病理实验技术课件.ppt

病理实验技术病理实验技术吴长德吴长德沈阳农业大学畜牧兽医学院沈阳农业大学畜牧兽医学院病理学发展史病理学发展史病理学的发展与使用的工具和方法的更新密切相关。病理学的发展与使用的工具和方法的更新密切相关。l用解剖刀剪进行尸体检查，开展了器用解剖刀剪进行尸体检查，开展了器官病理学；官病理学；显微镜发明百年之后，建立了细显微镜发明百年之后，建立了细胞病理学；胞病理学；20世纪电子显微镜的问世，发展世纪电子显微镜的问世，发展了超微病理学；了超微病理学；l免疫组织化学促进了免疫病理学的形成；免疫组织化学促进了免疫病理学的形成；分子生物学带动分子病理学的兴起分子生物学带动分子病理学的兴起当前计算机和网络的应用，使病当前计算机和网络的应用，使病理学走向了信息病理学时代。理学走向了信息病理学时代。l因此，病理学经历了大体器官病理学、因此，病理学经历了大体器官病理学、细胞病理学、超微病理学、免疫病理学细胞病理学、超微病理学、免疫病理学和分子病理学的发展阶段，正在向和分子病理学的发展阶段，正在向21世世纪的信息病理学前进。纪的信息病理学前进。l“技术是病理学之母技术是病理学之母”;l“病理学的理论和技术被视为一辆车的病理学的理论和技术被视为一辆车的两个车轮两个车轮.缺一不可缺一不可,互为依存互为依存,互相促进互相促进,两者的结合决定着病理学的发展两者的结合决定着病理学的发展.”(第三军第三军医大学程天民院士医大学程天民院士)病理解剖的意义病理解剖的意义l验证临床诊断的正确性及治疗效果验证临床诊断的正确性及治疗效果l发现临床诊断和治疗上存在的问题，实发现临床诊断和治疗上存在的问题，实现病理和临床的交流与统一。现病理和临床的交流与统一。病理组织学病理组织切片的制作病理组织切片的制作l病理组织的取材病理组织的取材l病理组织的固定病理组织的固定l病理组织切片技术病理组织切片技术取材的重要性取材的重要性l病理标本的检查应包括大体和显微镜下病理标本的检查应包括大体和显微镜下观察两个方面，而正确的诊断往往取决观察两个方面，而正确的诊断往往取决于准确的显微镜下观察，因此制片质量于准确的显微镜下观察，因此制片质量的好坏将直接影响诊断结果的的好坏将直接影响诊断结果的准确性准确性，甚至会带来甚至会带来错误错误的结果。的结果。l一张好的切片与一张好的切片与取材取材和和固定固定都有密切都有密切的关系。对于免疫组织化学方法所需材的关系。对于免疫组织化学方法所需材料的取材，不仅要求组织细胞的料的取材，不仅要求组织细胞的形态完形态完整整保存，而且要最大程度的保存组织或保存，而且要最大程度的保存组织或细胞成分的细胞成分的抗原性抗原性。取材取材l确定取材的部位和块数确定取材的部位和块数l编号或标记编号或标记l固定固定l摄影，并编号存档摄影，并编号存档取材时注意事项取材时注意事项 l1.注意防止人为因素的影响注意防止人为因素的影响 l2.标本大小标本大小 l3.取材时间取材时间 l4.注意包埋方向注意包埋方向 l5.边缘标记边缘标记 l6.小标本的处理方法小标本的处理方法 l7注意特殊情况注意特殊情况 l8.取材数量取材数量 l9.清除多余成分清除多余成分 l10.重复取材重复取材 l11.核对核对 l12.组织存放组织存放 冰冻切片取材冰冻切片取材 l应取应取2块或更多组织块，如有特殊包埋面，应块或更多组织块，如有特殊包埋面，应向技术人员说明向技术人员说明l取材后应立即用液氮速冻，取材后应立即用液氮速冻，70或或40低低温冰箱保存。温冰箱保存。