51DNA的粗提取与鉴定.ppt

5.1 DNA5.1 DNA的粗提取与的粗提取与鉴定鉴定怎样才能将细胞内的怎样才能将细胞内的DNA，也就，也就是遗传物质分离出来？是遗传物质分离出来？讨论讨论1 1：在在NaCl溶液浓溶液浓度低于度低于0.14 mol/L时，时，DNA的溶解度的溶解度随随NaCl溶液浓度的溶液浓度的增加而逐渐降低增加而逐渐降低;在在0.14 mol/L时，时，DNA溶解度最小；溶解度最小；当当NaCl溶液浓度继溶液浓度继续增加时，续增加时，DNA的的溶解度又逐渐增大。溶解度又逐渐增大。0溶解度溶解度NaCl浓度浓度0.14mol/L2mol/L思考思考1DNA在不同浓度在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特点？溶液中溶解度有何特点？基础知识基础知识2mol/L浓度浓度可使可使DNA溶解；溶解；0.14mol/L浓浓度可使度可使DNA析出。析出。基础知识基础知识0溶解度溶解度NaCl浓度浓度0.14mol/L 2mol/L 思考思考2要使要使DNA溶解，需要使用什么浓度？溶解，需要使用什么浓度？要使要使DNA析出，又需要使用什么浓度？析出，又需要使用什么浓度？将将DNA和蛋白质进一步分离和蛋白质进一步分离 思考思考3 酒精是一种常用有机溶剂，但酒精是一种常用有机溶剂，但DNA却不能溶于酒精（特别是却不能溶于酒精（特别是95冷却酒精）冷却酒精），但细胞中蛋白质可溶于酒精。问：采用，但细胞中蛋白质可溶于酒精。问：采用DNA不溶于酒精的原理，可以达到什么目的不溶于酒精的原理，可以达到什么目的？基础知识基础知识DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性对酶、高温和洗涤剂的耐受性蛋白酶能水解蛋白质，蛋白酶能水解蛋白质，但是对但是对DNA没有影响没有影响大多数蛋白质不能忍受大多数蛋白质不能忍受6080的高温，而的高温，而DNA在在80以上才会变性以上才会变性洗涤剂可以溶解细胞的洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白细胞膜，去除脂质和蛋白质，但对质，但对DNA没有影响没有影响蛋白酶，因为酶具有专一性，蛋白酶蛋白酶，因为酶具有专一性，蛋白酶只水解蛋白质而不会对只水解蛋白质而不会对DNA产生影响。温产生影响。温度值为度值为6080，因为该温度值蛋白质变，因为该温度值蛋白质变性沉淀，而性沉淀，而DNA不会变性。不会变性。基础知识基础知识 思考思考4 提取提取DNA还可以利用还可以利用DNA对酶、高对酶、高温和洗涤剂耐受性原理。利用该原理时，应选用温和洗涤剂耐受性原理。利用该原理时，应选用怎样的酶和怎样的温度值？怎样的酶和怎样的温度值？DNA与二苯胺（沸水与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。的试剂。能否使用甲基绿能否使用甲基绿（绿色）鉴定（绿色）鉴定DNA？DNA的鉴定的鉴定通过利用不同浓度通过利用不同浓度NaCl溶液溶解溶液溶解或析出或析出DNA，可以从细胞中提取，可以从细胞中提取DNA；再利用酒精进一步将；再利用酒精进一步将DNA与蛋与蛋白质分离开来，达到提纯的目的；最白质分离开来，达到提纯的目的；最后利用二苯胺试剂鉴定提取的物质是后利用二苯胺试剂鉴定提取的物质是否是否是DNA。原理总结原理总结哺乳动物血液和液体培养基中大肠杆菌。哺乳动物血液和液体培养基中大肠杆菌。（一）实验材料的选取（一）实验材料的选取不同生物的组织中不同生物的组织中DNA含量不同。含量不同。在选取材料时，应本着在选取材料时，应本着DNA含量高、含量高、材料易得、便于提取的原则。你认为材料易得、便于提取的原则。你认为教材提供的材料中哪些不适合提取教材提供的材料中哪些不适合提取DNA？实验设计实验设计鸡血、猕猴桃。鸡血、猕猴桃。（一）实验材料的选取（一）实验材料的选取从核从核DNA数目来看，猪数目来看，猪38条，鸡条，鸡78条，条，哺乳动物血哺乳动物血0条，猕猴桃条，猕猴桃58条，洋葱条，洋葱16条，条，豌豆豌豆14条，菠菜条，菠菜12条，大肠杆菌条，大肠杆菌1条。请条。请选择动植物材料各一种。选择动植物材料各一种。实验设计实验设计动物细胞的破碎较易，例如，在动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。