5第三章 高效液相色谱(一).ppt

第三章第三章 高效液相色谱分析高效液相色谱分析 高效液相色谱法：流动相为液高效液相色谱法：流动相为液体并采用高压输液的色谱分析法；体并采用高压输液的色谱分析法；又称高压液相色谱。又称高压液相色谱。主主 要要 内内 容容:高效液相色谱分析法特点高效液相色谱分析法特点；影响色谱峰扩展及色谱分离的因素；影响色谱峰扩展及色谱分离的因素；高效液相色谱的分离原理；高效液相色谱的分离原理；液相色谱固定相与流动相；液相色谱固定相与流动相；高效液相色谱仪；高效液相色谱仪；高效液相色谱分离类型的选择；高效液相色谱分离类型的选择；毛细管电泳。毛细管电泳。3-1 3-1 高效液相色谱的特点高效液相色谱的特点（high performance liquid chromatography，HPLC）一、高效液相色谱法简介一、高效液相色谱法简介 1.1.概述：概述：高效液相色谱是高效液相色谱是20世纪世纪60年代末、年代末、70年代初发展起来年代初发展起来的一项高效快速的分离技术。的一项高效快速的分离技术。纸色谱、薄层色谱纸色谱、薄层色谱气相色谱气相色谱高效液相色谱高效液相色谱 2.分类分类:按分离原理不同按分离原理不同,常用的高效液相色谱有常用的高效液相色谱有:液液-液分配色谱和键合固定相色谱、液液分配色谱和键合固定相色谱、液-固色谱、固色谱、离子交换色谱、离子对色谱、离子色谱及凝胶渗离子交换色谱、离子对色谱、离子色谱及凝胶渗透色谱、亲和色谱等。透色谱、亲和色谱等。3.高效液相色谱与气相色谱比较高效液相色谱与气相色谱比较:（1）应用范围不同）应用范围不同 气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。分解的物质。液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的物的分离分析，大约占有机物的707080%80%。（2）液相色谱能完成难度较高的分离工作）液相色谱能完成难度较高的分离工作 因为因为:液液相相色色谱谱中中流流动动相相液液体体也也与与固固定定相相争争夺夺样样品品分子，为提高选择性增加了一个因素。分子，为提高选择性增加了一个因素。液相色谱固定相类型多液相色谱固定相类型多,分析时选择余地大。分析时选择余地大。液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择。一般有利于色谱分离条件的选择。（3 3）由由于于液液体体的的扩扩散散性性比比气气体体的的小小10105 5倍倍，分分子子扩散可以忽略扩散可以忽略,但传阻力加大。但传阻力加大。（4 4）液液相相色色谱谱中中制制备备样样品品简简单单，回回收收样样品品也也比比较容易，而且回收是定量的，适合于大量制备。较容易，而且回收是定量的，适合于大量制备。（5 5）液液相相色色谱谱尚尚缺缺乏乏通通用用的的检检测测器器，仪仪器器比比较较复杂，价格昂贵。复杂，价格昂贵。在在实实际际应应用用中中，这这两两种种色色谱谱技技术术是是互互相相补补充充的。的。二、高效液相色谱特点：二、高效液相色谱特点：1.高压高压:150 350105 Pa 2.高速高速:经典液相色谱分离经典液相色谱分离20种氨基酸需种氨基酸需20小时小时;高效液相色谱高效液相色谱1小时就可完成。小时就可完成。用梯度洗脱法，可在半小时内分析出尿样中用梯度洗脱法，可在半小时内分析出尿样中的的104个组分。个组分。3.高效：高效：理论塔板数：理论塔板数：气相色谱：气相色谱：2000块块/m；高效液相色谱：高效液相色谱：3万块万块/m。4.高灵敏高灵敏:10-9 10-115.可分析高沸点样品可分析高沸点样品:无机物及无机物及80%的高沸点有机的高沸点有机物气相色谱无法测定，可用液相色谱测定。物气相色谱无法测定，可用液相色谱测定。6.室温下进行。室温下进行。