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第二节 基因工程的基本操作程序第1页，本讲稿共42页知识点一：知识点一：原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合聚合酶结合启动子启动子终止子终止子启动子：启动子：位于基因首端一段能位于基因首端一段能与与RNARNA聚合酶结合聚合酶结合并能并能起始起始mRNAmRNA合成的合成的DNADNA序列序列。没有启动子，基因就不能转录。没有启动子，基因就不能转录。RNARNA聚合酶聚合酶:能够识别启动子并与其结合的一种蛋白质能够识别启动子并与其结合的一种蛋白质,催化催化RNARNA的合的合成。成。终止子：终止子：位于基因的尾端的一段位于基因的尾端的一段DNADNA序列序列，它能阻碍，它能阻碍RNARNA聚合酶的移动，聚合酶的移动，并使其从并使其从DNADNA模板链上脱离下来，使模板链上脱离下来，使转录终止转录终止。注意：与起始密码、终止密码的区别注意：与起始密码、终止密码的区别第2页，本讲稿共42页不能转录为信使不能转录为信使RNARNA，不能，不能 编码蛋白质。编码蛋白质。：能转录相应的信使：能转录相应的信使RNARNA，能，能 编码蛋白质编码蛋白质 编码区编码区非编码区非编码区原核细胞的原核细胞的基因结构基因结构有有调控遗传信息表达调控遗传信息表达的核的核 苷酸序列，在该序列中，苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上最重要的是位于编码区上 游的游的RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点。非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 启动子启动子终止子终止子注意：与起始密码、终止密码的区别注意：与起始密码、终止密码的区别,密码子是位于密码子是位于mRNA上的上的三个相邻的核糖核苷酸。三个相邻的核糖核苷酸。第3页，本讲稿共42页编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合结合内含子内含子 外显子外显子 能够编码蛋白质的序列能够编码蛋白质的序列不能编码蛋白质的序列不能编码蛋白质的序列启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子：外显子：外显子：知识点二：知识点二：真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构第4页，本讲稿共42页真核真核细胞细胞的的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的包括位于编码区上游的RNARNA 聚合酶结合位点聚合酶结合位点等。等。非编码序列非编码序列原核基因原核基因:非编码区非编码区真核基因真核基因:非编码区非编码区+内含子内含子注意：注意：第5页，本讲稿共42页原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具和具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？与真核细胞基因结构一样长吗？连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码第6页，本讲稿共42页1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤有了目的基因，我们才能有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用达和发挥作用 载体只有进入受体细胞并维载体只有进入受体细胞并维持稳定和表达，才能实现一持稳定和表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物种生物的基因在另一种生物中的转化。中的转化。确定目的基因是否真正在受确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表体细胞中稳定遗传和正确表达。达。第7页，本讲稿共42页一、目的基因的获取一、目的基因的获取(一一)、目的基因主要是、目的基因主要是_编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因请举出三个以上的例子请举出三个以上的例子（二）、获取目的基因的常用方法有哪些（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?1 1、从基因文库中获取、从基因文库中获取2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增技术扩增3 3、人工合成、人工合成第8页，本讲稿共42页一、目的基因的获取一、目的基因的获取（一）从基因文库中直接获取（一）从基因文库中直接获取1.1.基因文库：基因文库：概念见概念见P9P92.2.基因文库的分类基因文库的分类:按外源按外源DNADNA片段的来源分类片段的来源分类种种类类基因组文库：基因组文库：含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因部分基因文库：部分基因文库：只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分部分基因基因 如：如：cDNA文库文库3.3.基因文库的目的基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。4.4.获取目的基因的根据：获取目的基因的根据：根据目的基因的有关信息。根据目的基因的有关信息。第9页，本讲稿共42页提取某种生物的提取某种生物的全部全部DNADNA用适当的限制酶切用适当的限制酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与载体连接片段与载体连接导入受体菌中储存导入受体菌中储存基因组文库基因组文库5.5.基因文库的构建方法之一基因文库的构建方法之一 直接分离法直接分离法第10页，本讲稿共42页某种生物的单链某种生物的单链mRNAmRNA单链互补单链互补DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段导入受体菌中储存导入受体菌中储存与载体连接与载体连接cDNAcDNA文库文库反（逆）转录酶反（逆）转录酶DNADNA聚合酶聚合酶反转录法：反转录法：cDNAcDNA的合成流程图解的合成流程图解5.5.