即可。（二）破碎细胞，获取含（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液的滤液1.1.动物细胞动物细胞讨论讨论为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂（细胞作用，就加速了鸡血细胞的破裂（细胞膜和核膜的破裂），从而释放出膜和核膜的破裂），从而释放出DNA。植物细胞需要先用一定的洗涤剂植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜和食盐溶解细胞膜2.植物细胞植物细胞讨论讨论加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？答：洗涤剂是一些离子去污剂，能答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的释放；食盐的主要成分是的主要成分是NaCl，有利于，有利于DNA的溶的溶解。解。植物细胞需要先用一定的洗涤剂植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜和食盐溶解细胞膜2.植物细胞植物细胞实例：实例：提取洋葱提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液讨论讨论如果研磨不充分，会对实验结果产如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？生怎样的影响？答：研磨不充分会使细胞核内的答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的释放不完全，提取的DNA量变量变少，影响实验结果，导致看不到丝状少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。答：可能含有核蛋白、多糖和答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质等杂质讨论讨论此步骤获得的滤液中可能含有哪此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？些细胞成分？（三）去除滤液中的杂质（三）去除滤液中的杂质为了纯化提取的为了纯化提取的DNA需要将滤液需要将滤液作进一步处理。作进一步处理。方方 案案方案一：方案一：30mL滤液滤液35gNaCl同方同方向搅拌，向搅拌，DNA溶解溶解加入蒸馏水加入蒸馏水DNA析析出出过滤得到过滤物过滤得到过滤物放到放到2mol/LNaCl溶溶液中溶解液中溶解DNA-NaCl溶解液溶解液方案二：方案二：30mL滤液嫩肉粉（木瓜蛋滤液嫩肉粉（木瓜蛋白酶）白酶）静置静置1015分钟分钟DNA滤液滤液方案三：方案三：30mL滤液滤液6067处理处理过滤获得过滤获得DNA滤液滤液讨论讨论方案二与方案三的原理有什么不同？方案二与方案三的原理有什么不同？方案二是利用蛋白酶分解杂质方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质与蛋白质分开；分开；方案三利用的是方案三利用的是DNA和蛋白质和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与质变性，与DNA分离。分离。1.DNA的析出的析出 在滤液中仍然含有在滤液中仍然含有一些杂质，怎样除去这一些杂质，怎样除去这些杂质呢？得到的些杂质呢？得到的DNA呈何颜色？呈何颜色？滤液与等体积的冷却酒滤液与等体积的冷却酒精混合均匀，静置精混合均匀，静置23分分钟，析出的白色丝状物就钟，析出的白色丝状物就是是DNA。DNA呈白色。呈白色。（四）（四）DNA的析出与鉴定的析出与鉴定2.DNA的鉴定的鉴定试管试管2支，编号为支，编号为甲、乙甲、乙各加等量各加等量5mL的的NaCl溶液溶液甲甲中放入少量白色丝状中放入少量白色丝状物，使之溶解物，使之溶解各加各加4mL二苯胺，混合均二苯胺，混合均匀匀沸水浴沸水浴5min观观察颜色变化察颜色变化3.