由于上述特点，该法已成为现代分析技术由于上述特点，该法已成为现代分析技术的重要手段之一，目前在化学、化工、医药、的重要手段之一，目前在化学、化工、医药、生化、环保、农业等科学领域获得广泛的应用。生化、环保、农业等科学领域获得广泛的应用。3-2 3-2 影响色谱扩展及色谱分离的因素影响色谱扩展及色谱分离的因素 高效液相色谱吸收了气相色谱的理论体系，高效液相色谱吸收了气相色谱的理论体系，各种术语及塔板理论、速率理论与气相色谱相各种术语及塔板理论、速率理论与气相色谱相同。同。不同之处在于液体流动相带来的变化：液体不同之处在于液体流动相带来的变化：液体扩散系数小（气体的万分之一至十万分之一）、扩散系数小（气体的万分之一至十万分之一）、粘度大、密度大等。粘度大、密度大等。1.涡流扩散项涡流扩散项He 与气相色谱相同与气相色谱相同 He 2dp2.纵向扩散项纵向扩散项HdDm ：组分在流动相中的扩组分在流动相中的扩散系数，比气相小散系数，比气相小个个数量级。数量级。Cd：常数常数 其影响较气相色谱小的多，其影响较气相色谱小的多，u大于大于0.5cm/s时，时，此项可以忽略。此项可以忽略。总方程式：总方程式：流速不是很小时：流速不是很小时：由此可以看出：由此可以看出：要提高柱效，需颗粒细小、均匀、孔径大且浅、要提高柱效，需颗粒细小、均匀、孔径大且浅、液膜厚度小；液膜厚度小；提高柱温可加快传质，但使分子扩散增强；一提高柱温可加快传质，但使分子扩散增强；一般温下进行；般温下进行；降低流速，纵向扩散加大，分析时间延长，故降低流速，纵向扩散加大，分析时间延长，故流速不要太慢。流速不要太慢。影响峰扩展的因素还有影响峰扩展的因素还有柱前峰展宽柱前峰展宽和和柱后峰展宽柱后峰展宽，是由进样和检测器所致，就是由进样和检测器所致，就注意改善进样方式、检测器注意改善进样方式、检测器及连接方式及连接方式。注意：注意：随着填料粒度的减小随着填料粒度的减小(10m)，两曲线变得两曲线变得基本相似，基本相似，LC曲线也出现最低点。曲线也出现最低点。H-u曲线曲线3-2 3-2 高效液色谱的分离原理高效液色谱的分离原理高效液相色谱主要有以下几类：高效液相色谱主要有以下几类：液液-液分配色谱及化学键合固定相色谱液分配色谱及化学键合固定相色谱液液-固吸附色谱固吸附色谱离子交换色谱离子交换色谱离子对色谱离子对色谱离子色谱离子色谱空间排阻色谱空间排阻色谱一、一、液液-固吸附色谱固吸附色谱 （liquid-solid adsorption chromatography）采用固体吸附剂的液相色谱法。采用固体吸附剂的液相色谱法。利用组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸作用利用组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸作用力的差异进行分离。力的差异进行分离。液液-固吸附色谱分离原理：固吸附色谱分离原理：组分溶剂吸附平衡：组分溶剂吸附平衡：Xm+nSa Xa+nSmXm:流动相中的组分流动相中的组分Xa:被吸附的组分被吸附的组分 Sa:被吸附的溶剂被吸附的溶剂Sm:流动相中的溶剂流动相中的溶剂Xm+nSa Xa+nSmK大，吸附作用力大，保留值大，后流出；大，吸附作用力大，保留值大，后流出；K小，吸附作用力小，保留值小，先流出。小，吸附作用力小，保留值小，先流出。其缺点是易出现拖尾现象。其缺点是易出现拖尾现象。二、液二、液-液分配色谱液分配色谱 （liquid-liquid partition chromatography）固定相为液体的液相色谱法。固定相为液体的液相色谱法。液液-液分配色谱分离原理：液分配色谱分离原理：该类色谱原理上与气相色谱类似，不同之处是流该类色谱原理上与气相色谱类似，不同之处是流动相为液体，动相为液体，参与竞争参与竞争，对分离影响大。，对分离影响大。