基因文库的构建方法之二基因文库的构建方法之二第11页，本讲稿共42页基因组文库和部分基因文库基因组文库和部分基因文库(cDNA文库文库)比较比较第12页，本讲稿共42页 概念概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 多聚酶链式反应多聚酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段原理：原理：DNADNA双链复制双链复制2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因第13页，本讲稿共42页四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物：一对引物：热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶）模板模板DNA(DNA(需含有目的基因需含有目的基因 )条件：条件：与目的基因的与目的基因的起始段起始段互补的互补的DNA片段片段一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物一序列合成引物前提：前提：方式：方式：以以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）结果：结果：指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增能能 量量第14页，本讲稿共42页n过程：过程：变性、复性、延伸三步曲变性、复性、延伸三步曲变性：变性：加热至加热至9095双链双链DNADNA解链成为单链解链成为单链DNADNA复性：复性：冷却至冷却至5560引引物与单链物与单链DNADNA模板的特定互补模板的特定互补部位相配对和结合部位相配对和结合延伸：延伸：加热至加热至7075以以目的基因为模板，合成互补目的基因为模板，合成互补的新的新DNADNA链链变性变性复性复性延伸延伸第15页，本讲稿共42页2 2、具体过程、具体过程第16页，本讲稿共42页PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制的比较复制的比较PCR技术技术DNA复制复制相相同同点点原理原理原料原料条件条件不不同同点点解旋解旋方式方式场所场所酶酶结果结果碱基互补配对碱基互补配对四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸模板、能量、酶模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋在高温下变性解旋解旋酶催化解旋酶催化体外复制体外复制细胞核内细胞核内热稳定的热稳定的DNA聚合酶聚合酶细胞内的细胞内的DNA聚合酶聚合酶大量的大量的DNA片段片段形成整个形成整个DNA分子分子第17页，本讲稿共42页目的基因的目的基因的目的基因的目的基因的mRNAmRNA单链单链单链单链DNADNA双链双链双链双链DNADNA(即目的基因即目的基因即目的基因即目的基因)反转录反转录反转录反转录合成合成合成合成1）反转录法：）反转录法：3 3、人工合成的目的基因、人工合成的目的基因2 2）化学合成法：基因较小，核苷酸序列已知，可用）化学合成法：基因较小，核苷酸序列已知，可用）化学合成法：基因较小，核苷酸序列已知，可用）化学合成法：基因较小，核苷酸序列已知，可用DNA合成仪直接合成。（合成仪直接合成。（不要模板，不要不要模板，不要不要模板，不要不要模板，不要DNA聚合聚合聚合聚合酶酶酶酶）第18页，本讲稿共42页二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建 基因工程的核心基因工程的核心1、目的：、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。的基因能够表达和发挥作用。回顾：作为基因工程的载体必需满足哪些条回顾：作为基因工程的载体必需满足哪些条件呢？件呢？第19页，本讲稿共42页2 2、基因表达载体的组成：、基因表达载体的组成：复制原点复制原点+目的基因目的基因+启动子启动子+终止子终止子+标记基因标记基因它们各自的作用它们各自的作用是什么是什么?第20页，本讲稿共42页启动子：启动子：位于基因的首端的一位于基因的首端的一段段DNADNA片段，它是片段，它是RNARNA聚合酶识聚合酶识别和结合的部位，有了它才能别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出驱动基因转录出mRNAmRNA，最终，最终获得蛋白质获得蛋白质终止子：终止子：位于基因的尾端的一段位于基因的尾端的一段DNADNA片段，片段，终止终止mRNAmRNA的转录的转录标记基因标记基因的作用是的作用是为了为了鉴别鉴别受受体细胞中是否含有目的基因，从体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来而将有目的基因的细胞筛选出来第21页，本讲稿共42页载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分和复制原点两部分DNADNA片段。表达载体在载体片段。表达载体在载体基础上增加了基础上增加了目的基因、启动子、终止子目的基因、启动子、终止子三部三部分结构分结构启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表必需以表达载体的方式携带进去。达载体的方式携带进去。注意：注意：第22页，本讲稿共42页三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞（一）转化：（一）转化：（二）方法（二）方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受受体细胞内维持体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达第23页，本讲稿共42页1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：、将目的基因导入植物细胞的方法：（1 1）农杆菌转化法）农杆菌转化法 农杆菌特点：农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力单子叶植物没有感染能力原理：原理：Ti质粒上的质粒上的T-DNA可以转移到可以转移到受体细胞内，并整合到受体细胞染色体的受体细胞内，并整合到受体细胞染色体的DNA上。上。第24页，本讲稿共42页过程：过程：转化过程转化过程:Ti质粒质粒目的基因目的基因构建构建表达表达载体载体导入导入植植物物细细胞胞插入插入植物细胞染色植物细胞染色体体DNA表达表达新新性性状状转入转入农农杆杆菌菌第25页，本讲稿共42页（2）基因枪法基因枪法（3）花粉管通道法花粉管通道法第26页，本讲稿共42页2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法方法：显微注射法程序：程序：目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵细胞取卵细胞 受精受精 受精卵受精卵 显微注射显微注射 新性状动物新性状动物第27页，本讲稿共42页3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少方法：方法：用用Ca2+处理细胞处理细胞 感受态细胞感受态细胞 表达载表达载体与感受态细胞混合体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNA分子分子第28页，本讲稿共42页四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功第29页，本讲稿共42页（一）、检测（一）、检测1 1、检测转基因生物染色体的、检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入了上是否插入了目的基因目的基因 (关键步骤关键步骤).