《质谱代谢组学》PPT课件.ppt

代谢组学：基于质代谢组学：基于质谱的研究方法谱的研究方法汇报人：张富昌汇报人：张富昌指导教师：田中民指导教师：田中民西安交通大学西安交通大学20142014年年4 4月月1313日日内容提要内容提要一、代谢组学基本知识一、代谢组学基本知识二、二、GC-MS GC-MS和和LC-MSLC-MS三、发现代谢组学三、发现代谢组学一、代谢组学基本知识一、代谢组学基本知识1 1、什么是代谢组学、什么是代谢组学 代谢组学是通过比较对照组和实验组的代谢组代谢组学是通过比较对照组和实验组的代谢组（metabolomesmetabolomes，某一生物的所有代谢物组分），以寻，某一生物的所有代谢物组分），以寻找其它代谢谱差异的研究方法。这些差异可能与临床找其它代谢谱差异的研究方法。这些差异可能与临床生物标志物发现中研究的某些疾病相关，也可能与药生物标志物发现中研究的某些疾病相关，也可能与药物研发毒理研究中候选药物摄入后的代谢改变有关。物研发毒理研究中候选药物摄入后的代谢改变有关。一、代谢组学基本知识一、代谢组学基本知识2 2、代谢组学的一般流程、代谢组学的一般流程发现代谢组学发现代谢组学靶向代谢组学靶向代谢组学代谢组学代谢组学一、代谢组学基本知识一、代谢组学基本知识3 3、发现代谢组学的一般流程、发现代谢组学的一般流程鉴定，进行代谢谱分析后，测定这些代谢鉴定，进行代谢谱分析后，测定这些代谢物的化学结构物的化学结构代谢谱分析（也称为差异表达分析），在一组实验和对代谢谱分析（也称为差异表达分析），在一组实验和对照样品中，寻找丰度改变有统计学意义的感兴趣代谢物照样品中，寻找丰度改变有统计学意义的感兴趣代谢物解释，研究流程的最后一步，解释所发现的解释，研究流程的最后一步，解释所发现的代谢物与生物过程或生物状态之间的关联代谢物与生物过程或生物状态之间的关联一、代谢组学基本知识一、代谢组学基本知识4 4、靶向代谢组学的一般流程、靶向代谢组学的一般流程 靶向代谢组学分析的重点是采用大量天然和生物变异靶向代谢组学分析的重点是采用大量天然和生物变异样本，验证预先确认的代谢物。需要用分析标准品进行样本，验证预先确认的代谢物。需要用分析标准品进行定量分析。定量分析。一、代谢组学基本知识一、代谢组学基本知识5 5、代谢组学的一般流程、代谢组学的一般流程二、二、GC-MSGC-MS和和LC-MSLC-MS1 1、质谱在代谢组学中的应用、质谱在代谢组学中的应用 质谱质谱(MS)(MS)因具有广泛的动态范围、能进行可重现的定因具有广泛的动态范围、能进行可重现的定量分析，而且能够分析非常复杂的生理体液，已被用于量分析，而且能够分析非常复杂的生理体液，已被用于代谢组学的研究中。由于这类样品的复杂性，为了尽可代谢组学的研究中。由于这类样品的复杂性，为了尽可能多地检测代谢物，在质谱分析之前常常还要进行分离能多地检测代谢物，在质谱分析之前常常还要进行分离（气相色谱、液相色谱或毛细管电泳）（气相色谱、液相色谱或毛细管电泳）2 2、代谢组学中所用的分离技术、代谢组学中所用的分离技术气相色谱(GC)GC GC 要求挥发性，要用化学衍生化的样品要求挥发性，要用化学衍生化的样品液相色谱(LC)不能完全解决代谢组中亲水组分的分离问题不能完全解决代谢组中亲水组分的分离问题毛细管电泳(CE)所用的缓冲液却不能与质谱仪的离子源兼容所用的缓冲液却不能与质谱仪的离子源兼容 亲水相互作用色谱(HILIC)二、二、GC-MSGC-MS和和LC-MSLC-MS3 