K大的后流出，大的后流出，K小的先出峰小的先出峰正相色谱与反相色谱正相色谱与反相色谱 正相色谱：固定相极性大，流动相极性小；正相色谱：固定相极性大，流动相极性小；反相色谱：反相色谱：固定相极性小，流动相极性大。固定相极性小，流动相极性大。出峰顺序相反。出峰顺序相反。三、离子交换色谱三、离子交换色谱 （ion-exchange chromatography）以离子交换树脂为固定相的液相色谱法。以离子交换树脂为固定相的液相色谱法。离子交换色谱分离原理离子交换色谱分离原理 固定相为离子交换树脂固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无流动相为无机酸或无机碱的水溶液。各种离子与树脂上的反复进行交机碱的水溶液。各种离子与树脂上的反复进行交换，按换，按组分与离子交换剂之间亲和力的大小组分与离子交换剂之间亲和力的大小分离。分离。组分与离子交换剂之间亲和力的大小组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长。荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长。阳离子交换树脂：阳离子交换树脂：RSO3-Na+阴离子交换树脂：阴离子交换树脂：R4N+Cl-RSO3-Na+M+RSO3-M+Na+R4N+Cl-+X-R4N+X-+Cl-一般表示式：一般表示式：RA+B RB +ARA+B RB +A K大大(D大大)，保留值大，后流出。，保留值大，后流出。该法可用于分离离子及可离解的化合物，氨基酸、核该法可用于分离离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。酸等。四、离子对色谱四、离子对色谱 （ion pair chromatography）将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中与溶质离子子（对离子或反离子）加到流动相中与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相，使其能够在两相之间进行分配的液相色谱法。之间进行分配的液相色谱法。离子对色谱分离原理离子对色谱分离原理 分析分析有机酸、有机碱有机酸、有机碱时，若用吸附色谱易出时，若用吸附色谱易出现拖尾；而用分配色谱，又现拖尾；而用分配色谱，又因其极性强而需强因其极性强而需强极性洗脱液，且带电荷的离子不易进入极性小极性洗脱液，且带电荷的离子不易进入极性小的有机相的有机相；为此；为此加入离子与之成加入离子与之成对以控制其极对以控制其极性，进而改变其保留形为：性，进而改变其保留形为：常用的阴离子分离的对离子是烷基氨类：常用的阴离子分离的对离子是烷基氨类：R4N+OH-如如:氢氧化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲铵等；氢氧化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲铵等；常用的分离阳离子的是烷基磺酸类：常用的分离阳离子的是烷基磺酸类：R-SO3-Na+如：已烷磺酸钠等。如：已烷磺酸钠等。五、离子色谱五、离子色谱 （ion chromatography）离子色谱是在离子色谱是在20世纪世纪70年代中期发展起来的一年代中期发展起来的一中技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特中技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。测定混合阴离子的有效方法。离子色谱原理离子色谱原理 该法分离原理与离子交换色谱相同；先在交换该法分离原理与离子交换色谱相同；先在交换树脂上发生离子交换，然后洗脱分离测其树脂上发生离子交换，然后洗脱分离测其电导变电导变化化；由于；由于洗液浓度较大，会掩盖被测离子产生的洗液浓度较大，会掩盖被测离子产生的电导变化，电导变化，故需加抑制柱。