l制作冰冻切片的同一块组织（制作冰冻切片的同一块组织（“冰对冰对”）及其）及其剩余组织（剩余组织（“冰剩冰剩”，“冰余冰余”）须进一步做）须进一步做常规石蜡切片进行对照，尤以常规石蜡切片进行对照，尤以“冰对冰对”为重要，为重要，一方面可能因为病灶小，可能全部取在冰冻组一方面可能因为病灶小，可能全部取在冰冻组织块中，另一方面有利于病理医师对照阅片，织块中，另一方面有利于病理医师对照阅片，不断提高观察冰冻切片的能力不断提高观察冰冻切片的能力 活检组织取材活检组织取材l多多用用于于临临床床肿肿瘤瘤组组织织，除除前前面面讲讲到到的的各各点点注注意意事事项项外外，还还应应注注意意肿肿瘤瘤的的部部位位、形形状状、大大小小、颜颜色色以以及及与与周周围围组组织织的的关关系系，包包膜膜是是否否完完整整肿肿瘤瘤的的体体积积（长长、宽、高），甚至重量。宽、高），甚至重量。l对肝肾穿刺的标本，潮湿对肝肾穿刺的标本，潮湿 的纱布、青霉的纱布、青霉素小瓶、固定液等素小瓶、固定液等细胞标本的取材细胞标本的取材l细胞标本取材和制片方法一般有细胞标本取材和制片方法一般有 1 印片法印片法 2 穿刺法穿刺法 3 沉淀法沉淀法 4 活细胞标本的制备活细胞标本的制备1.印片法印片法l常用于活检和手术标本，新鲜标本沿病常用于活检和手术标本，新鲜标本沿病灶中心剖开，将病灶区轻压于载片上，灶中心剖开，将病灶区轻压于载片上，吹干后将其立即浸人固定液内吹干后将其立即浸人固定液内510min，取出自然干燥，低温储存，取出自然干燥，低温储存。2.穿刺法穿刺法l常用于淋巴结、软组织、肝、肾和肺等，常用于淋巴结、软组织、肝、肾和肺等，穿刺液少，可直接涂在载片上，细胞尽穿刺液少，可直接涂在载片上，细胞尽量涂均匀量涂均匀。3.沉淀法沉淀法l主要用于胸水、腹水、尿液和脑脊液等主要用于胸水、腹水、尿液和脑脊液等体液多而细胞少的标本。体液多而细胞少的标本。4.活细胞标本的制备活细胞标本的制备 多用于科研，用于常规病理诊断的较少。多用于科研，用于常规病理诊断的较少。标本主要来源于建株的标本主要来源于建株的培养细胞、短期培养细培养细胞、短期培养细胞和外周血胞和外周血等。等。细胞可直接培养在盖玻片上，固定后即可进行细胞可直接培养在盖玻片上，固定后即可进行染色观察或进行免疫组织化学染色或扫描电镜染色观察或进行免疫组织化学染色或扫描电镜标本制备。也可培养于培养瓶或培养板内，制标本制备。也可培养于培养瓶或培养板内，制成细胞悬液，收集一定的细胞还可进行涂片。成细胞悬液，收集一定的细胞还可进行涂片。可以经离心后，进行透射电镜标本制备。可以经离心后，进行透射电镜标本制备。组织固定方法组织固定方法 l固定的意义固定的意义：保持细胞与生活时的形态相似，防止保持细胞与生活时的形态相似，防止自溶与腐败。自溶与腐败。保持细胞内特殊的成分与生活状态时相保持细胞内特殊的成分与生活状态时相仿：经过固定，细胞内的一些蛋白质等仿：经过固定，细胞内的一些蛋白质等可沉淀或凝固，使其定位在细胞内的原可沉淀或凝固，使其定位在细胞内的原有部位，有利于其后物质的确切定位。有部位，有利于其后物质的确切定位。对于不同的物质应选用不同的固定剂和对于不同的物质应选用不同的固定剂和固定方法固定方法便于区别不同组织成分：组织细胞内的便于区别不同组织成分：组织细胞内的不同物质经固定后产生不同的不同物质经固定后产生不同的折光率折光率，对染料产生不同的亲和力，经染色后容对染料产生不同的亲和力，经染色后容易区别。易区别。