋酸盐与环氧活化的琼脂糖偶合亚氨二醋酸盐与环氧活化的琼脂糖偶合,可以形成一种带有双羧可以形成一种带有双羧甲基氨基琼脂糖甲基氨基琼脂糖,进而与过渡金属离子进而与过渡金属离子(Cu(Cu2+2+,Zn,Zn2+2+Ni Ni2+2+)牢固牢固螯合螯合,形成稳定的吸附活性中心形成稳定的吸附活性中心 吸附机理：吸附机理：金属螯合介质能与蛋白质中的组氨酸上的咪唑金属螯合介质能与蛋白质中的组氨酸上的咪唑基及半胱氨酸上的巯基结合基及半胱氨酸上的巯基结合 第81页，共136页，编辑于2022年，星期日工艺条件工艺条件层析分离法层析分离法第四讲吸附：吸附：(1)pH(1)pH 中性中性(2)(2)低盐低盐(3)(3)金属离子金属离子洗脱：洗脱：(1)(1)降低降低pHpH(2)(2)提高盐浓度提高盐浓度(3)(3)缓冲液中加入螯合剂缓冲液中加入螯合剂EDTA EDTA 基因蛋白质的组氨酸插入基因蛋白质的组氨酸插入第82页，共136页，编辑于2022年，星期日第四讲层析分离法层析分离法第83页，共136页，编辑于2022年，星期日第四讲层析分离法层析分离法第84页，共136页，编辑于2022年，星期日层析分离法层析分离法第四讲吸附：吸附：NiNi2+2+亲和亲和 pH:7.5 pH:7.5 洗脱：洗脱：7.5-4.0 7.5-4.0 梯度梯度第85页，共136页，编辑于2022年，星期日第四讲层析分离法层析分离法第86页，共136页，编辑于2022年，星期日共价层析共价层析层析分离法层析分离法第四讲共价层析是根据巯基化合物与层析剂上二硫键的共价化学反共价层析是根据巯基化合物与层析剂上二硫键的共价化学反应而设计的应而设计的 第87页，共136页，编辑于2022年，星期日谷谷胱胱甘甘肽肽型型二二硫硫键键层层析析剂剂与与巯巯丙丙基基型型二二硫硫键键层层析析剂剂 (a)(a)谷胱甘肽二硫键层析剂谷胱甘肽二硫键层析剂 （b b）巯丙基型二二硫键层析剂巯丙基型二二硫键层析剂第四讲层析分离法层析分离法第88页，共136页，编辑于2022年，星期日靠巯基二硫键作用的共价层析分离过程靠巯基二硫键作用的共价层析分离过程吸附过程吸附过程 （b b）洗脱过程洗脱过程 （c c）再生过程再生过程 第四讲层析分离法层析分离法第89页，共136页，编辑于2022年，星期日苯基硼酸盐与苯基硼酸盐与1 1，2 2顺二元醇化合物的反应顺二元醇化合物的反应第四讲层析分离法层析分离法第90页，共136页，编辑于2022年，星期日层析分离（第五讲）层析分离（第五讲）第五讲层析分离法层析分离法第91页，共136页，编辑于2022年，星期日谷胱甘肽巯基转移酶谷胱甘肽巯基转移酶（GSTGST）共价层析）共价层析层析分离法层析分离法第五讲（1 1）将将GSTGST基因结合到目标蛋白基因上制成基因结合到目标蛋白基因上制成 表达融合蛋白表达融合蛋白（2 2）用谷胱甘肽亲和介质吸附）用谷胱甘肽亲和介质吸附GSTGST目标蛋白目标蛋白（3 3）用酶切除）用酶切除GSTGST，得到纯化目标蛋白，得到纯化目标蛋白第92页，共136页，编辑于2022年，星期日第五讲层析分离法层析分离法第93页，共136页，编辑于2022年，星期日苯硼酸共价层析苯硼酸共价层析层析分离法层析分离法第五讲利用硼原子与邻二羟基结构的糖形成共价五元环结构利用硼原子与邻二羟基结构的糖形成共价五元环结构吸附：吸附：（1 1）pH 8-9 pH 8-9（2 2）高盐促进苯基吸附）高盐促进苯基吸附洗脱：洗脱：pH 3-4,pH 3-4,Tris Tris 