如：故需加抑制柱。如：ROH+NaBr=RBr+Na+OH 洗脱分离后，进入抑制柱：洗脱分离后，进入抑制柱：RH+NaOH=RNa+H2O RH+Na Br=RNa+H+Br 消除了消除了NaOH的干扰，且提高了灵敏度（的干扰，且提高了灵敏度（H+淌淌度是度是Na+的的7倍）倍）阳离子用阳离子用HCl洗脱后，然后进入洗脱后，然后进入ROH型树脂：型树脂：ROH+HCl=RCl+H2O ROH+MCl=RCl+M+OH OH淌度为淌度为Cl 的的2.6倍，提高了灵敏度。倍，提高了灵敏度。采用抑制柱的又称化学抑制型离子色谱；采用抑制柱的又称化学抑制型离子色谱；亦可采用低浓度的洗脱液，便不需加抑制柱，亦可采用低浓度的洗脱液，便不需加抑制柱，称为非抑制型离子色谱；称为非抑制型离子色谱；离子色谱对分析难分析的阴离子提供了很好的离子色谱对分析难分析的阴离子提供了很好的方法。方法。六、排阻色谱色谱六、排阻色谱色谱 （size-exclusion chromatography）以以凝凝胶胶(具具有有一一定定大大小小孔孔隙隙分分布布)为为固固定定相相，按按分分子子大大小小进行分离的液相色谱法。进行分离的液相色谱法。原理：原理：小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快，全部在死体积前出峰而大分子被排斥在外，出峰最快，全部在死体积前出峰。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、构和不同孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶；等硬质凝胶；该法主要用于较大的分子（分子量该法主要用于较大的分子（分子量2000以上）以上）的分离，条件合适亦能分离分子量的分离，条件合适亦能分离分子量100以上的以上的分子，故其适用范围为：分子，故其适用范围为：相对分子量：相对分子量：100105注意：注意：不能分离质量相近不能分离质量相近的，大小相似的分子，的，大小相似的分子，只能分离相对质量相只能分离相对质量相差差10%以上的分子。以上的分子。凝胶的凝胶的全排斥全排斥极限极限和和全渗透全渗透极限。极限。3-4 高效液相色谱的高效液相色谱的固定相和流动相固定相和流动相 一、一、固定相和流动相固定相和流动相 固定相：固定相：高高效效液液相相色色谱谱固固定定相相以以承承受受高高压压能能力力来来分分类，可分为类，可分为刚性固体刚性固体和和硬胶硬胶两大类。两大类。刚刚性性固固体体以以二二氧氧化化硅硅为为基基质质，可可制制成成直直径径、形形状状、孔孔隙隙度度不不同同的的颗颗粒粒。表表面面可可涂涂或或键键合合固固定液。定液。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。和全多孔型固定相两类。1.1.表面多孔型固定相表面多孔型固定相 它它的的基基体体是是实实心心玻玻璃璃球球，在在玻玻璃璃球球外外面面覆覆盖盖一一层层多多孔孔活活性性材材料料，如如硅硅胶胶、氧氧化化硅硅、离离子子交交换剂、分子筛、聚酰胺等。换剂、分子筛、聚酰胺等。这这类类固固定定相相的的多多孔孔层层厚厚度度小小、孔孔浅浅，相相对对死死体体积积小小，出出峰峰迅迅速速、柱柱效效亦亦高高；颗颗粒粒较较大大，渗渗透透性性好好，装装柱柱容容易易，梯梯度度淋淋洗洗时时能能迅迅速速达达到到平衡，较适合做常规分析平衡，较适合做常规分析。由由于于多多孔孔层层厚厚度度薄薄，最最大大允允许许进进样样量量受受到到限制。限制。2.2.全多孔型固定相全多孔型固定相 由由直直径径为为10nm的的硅硅胶胶微微粒粒凝凝聚聚而而成成。这这类类固固定定相相由由于于颗颗粒粒很很细细（510m），孔孔仍仍然然较较浅浅，传传质质速速率率快快，易易实实现现高高效效、高高速速。特特别别适适合复杂混合物分离及痕量分析。合复杂混合物分离及痕量分析。