3、代谢组学的挑战、代谢组学的挑战 1 1、典型的代谢组学实验需大量样品才能得到精确统计的结果、典型的代谢组学实验需大量样品才能得到精确统计的结果 2 2、代谢组学研究通常需要多种技术；某种类型的样品往往比其、代谢组学研究通常需要多种技术；某种类型的样品往往比其他样品更适合采用某种特定的分析技术他样品更适合采用某种特定的分析技术 3 3、需要高度灵敏和精确的仪器、需要高度灵敏和精确的仪器 4 4、强大的软件工具对处理实验所产生的大量数据非常重要、强大的软件工具对处理实验所产生的大量数据非常重要 处处理理GC/MS GC/MS 和和LC/MS LC/MS 数数据的色据的色谱谱解卷解卷积积程序、程序、寻寻找有意找有意义义代代谢谢物的一系列物的一系列统计统计分析工具、分析工具、帮帮助助鉴鉴定代定代谢谢物的代物的代谢谢物物数数据据库库，以及最以及最终绘终绘制分子制分子间间相互作用相互作用网网络图络图的生物信息的生物信息学学软软件等。件等。二、二、GC-MSGC-MS和和LC-MSLC-MS4 4、GC/MS GC/MS 分析分析 气相色谱和质谱气相色谱和质谱(GC/MS)(GC/MS)是分析挥发性化学物质的有效组合。是分析挥发性化学物质的有效组合。气相色谱使用运载气推动分析物通过涂渍的熔融石英毛细管。气相色谱使用运载气推动分析物通过涂渍的熔融石英毛细管。基于分析物在气相和毛细管内涂层之间的不同分配实现分离。基于分析物在气相和毛细管内涂层之间的不同分配实现分离。二、二、GC-MSGC-MS和和LC-MSLC-MS4 4、GC/MS GC/MS 分析分析 电子轰击电离电子轰击电离(EI)(EI)是是GC/MS GC/MS 最常用的电离技术，非常耐用最常用的电离技术，非常耐用而且重现性好，而且不会受离子抑制的影响而且重现性好，而且不会受离子抑制的影响 简单的鉴定方法只需要扣除了背景的简单的鉴定方法只需要扣除了背景的EI EI 图谱，和一个通用图谱，和一个通用EIEI谱库检索，如谱库检索，如NIST NIST 谱库。更有效的鉴定方法是采用包含了谱库。更有效的鉴定方法是采用包含了预期的化合物保留时间和预期的化合物保留时间和EI EI 图谱的特定应用数据库同时对分图谱的特定应用数据库同时对分析物的色谱保留时间和质谱图进行检索析物的色谱保留时间和质谱图进行检索二、二、GC-MSGC-MS和和LC-MSLC-MS4 4、GC/MS GC/MS 分析分析 EI源的缺点 EI EI 电离经常会导致分子离子的丢失电离经常会导致分子离子的丢失-找不到匹配找不到匹配的的EIEI谱谱-缺少的分子离子的质量信息将使可能的化合物的数缺少的分子离子的质量信息将使可能的化合物的数量变得非常庞大量变得非常庞大 因此，因此，GC/MSGC/MS最适合对已知的或预期的代谢物进行分析最适合对已知的或预期的代谢物进行分析二、二、GC-MSGC-MS和和LC-MSLC-MS5 5、LC/MS LC/MS 分析分析 液相色谱可以分离无挥发性和未衍生化的代谢物。因此，液相色谱可以分离无挥发性和未衍生化的代谢物。因此，LC/MSLC/MS可以分析的化合物种类范围比可以分析的化合物种类范围比GC/MS GC/MS 更广更广 电喷雾电喷雾(ESI)(ESI)和大气压化学电离和大气压化学电离(APCI)(APCI)是是LC/MS LC/MS 最常用的两最常用的两种电离技术种电离技术-ESI-ESI 和和APCI APCI 都可能出现离子抑制，因此共洗脱都可能出现离子抑制，因此共洗脱化合物可能被低估甚至检测不到化合物可能被低估甚至检测不到 二、二、GC-MSGC-MS和和LC-MSLC-MS5 5、LC/MS LC/MS 分析分析 目前没有可用于目前没有可用于LC/MS LC/MS 鉴定的谱库。