缓冲液，甘露醇缓冲液，甘露醇应用：应用：糖蛋白，核苷酸，多糖糖蛋白，核苷酸，多糖第94页，共136页，编辑于2022年，星期日苯基硼酸盐与苯基硼酸盐与1 1，2 2顺二元醇化合物的反应顺二元醇化合物的反应第五讲层析分离法层析分离法第95页，共136页，编辑于2022年，星期日蛋白质的离子交换层析蛋白质的离子交换层析层析分离法层析分离法第五讲层析介质：层析介质：DEAE-DEAE-纤维素，纤维素，CM-CM-纤维素纤维素吸附条件：吸附条件：(1)(1)缓冲液缓冲液pHpH (2)(2)蛋白浓度控制蛋白浓度控制 （5mg/ml)5mg/ml)（3 3）离子强度）离子强度 (4)(4)道南效应道南效应(Donnan effect)(Donnan effect)介质内外盐浓度及介质内外盐浓度及 pH pH 不同不同 (5)(5)上样量：上样量：1-5%BV1-5%BV，高径比，高径比20:1,L20:1,L：100cm(100cm(恒定洗恒定洗胶）；胶）；5-10%qm,5-10%qm,柱长度柱长度20-40cm,20-40cm,高径比高径比5 5：1 1（分步或梯度）（分步或梯度）洗脱：恒定，分步，梯度洗脱：恒定，分步，梯度pH pH 梯度：梯度：a a 缓冲量大；缓冲量大；b b 离子强度变化；离子强度变化；c pH c pH 变化大变化大 第96页，共136页，编辑于2022年，星期日层析分离法层析分离法第五讲第97页，共136页，编辑于2022年，星期日第五讲层析分离法层析分离法第98页，共136页，编辑于2022年，星期日第五讲层析分离法层析分离法第99页，共136页，编辑于2022年，星期日第五讲层析分离法层析分离法第100页，共136页，编辑于2022年，星期日染料亲和层析染料亲和层析层析分离法层析分离法第五讲活性染料常有蒽醌或萘衍生物活性染料常有蒽醌或萘衍生物,含有一个或多个氨基或磺酸基。其结构类含有一个或多个氨基或磺酸基。其结构类似某些酶的底物（似某些酶的底物（NAD NAD 中中ADPADP核酸的结构类似物核酸的结构类似物 ）特点特点:(1)(1)蛋白结合容量大蛋白结合容量大,是天然配基的是天然配基的1010010100倍倍(2)(2)廉价易得。廉价易得。(3)(3)具有普遍适用性。具有普遍适用性。(4)(4)配基的偶联方法简单配基的偶联方法简单,易于操作易于操作,可大规模应用。可大规模应用。(5)(5)染料的光谱特征可用来检测柱中染料浓度。染料的光谱特征可用来检测柱中染料浓度。(6)(6)蛋白质洗脱容易，蛋白质洗脱容易，(7)(7)染料配基在使用中有可能水解从基质上脱落而残留染料配基在使用中有可能水解从基质上脱落而残留 到产品中。到产品中。第101页，共136页，编辑于2022年，星期日机理机理层析分离法层析分离法第五讲（1 1）NAD NAD 中中ADPADP核酸的结构类似物核酸的结构类似物（2 2）离子交换（磺酸基，氨基）离子交换（磺酸基，氨基）（3 3）疏水作用（芳香基团）疏水作用（芳香基团）（4 4）金属离子，染料和蛋白质之间形成三元）金属离子，染料和蛋白质之间形成三元 络合物络合物第102页，共136页，编辑于2022年，星期日工艺条件工艺条件层析分离法层析分离法第五讲吸附：吸附：（1 1）低的低的PHPH时结合更为牢固时结合更为牢固（2 2）配体浓度）配体浓度 调整染料配体的浓度可以改变纯化因子调整染料配体的浓度可以改变纯化因子洗脱洗脱 （1 1）洗脱方式）洗脱方式 ：可用脉冲、分段、梯度：可用脉冲、分段、梯