流动相：流动相：液相色谱流动相称为溶剂、洗脱剂、载液等。液相色谱流动相称为溶剂、洗脱剂、载液等。由由于于高高效效液液相相色色谱谱中中流流动动相相是是液液体体，它它对对组组分分有有亲亲合合力力，并并参参与与固固定定相相对对组组分分的的竞竞争争，因因此此，正正确确选选择择流流动动相相直直接接影影响响组组分分的的分分离离度度。对流动相溶剂的要求是：对流动相溶剂的要求是：（1 1）溶溶剂剂对对于于待待测测样样品品，必必须须具具有有合合适适的的极极性性和和良好的选择性。良好的选择性。（2）溶剂与检测器匹配。）溶剂与检测器匹配。（3 3）高纯度。）高纯度。（4 4）化学稳定性好。）化学稳定性好。（5 5）低粘度（粘度适中）。）低粘度（粘度适中）。（一）液（一）液固色谱法固色谱法 1.1.液液-固色谱法固定相固色谱法固定相固体吸附剂：固体吸附剂：种种类类：包包括括硅硅胶胶、氧氧化化铝铝、氧氧化化镁镁、硅硅酸酸镁镁、活性碳、分子筛及聚酰胺等。活性碳、分子筛及聚酰胺等。最最常常用用的的吸吸附附剂剂是是硅硅胶胶，其其次次是是氧氧化化铝铝。硅硅胶胶不不仅仅作作为为液液固固吸吸附附色色谱谱固固定定相相，还还可可作作为为液液液分配色谱的载体和键合相色谱填料的基体。液分配色谱的载体和键合相色谱填料的基体。结构类型：全多孔型和薄壳型；结构类型：全多孔型和薄壳型；粒度：粒度：全多孔型：全多孔型：510m；薄壳型：薄壳型：3040 m。2.2.流动相流动相 在液在液-固色谱中，选择流动相的基本原则是固色谱中，选择流动相的基本原则是 极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动相则用低极性流动相。为了获得合适的溶剂极性，常采用两种、为了获得合适的溶剂极性，常采用两种、三种或更多种不同极性的溶剂混合起来使用，三种或更多种不同极性的溶剂混合起来使用，如果样品组分的分配比如果样品组分的分配比k k值范围很广则使用梯值范围很广则使用梯度洗脱。度洗脱。（二）液液色谱法与离子对色谱（二）液液色谱法与离子对色谱1.1.固定相固定相 载载体体：液液-液液色色谱谱的的固固定定相相由由载载体体和和固固定定液液组组成成。常常用的载体用的载体(担体担体)有下列几类：有下列几类：（1 1）全全多多孔孔型型载载体体，由由硅硅胶胶、硅硅藻藻土土等等材材料料制制成成，直直径径100100m左右左右的多孔型颗粒。的多孔型颗粒。（2 2）表面多孔型载体（薄）表面多孔型载体（薄壳型微珠载体），由直径为壳型微珠载体），由直径为30304040m的实心玻璃球和厚的实心玻璃球和厚度约为度约为1 12 2m的多孔性外层的多孔性外层所组成。所组成。（3）全多孔型微粒载体，由）全多孔型微粒载体，由nm级的硅胶微粒级的硅胶微粒堆积而成，又称堆积硅珠。这种载体粒度为堆积而成，又称堆积硅珠。这种载体粒度为5 10m。由于颗粒小，所以柱效高，是目前使由于颗粒小，所以柱效高，是目前使用最广泛的一种载体。用最广泛的一种载体。固定液：固定液：因液相流动相参与选择作用，故因液相流动相参与选择作用，故液相色谱只需几种不同极性的固定液即可。液相色谱只需几种不同极性的固定液即可。如如:强极性的强极性的,氧二丙腈（氧二丙腈（ODPN），），中极性的聚乙二醇（中极性的聚乙二醇（PEG），），非极性的十八烷非极性的十八烷（ODS）和角鲨烷固定液等。和角鲨烷固定液等。2.2.流动相流动相 固固定定液液为为极极性性物物质质时时，流流动动相相通通常常是是极极性性很很小的溶剂或非极性溶剂。小的溶剂或非极性溶剂。固定液为非极性时固定液为非极性时,流动应为极性溶剂。流动应为极性溶剂。正相分配色谱，适合于分离极性化合物；正相分配色谱，适合于分离极性化合物；反相分配色谱，适合于分离芳烃、稠环芳反相分配色谱，适合于分离芳烃、稠环芳烃及烷烃等化合物。烃及烷烃等化合物。3.