但由于鉴定的谱库。但由于LC/MS LC/MS 分析中分析中通常都有分子离子，其质量可以用代谢物数据库进行检索，如通常都有分子离子，其质量可以用代谢物数据库进行检索，如METLIN METLIN 数据库数据库 Q-TOF Q-TOF可以通过分子离子计算出经验式可以通过分子离子计算出经验式 LC/MS LC/MS 最适合作为未知代谢物研究中的探索方法，或者在多最适合作为未知代谢物研究中的探索方法，或者在多种目标代谢物由于挥发性问题不能用种目标代谢物由于挥发性问题不能用GC/MS GC/MS 进行分析时采用进行分析时采用二、二、GC-MSGC-MS和和LC-MSLC-MS6 6、LC/MS LC/MS、GC/MSGC/MS分析化合物的范围分析化合物的范围二、二、GC-MSGC-MS和和LC-MSLC-MS三、发现代谢组学三、发现代谢组学1 1、发现代谢组学的概念、发现代谢组学的概念发现代谢组学主要是将对照组和实验组的代谢组（某一生物发现代谢组学主要是将对照组和实验组的代谢组（某一生物体的全部代谢物）进行比对，以找出其代谢谱的差异。体的全部代谢物）进行比对，以找出其代谢谱的差异。发现代谢组学分析一般包括以下几个步骤：发现代谢组学分析一般包括以下几个步骤：代谢谱分析（也称为差异表达分析），在一组实验和对照代谢谱分析（也称为差异表达分析），在一组实验和对照样品中，寻找丰度改变有统计学意义的感兴趣代谢物样品中，寻找丰度改变有统计学意义的感兴趣代谢物 鉴定，进行代谢谱分析后，测定这些代谢物的化学结构鉴定，进行代谢谱分析后，测定这些代谢物的化学结构 解释，研究流程的最后一步，解释所发现的代谢物与生物解释，研究流程的最后一步，解释所发现的代谢物与生物过程或生物状态之间的关联过程或生物状态之间的关联三、发现代谢组学三、发现代谢组学2 2、代谢谱分析，寻找有统计学意义的代谢物、代谢谱分析，寻找有统计学意义的代谢物 分析重现性对表达谱分析至关重要分析重现性对表达谱分析至关重要-分析变异越小，分析变异越小，所需的重复数就越少所需的重复数就越少 代谢谱分析是经过复杂的特征提取，对已知代谢物进行代谢谱分析是经过复杂的特征提取，对已知代谢物进行靶向代谢谱分析，以寻找意外的代谢物靶向代谢谱分析，以寻找意外的代谢物-代谢物以其分子代谢物以其分子特征为标志表示，包括保留时间、质量或质谱图及丰度特征为标志表示，包括保留时间、质量或质谱图及丰度 在代谢谱分析过程中，并不一定要知道该化合物在代谢谱分析过程中，并不一定要知道该化合物/代谢代谢物是什么。但为了在不同次的样品分析之间跟踪这些化合物，物是什么。但为了在不同次的样品分析之间跟踪这些化合物，必需要用到其物理性质必需要用到其物理性质三、发现代谢组学三、发现代谢组学3 3、发现代谢组学有以下六个步骤、发现代谢组学有以下六个步骤 1 1、分析，包括代谢物的分离和检测，一般采用分析，包括代谢物的分离和检测，一般采用GC/MS GC/MS 或或LC/MSLC/MS 2 2、寻找特征，包括寻找样品中的所有代谢物。一个代谢寻找特征，包括寻找样品中的所有代谢物。