实验操作实验操作制备鸡血细胞液制备鸡血细胞液加柠檬酸钠，静置加柠檬酸钠，静置或离心或离心破碎细胞，释放破碎细胞，释放DNA 加蒸馏水，同一方加蒸馏水，同一方向快速搅拌向快速搅拌过滤，除去细胞壁、过滤，除去细胞壁、细胞膜等细胞膜等溶解核内溶解核内DNA 加入加入NaCl调节至调节至2mol/L，同一方向缓慢搅拌，同一方向缓慢搅拌去除滤液杂质去除滤液杂质加蒸馏水至加蒸馏水至0.14mol/L，过滤，再溶解到过滤，再溶解到2mol/L NaCl溶液中溶液中除去细胞质中除去细胞质中的大部分物质的大部分物质DNA的析出的析出与等体积与等体积95冷却酒冷却酒精混合，析出白色丝状物精混合，析出白色丝状物除去核蛋白、除去核蛋白、RNA、多糖等、多糖等DNA鉴定鉴定 二苯胺，沸水二苯胺，沸水浴，呈现浴，呈现蓝色蓝色实验过实验过程中的几点注意事程中的几点注意事项项 (1)两次使用蒸两次使用蒸馏馏水的作用：第一次用蒸水的作用：第一次用蒸馏馏水水是使是使鸡鸡血血细细胞吸水胞吸水涨涨破，提取核破，提取核DNA；第二次用；第二次用蒸蒸馏馏水稀水稀释释NaCl溶液，使溶液，使DNA析出。析出。(2)实验实验中三次中三次过滤过滤操作的比操作的比较较：过滤过滤次数次数 过滤过滤目的目的第一次第一次过滤过滤核外物核外物质质，除去不溶的，除去不溶的杂质杂质第二次第二次过滤过滤除除DNA外的其他核内物外的其他核内物质质，尤其是核蛋白尤其是核蛋白第三次第三次过滤过滤DNA滤滤液液1、以血液为实验材料时，每、以血液为实验材料时，每100ml血液中血液中需要加入需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。柠檬酸钠，防止血液凝固。2、加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容、加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。加入酒精和玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以加入酒精和玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧免加剧DNA分子的断裂，导致分子的断裂，导致DNA分子不分子不能形成絮状沉淀。能形成絮状沉淀。3、二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的、二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。效果。操作提示操作提示讨论讨论 答：用高浓度的盐溶液溶解答：用高浓度的盐溶液溶解DNA，能除去高盐中不能溶解的杂质；，能除去高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出复溶解与析出DNA，就能够除去与，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。溶解度不同的多种杂质。为什么反复地溶解与析出为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？能够去除杂质？练习巩固练习巩固1、欲使溶有、欲使溶有DNA的的2mol/L的的NaCl溶液中溶液中的的DNA析出，最有效的办法是析出，最有效的办法是A 加蒸馏水加蒸馏水 B 加矿泉水加矿泉水C 加清水加清水 D 加生理盐水加生理盐水2、与析出、与析出DNA粘稠物有关的叙述，不正确的是粘稠物有关的叙述，不正确的是A 操作时缓慢滴加蒸馏水，降低操作时缓慢滴加蒸馏水，降低DNA的溶解度的溶解度B 操作时用玻棒轻缓搅拌以保证操作时用玻棒轻缓搅拌以保证DNA分子的完整分子的完整C 加蒸馏水可以同时降低加蒸馏水可以同时降低DNA和蛋白质的溶解度和蛋白质的溶解度D 当丝状粘稠物不再增加时，当丝状粘稠物不再增加时，NaCl溶液的浓度可以溶液的浓度可以认为是认为是0.14mol/L课题延伸课题延伸本课题使用的洗涤剂是多组分的混本课题使用的洗涤剂是多组分的混合物，在严格的科学实验中很少使用。合物，在严格的科学实验中很少使用。实验室提取高纯度的实验室提取高纯度的DNA时，通常使用时，通常使用十六烷基三甲基溴化铵十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷、十二烷基硫酸钠基硫酸钠(SDS)或吐温等化学试剂。或吐温等化学试剂。