化学键合固定相化学键合固定相 通过化学反应把各种不同的有机基团键合到硅通过化学反应把各种不同的有机基团键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上开成的固定相胶（载体）表面的游离羟基上开成的固定相；是目；是目前应用最广、性能最佳的固定相前应用最广、性能最佳的固定相 。键合相可分为。键合相可分为四种键型：四种键型：a.硅氧碳键型：硅氧碳键型：SiOC b.硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：SiOSi C c.硅碳键型：硅碳键型：SiC d.硅氮键型：硅氮键型：SiN 化化学学键键合合固固定定相相一一般般都都采采用用硅硅胶胶（薄薄壳壳型型或或全全多多孔孔微微粒粒型型）为为基基体体。在在键键合合反反应应之之前前，要要对对硅硅胶胶进进行行酸酸洗洗、中中和和、干干燥燥活活化化等等处处理理，然然后后再再使使硅硅胶胶表表面面上上的的硅硅羟羟基基与与各各种种有有机机物物或或有有机硅化合物起反应，制备化学键合固定相。机硅化合物起反应，制备化学键合固定相。（1）硅氧碳键型（）硅氧碳键型（Si-O-C）键合相键合相 SiOH+ROH SiOR+H2O 易易水水解解,不不适适合合水水乙乙醇醇等等流流动动相相，一一般般用用极极性性小的溶剂洗脱，分离极性化合物。小的溶剂洗脱，分离极性化合物。（2）硅氧硅碳键型（）硅氧硅碳键型（Si-O-Si-C）键合相键合相 SiOH+R-SiCl3 (SiO)3Si-R+HCl 热稳定性好，不吸水，耐有机溶剂，可在热稳定性好，不吸水，耐有机溶剂，可在70C，pH 2-8间正常使用，是应用最广泛的键间正常使用，是应用最广泛的键合相。合相。（3）硅碳键型（）硅碳键型（Si-C）键合相键合相 SiOH+SOCl2 SiCl SiCl+C6H5-HgBr SiC6H5（4）硅氮键型（）硅氮键型（Si-N）键合相键合相 SiCl+NH2CH2CH2NH2 SiNHCH2CH2NH2 化学键合固定相的特点化学键合固定相的特点1）传质快传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；2）寿命长寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；3）稳定稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，耐水、耐光、耐有机溶剂；4）选择性好选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；，可键合不同官能团，提高选择性；5）有利于梯度洗脱有利于梯度洗脱。存在着存在着双重分离机制双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主低覆盖率：吸附为主。（三）（三）离子交换色谱与离子色谱离子交换色谱与离子色谱1.固定相固定相：（1）薄壳型离子交换树脂）薄壳型离子交换树脂 薄壳玻璃珠为担体，表面薄壳玻璃珠为担体，表面 涂约涂约1%的离子交的离子交换树脂；换树脂；（2）离子交换键合固定相）离子交换键合固定相 薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团）。换基团）。树脂类别：树脂类别：（1）阳离子交换树脂阳离子交换树脂 强酸性：强酸性：R-SO3H 弱酸性：弱酸性：R-COOH（2）阴离子交换树脂阴离子交换树脂 强碱性：强碱性：R-N+R3 弱碱性：弱碱性：R-NH2典型的离子交换树脂是由典型的离子交换树脂是由苯乙烯和二乙烯苯交联共聚而成苯乙烯和二乙烯苯交联共聚而成。二乙烯苯起到交联的作用，其含量为树脂二乙烯苯起到交联的作用，其含量为树脂交联度。交联度。交联度一般控制在交联度一般控制在416%范围内，高度交范围内，高度交联的树脂较硬而且脆，但选择性较好。联的树脂较硬而且脆，但选择性较好。