一个代谢物检测不到，就意味着丧失了一次机会；因此尽可能多地检物检测不到，就意味着丧失了一次机会；因此尽可能多地检测出样品中的代谢物至关重要测出样品中的代谢物至关重要三、发现代谢组学三、发现代谢组学3 3、发现代谢组学有以下六个步骤、发现代谢组学有以下六个步骤三、发现代谢组学三、发现代谢组学 3 3、数据标准化，对保留时间和响应的漂移给予必要的校正、数据标准化，对保留时间和响应的漂移给予必要的校正 4 4、统计分析，用于发现样品组别之间的统计学差异、统计分析，用于发现样品组别之间的统计学差异 5 5、鉴定，、鉴定，GC/MS GC/MS 所得的所得的EI EI 图谱非常适合进行谱库检索图谱非常适合进行谱库检索 6 6、解释，一旦代谢物被鉴定出来，就需要通过解释实验结、解释，一旦代谢物被鉴定出来，就需要通过解释实验结果，推断其在代谢的生物通路中的地位果，推断其在代谢的生物通路中的地位3 3、发现代谢组学有以下六个步骤、发现代谢组学有以下六个步骤三、发现代谢组学三、发现代谢组学4 4、安捷伦、安捷伦GC/MS GC/MS 在发现代谢组学中的应用在发现代谢组学中的应用在 分析 方面：良好的重现性，以便对大量样品进行比对和校正良好的重现性，以便对大量样品进行比对和校正 卓越的可靠性，最大限度地延长正常运行时间，分析大量样品卓越的可靠性，最大限度地延长正常运行时间，分析大量样品 高灵敏度，能够检测复杂样品中的低水平代谢物，动态范围高灵敏度，能够检测复杂样品中的低水平代谢物，动态范围超过超过6 6 个数量个数量三、发现代谢组学三、发现代谢组学4 4、安捷伦、安捷伦GC/MS GC/MS 在发现代谢组学中的应用在发现代谢组学中的应用在 寻找特征 方面：安捷伦提供自动化质谱解卷积和鉴定软件安捷伦提供自动化质谱解卷积和鉴定软件(AMDIS)(AMDIS)进行解卷进行解卷积，该软件是积，该软件是NIST NIST 谱库检索软件包的一部分。谱库检索软件包的一部分。AMDIS AMDIS 软件软件包设计用于：包设计用于：发现相关的协变离子，用单组分色谱峰表示发现相关的协变离子，用单组分色谱峰表示 从复杂的从复杂的GC/MS GC/MS 数据中提取出单纯组分质谱图数据中提取出单纯组分质谱图 重建用于重建用于EI EI 谱库检索的质谱图谱库检索的质谱图三、发现代谢组学三、发现代谢组学4 4、安捷伦、安捷伦GC/MS GC/MS 在发现代谢组学中的应用在发现代谢组学中的应用在 数据标准化和统计学分析 方面：统计学分析软件需要具备以下功能：统计学分析软件需要具备以下功能：从大样本组和复杂的实验设计中，对数据（包括元数据）进从大样本组和复杂的实验设计中，对数据（包括元数据）进行轻松输入、标准化和对比行轻松输入、标准化和对比 发现复杂的实验设计中数据间的联系发现复杂的实验设计中数据间的联系不局限于两两对比不局限于两两对比 鉴定后能够通过通路分析进行生物学解释鉴定后能够通过通路分析进行生物学解释安捷伦的安捷伦的Mass Profiler Mass Profiler 专业软件让您能够轻松输入、标准化、专业软件让您能够轻松输入、标准化、比较并图形化显示大样本组的比较并图形化显示大样本组的GC/MS GC/MS 和和LC/MS LC/MS 数据，从而数据，从而快速发现代谢物标志物，并支持元数据分析。我们用的是快速发现代谢物标志物，并支持元数据分析。