首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNA.用含目的基因的用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记片段用放射性同位素等作标记,以此做探针以此做探针.使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体表明目的基因已插入染色体DNA中中（1）方法方法:DNADNA分子间的杂交分子间的杂交（2）过程）过程:第30页，本讲稿共42页2 2、检测目的基因是否转录出了、检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA方法方法:DNADNA和和RNARNA分子之间的杂交分子之间的杂交过程过程:用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNA杂交杂交,若出若出现杂交带现杂交带,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNA第31页，本讲稿共42页（二）、鉴定（个体生物学水平）（二）、鉴定（个体生物学水平）3 3、检测目的基因是否翻译成蛋白质、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法:抗原抗体杂交抗原抗体杂交过程：过程：将目的基因表达出的蛋白质注射进某种动物体内，这将目的基因表达出的蛋白质注射进某种动物体内，这种蛋白质对于这种动物而言，是一种非已成分，免疫种蛋白质对于这种动物而言，是一种非已成分，免疫系统就会进行攻击，系统就会进行攻击，从而产生相应的抗体，抗体就从而产生相应的抗体，抗体就会和这种蛋白质进行特异性结合会和这种蛋白质进行特异性结合。若转基因生物翻。若转基因生物翻译出了这种蛋白质，就能和相应的抗体进行译出了这种蛋白质，就能和相应的抗体进行抗原抗原抗抗体杂交体杂交，从而出现，从而出现杂交带杂交带。第32页，本讲稿共42页四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功检测检测鉴定鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交（分子杂交（DNA-RNADNA-RNA分子杂交）分子杂交）抗原抗体杂交抗原抗体杂交第33页，本讲稿共42页归纳:基因工程的基本操作程序1.1.获取目的基因获取目的基因u从基因文库从基因文库u利用利用PCRPCRu化学方法人工合成化学方法人工合成2.2.构建基因表达载体构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u农杆菌转化法、显微注射法农杆菌转化法、显微注射法4.4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译u鉴定：鉴定：第34页，本讲稿共42页1）以下说法正确的是）以下说法正确的是 （）A、所所有有的的限限制制酶酶只只能能识识别别一一种种特特定定的的核核苷苷酸酸序序列列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运运载载体体必必须须具具备备的的条条件件之之一一是是：具具有有多多个个限制酶切点，以便与外源基因连接限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来、基因控制的性状都能在后代表现出来C C练习练习第35页，本讲稿共42页2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制、能复制 （）B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C、具有标记基因、具有标记基因 D、它是环状、它是环状DNAD D练习练习第36页，本讲稿共42页3）有关基因工程的叙述中，错误的是（）有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、限制性内切酶用于目的基因的获得限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、人工合成目的基因不用限制性内切酶人工合成目的基因不用限制性内切酶A A练习练习第37页，本讲稿共42页4）有关基因工程的叙述正确的是）有关基因工程的叙述正确的是 （）A、限制酶只在获得目的基因时才用、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料D D练习练习第38页，本讲稿共42页5）基基因因工工程程是是在在DNA分分子子水水平平上上进进行行设设计计施施工工的的。在在基基因因操操作作的的基基本本步步骤骤中中，不不进进行行碱碱基基互补配对的步骤是互补配对的步骤是 （）A、人工合成目的基因、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达C C练习练习第39页，本讲稿共42页 科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。和不懈的努力，才获得成功。起初把苏云金杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，起初把苏云金杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子启动子(抗虫抗虫基因首端基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入入终止子终止子(抗虫基因末端抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。长的植株，有了抗虫能力。资资 料料:第40页，本讲稿共42页 RNARNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。与其结合。转录开始后，转录开始后，RNARNA聚合酶沿聚合酶沿DNADNA分子移动，并以分子移动，并以DNADNA分子的一条链为模板合成分子的一条链为模板合成RNARNA。转录完毕后，转录完毕后，RNARNA链释放出来，紧接着链释放出来，紧接着RNARNA聚合酶聚合酶也从也从DNADNA模板链上脱落下来。模板链上脱落下来。非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子第41页，本讲稿共42页DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分子的分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。游离的单链。第42页，本讲稿共42页