2.流动相流动相 最常使用水缓冲溶液最常使用水缓冲溶液；亦可用有机溶剂（如甲醇或乙醇）与水缓冲亦可用有机溶剂（如甲醇或乙醇）与水缓冲溶液混合使用，以提高特殊的选择性，并改善溶液混合使用，以提高特殊的选择性，并改善样品的溶解度。样品的溶解度。（四）空间排阻色谱法（四）空间排阻色谱法 排排阻阻色色谱谱的的色色谱谱柱柱的的填填料料是是凝凝胶胶，它它是是一一种种表表面面惰惰性性，含含有有许许多多不不同同尺尺寸寸的的孔孔穴穴或或立立体体网状物质。网状物质。排排阻阻色色谱谱的的固固定定相相一一般般可可分分为为软软性性、半半刚刚性性和刚性凝胶三类。和刚性凝胶三类。（1）软质凝胶）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；水为流动相水为流动相，适用于常压排阻分离。，适用于常压排阻分离。不适宜在不适宜在高效液相色谱中，一般用于小分子质量物质的分高效液相色谱中，一般用于小分子质量物质的分析。析。（2）半硬质凝胶）半硬质凝胶 苯乙烯苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；非极性有机溶剂为流动相非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂。等极性溶剂。（3）硬质凝胶）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等；多孔硅胶、多孔玻珠等；硬质凝胶硬质凝胶化学稳定性、热稳定性好、机械强化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高压力和较度大，流动相性质影响小，可在较高压力和较高流速下使用。高流速下使用。多孔硅胶存在吸附问题，应处理。多孔硅胶存在吸附问题，应处理。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布，近几年受到重视。分布，近几年受到重视。二、液相色谱的流动相的选择二、液相色谱的流动相的选择1.流动相类别流动相类别按流动相组成分：单组分和多组分；按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。乙醇、乙腈、水。2.流动相选择流动相选择 在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据，在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据，根据实验做出选择。根据实验做出选择。如：采用正相液如：采用正相液-液分配分离时，首先选择中等液分配分离时，首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。剂，使保留时间缩短。为获得合适的溶剂，可采用二元或多元组合为获得合适的溶剂，可采用二元或多元组合溶剂作为流动相（混合流动相）。溶剂作为流动相（混合流动相）。可分为底剂和洗脱剂，底剂决定基本的色谱可分为底剂和洗脱剂，底剂决定基本的色谱分离情况，洗脱剂调节组分滞留问题，选择性分离情况，洗脱剂调节组分滞留问题，选择性地分离某些组分。地分离某些组分。如：正相色谱中，以正已烷为底剂，根据需如：正相色谱中，以正已烷为底剂，根据需要加入极性物质：醚、酮、醇、酸等调节极性。要加入极性物质：醚、酮、醇、酸等调节极性。反相色谱中，水为主休，适当加入有机溶剂，反相色谱中，水为主休，适当加入有机溶剂，如：甲醇、乙腈、二氧六环四氢呋喃等。如：甲醇、乙腈、二氧六环四氢呋喃等。常用溶剂的极性顺序：常用溶剂的极性顺序：水水(最大最大)甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷氯仿氯仿溴溴乙烷乙烷苯苯四氯化碳四氯化碳二硫化碳二硫化碳环己烷环己烷己烷己烷煤油煤油(最小最小)