有利于切片：固定剂有硬化作用，使组有利于切片：固定剂有硬化作用，使组织硬度增加，便于制片织硬度增加，便于制片固定液种类固定液种类l甲醛；甲醛；40%甲醛：水甲醛：水=1：9l4%的甲醛：的甲醛：10福尔马林福尔马林l渗透力强，固定均匀，对组织收缩小，渗透力强，固定均匀，对组织收缩小，具有硬化和防腐的作用，但破坏血红素，具有硬化和防腐的作用，但破坏血红素，使之失去原有颜色。使之失去原有颜色。l重铬酸钾水溶液（重铬酸钾水溶液（1-3%）；）；l苦味酸苦味酸(饱和水溶液饱和水溶液)；l升汞（升汞（5-7%）；）；l醋酸水溶液（醋酸水溶液（0.3-5%）；）；l铬酸水溶液（铬酸水溶液（0.5-1%）；）；l锇酸水溶液（锇酸水溶液（1-2%）；）；l丙酮、三氯醋酸、酒精（丙酮、三氯醋酸、酒精（80-95%）等。）等。l混合固定液（如混合固定液（如Altmamn液；液；B-5固定液；固定液；Carmoy液。液。固定时注意事项固定时注意事项 l固定液的量：固定液的量：4-5到到15-20倍倍l固定时间：固定时间：24小时以上小时以上l组织块大小：组织块大小：3-4毫米厚毫米厚l固定温度：常温固定温度：常温25度，低温度，低温4度度组织速冻方法组织速冻方法l组织速冻的方法组织速冻的方法液氮法液氮法干冰丙酮法干冰丙酮法 异戊烷液氮法异戊烷液氮法 常用方法为液氮和干冰丙酮法。常用方法为液氮和干冰丙酮法。注意事项注意事项液氮速冻时，标本盒不能直接浸入液氮，液氮速冻时，标本盒不能直接浸入液氮，以免组织膨胀破碎；以免组织膨胀破碎；速冻的包埋剂应适量；速冻的包埋剂应适量；新鲜组织不能放入新鲜组织不能放入10冰箱内缓慢冷冰箱内缓慢冷却，否则组织内水分可逐渐析出形成冰却，否则组织内水分可逐渐析出形成冰晶，造成组织结构破坏；晶，造成组织结构破坏；冷冻后的组织块应密封保存，防止失水；冷冻后的组织块应密封保存，防止失水；在组织块复温时，应在在组织块复温时，应在37加温速融，加温速融，自然复温将造成组织结构破坏。自然复温将造成组织结构破坏。组织切片技术组织切片技术l组织的脱水组织的脱水l透明透明l浸蜡浸蜡l包埋包埋l切片切片切片染色切片染色l切片脱蜡切片脱蜡l染色染色l脱水脱水l封片封片病理组织切片制作技术病理组织切片制作技术l组织固定组织固定24小时小时l流水冲洗流水冲洗12小时小时l脱水：脱水：80%、90%酒精各酒精各1小时，小时，95%酒酒精精2次，每次次，每次2小时，无水酒精小时，无水酒精1小时小时l透明：投入二甲苯透明：投入二甲苯15-30分钟分钟l浸蜡：软蜡、硬蜡各浸蜡：软蜡、硬蜡各1小时小时l包埋：石蜡包埋：石蜡l冷凝：冷水浸泡冷凝：冷水浸泡l切片：切片：4-6ml烤片：烤片：60，1-3小时小时l脱蜡：烤片冷凝后浸入二甲苯脱蜡：烤片冷凝后浸入二甲苯2次，每次次，每次10分钟；无水、分钟；无水、95%酒精各酒精各2分钟，分钟，90%、80%、70%酒精各酒精各1/2-1分钟；分钟；l冲洗：自来水冲洗冲洗：自来水冲洗5-10分钟分钟l染色：苏木素染色染色：苏木素染色10-15分，水洗分，水洗1分；分；l分化：盐酸酒精分化分化：盐酸酒精分化1-5秒，流水冲洗秒，流水冲洗5-10分钟；分钟；l复染：伊红染色复染：伊红染色2-4分，水洗分，水洗1-3分；分；l脱水：脱水：70-80-95%各各1分钟，分钟，100%2次，次，每次各每次各2分钟；分钟；l透明：浸入二甲苯透明：浸入二甲苯2次，每次次，每次2-3分；分；l封片：中性树胶。封片：中性树胶。l染色结果染色结果：胞核呈蓝色，胞浆淡红色，结缔组织鲜胞核呈蓝色，胞浆淡红色，结缔组织鲜红色，肌纤维深红色，红细胞橙红色，红色，肌纤维深红色，红细胞橙红色，软骨组织深蓝色。软骨组织深蓝色。