我们用的是SIMCA-PSIMCA-P三、发现代谢组学三、发现代谢组学4 4、安捷伦、安捷伦GC/MS GC/MS 在发现代谢组学中的应用在发现代谢组学中的应用在 数据标准化和统计学分析 方面：三、发现代谢组学三、发现代谢组学4 4、安捷伦、安捷伦GC/MS GC/MS 在发现代谢组学中的应用在发现代谢组学中的应用在 解释 方面：安捷伦安捷伦Mass Prof iler Mass Prof iler 专业软件的通路分析功能，可以利用专业软件的通路分析功能，可以利用已知的或独特的、用户基于已有数据设定的通路进行解释，大已知的或独特的、用户基于已有数据设定的通路进行解释，大大简化了这一过程大简化了这一过程三、发现代谢组学三、发现代谢组学5 5、LC/MS LC/MS 在发现代谢组学中的应用在发现代谢组学中的应用在 分析 方面：以下几点对代谢谱分析非常重要：以下几点对代谢谱分析非常重要：良好的良好的LC LC 和和MS MS 重现性，以便对大量样品进行比对和校正重现性，以便对大量样品进行比对和校正 卓越的可靠性，最大限度地延长正常运行时间，分析大量样卓越的可靠性，最大限度地延长正常运行时间，分析大量样品品 高灵敏度，能够检测复杂样品中的低水平代谢物，动态范围高灵敏度，能够检测复杂样品中的低水平代谢物，动态范围超过超过5 5 个数量级个数量级三、发现代谢组学三、发现代谢组学5 5、LC/MS LC/MS 在发现代谢组学中的应用在发现代谢组学中的应用在 寻找特征 方面：安捷伦的安捷伦的MassHunt er LC/MS MassHunt er LC/MS 工作站软件包含获得专利的分工作站软件包含获得专利的分子特征提取算法，专为精确质量子特征提取算法，专为精确质量LC/MS LC/MS 飞行时间数据而设计，飞行时间数据而设计，能够识别与单一化合物相关的协变离子。此外，它还能识别和能够识别与单一化合物相关的协变离子。此外，它还能识别和解析常见的电喷雾干扰离子，如钠加合离子或二聚体的形成。解析常见的电喷雾干扰离子，如钠加合离子或二聚体的形成。对这些离子鉴别和分组可以改善统计分析所用的定量估算，对这些离子鉴别和分组可以改善统计分析所用的定量估算，并从随后的分析中除去伪数据并从随后的分析中除去伪数据三、发现代谢组学三、发现代谢组学5 5、LC/MS LC/MS 在发现代谢组学中的应用在发现代谢组学中的应用在 鉴定 方面：METLIN METLIN数据库：数据库：安捷伦安捷伦METLIN METLIN 个人代谢物数据库软件是目前最全面的代谢个人代谢物数据库软件是目前最全面的代谢物数据库物数据库 可以根据关键词、分子式、化合物名称，或可以根据关键词、分子式、化合物名称，或K E G G K E G G、C A S C A S、HMP HMP 或或METLIN METLIN 编号进行信息查询编号进行信息查询 该数据库软件能够与该数据库软件能够与MassHunt er Prof iler MassHunt er Prof iler 专业软件无缝整合，专业软件无缝整合，共同进行统计学处理和通路分析共同进行统计学处理和通路分析三、发现代谢组学三、发现代谢组学5 5、LC/MS LC/MS 在发现代谢组学中的应用在发现代谢组学中的应用在 解释 方面：安捷伦安捷伦Mass Prof iler Mass Prof iler 专业软件的通路分析功能，可以利用已专业软件的通路分析功能，可以利用已知的或独特的、用户基于已有数据设定的通路进行解释，大大知的或独特的、用户基于已有数据设定的通路进行解释，大大简化了生物通路过程简化了生物通路过程