实验三 细菌简单染色和革兰氏染色生计(精品).ppt

实验三实验三 细菌的简单染色和细菌的简单染色和革兰氏染色革兰氏染色细菌的简单染色和革兰氏染色细菌的简单染色和革兰氏染色l 一 目的要求l 二 基本原理l 三 实验材料l 四 无菌操作过程l 五 操作步骤l 六 实验报告l 七 思考题一一 目的要求目的要求1 1 学学习习制制染染色色片片技技术术，学学习习简简单单染染色色 革革兰兰氏氏染染色色原原理理，理解理解着色机理着色机理。2 2学习并掌握学习并掌握无菌操作的无菌操作的技术技术。3 3 掌握掌握简单染色简单染色 革兰氏染色的方法，并能革兰氏染色的方法，并能正确染色正确染色4 巩固显微镜油镜的使用巩固显微镜油镜的使用方法。方法。（一）细菌的简单染色原理（一）细菌的简单染色原理（二）革兰氏染色基本原理革兰氏染色基本原理二二 基本原理基本原理l细菌细胞微小，且含水量较多，在普通光镜下表现为无色透明，不易观察，细菌细胞微小，且含水量较多，在普通光镜下表现为无色透明，不易观察，所以必须进行染色处理，使所以必须进行染色处理，使细胞着色细胞着色，便于观察。，便于观察。l简单染色是使用简单染色是使用单一染料单一染料染色，可用于观察染色，可用于观察细菌形态、大小、及排列方式细菌形态、大小、及排列方式.l染色前一般要将细胞染色前一般要将细胞固定固定，其目的是，其目的是杀死杀死菌体并菌体并使之粘附使之粘附于玻片上，还可以于玻片上，还可以增强菌体的着色能力增强菌体的着色能力。固定有。固定有加热法加热法和化学法两种，无论采用何种方法均应和化学法两种，无论采用何种方法均应维持细胞原有形态。维持细胞原有形态。（一）细菌的简单染色原理（一）细菌的简单染色原理（二）革兰氏染色基本原理（二）革兰氏染色基本原理 革革兰兰氏氏染染色色是是用用于于细细菌菌鉴鉴别别的的一一种种重重要要染染色色方方法法。它它是是根根据据革革兰兰氏氏阳阳性性细细菌菌、阴阴性性细细菌菌细细胞胞壁壁结结构构、组组成成的的不不同同而而使使用用一一系系列列的的染染色色处处理理使使之之差差别别显显色色。其其染染色色方方法法是是先先将将细细菌菌分分别别用用结结晶晶紫紫和和碘碘液液初初染染媒媒染染后后，乙乙醇醇脱脱色色，再再经经复复染染剂剂复复染染。最最终终被被染染成成红红色色的的是是革革兰兰氏氏阴阴性性细细菌菌；被被染染成成紫紫色色的的是是革兰氏阳性细菌革兰氏阳性细菌。v革兰氏染色原理：革兰氏染色原理：第一步：第一步：结晶紫使菌体着上紫色结晶紫使菌体着上紫色第二步：第二步：碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，能被细胞壁阻碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，能被细胞壁阻留在细胞内。留在细胞内。第三步：第三步：酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现不同的反应。酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现不同的反应。G G+菌：菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫-碘复合物被阻留在细胞内，碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色。细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色。GG菌：菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因其含脂量高因其含脂量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出碘复合物溶出细胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无色，蕃红复染后呈红色。细胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无色，蕃红复染后呈红色。1234？三三 实验材料实验材料大肠杆菌（大肠杆菌（24 24 h h 培养）斜面菌种培养）斜面菌种枯草杆菌（枯草杆菌（16 16 h h 培养）培养）斜面菌种斜面菌种四四 无菌操作过程无菌操作过程无菌操作无菌操作：不让不让除我们接种的微生物以外除我们接种的微生物以外 其它微生物其它微生物侵入侵入的技术。的技术。（一）（一）简单染色操作步骤简单染色操作步骤1 1涂片：载玻片涂片：载玻片2 2 无菌水无菌水3 3 斜面菌斜面菌种种4 4 无菌操无菌操作作5 5 均匀的均匀的薄层薄层6 62 2 干燥：干燥：1.1.3 3固定：加热固固定：加热固定定五五 操作步骤操作步骤4染色：染色：结晶紫染结晶紫染1min 或或蕃红染蕃红染2-3min 或或石炭酸复红石炭酸复红 染染1min。5 5水洗：水洗：6 6 干燥：干燥：7 7镜检：镜检：低倍镜低倍镜观察以确定目标观察以确定目标和范围，再换用和范围，再换用油镜油镜观察绘图。观察绘图。（二）（二）革兰氏染色操作步骤革兰氏染色操作步骤1 1涂片：方法同单染色，然后干燥、固定。涂片：方法同单染色，然后干燥、固定。2 2初染：滴加初染：滴加结晶紫结晶紫染色染色1 1minmin，后用水冲洗。后用水冲洗。3 3媒染：滴加媒染：滴加碘液碘液染色染色1-21-2minmin，后用水冲洗，后用水冲洗，甩尽残余水甩尽残余水4 4脱色：用脱色：用95%95%乙醇冲洗乙醇冲洗3030秒秒（需要严格控制时间和浓度需要严格控制时间和浓度），），然后立即用水冲洗。然后立即用水冲洗。5 5复染：用蕃红或石炭酸复红覆盖涂片进行复染，复染：用蕃红或石炭酸复红覆盖涂片进行复染，蕃红染蕃红染 2-3 2-3minmin，如果如果石炭酸复红染石炭酸复红染1 1minmin。水洗，晾干。水洗，晾干。6 6镜检：先用低倍镜观察，后用镜检：先用低倍镜观察，后用油镜油镜观察观察阳性菌阳性菌阴性菌阴性菌1234六六 实验报告实验报告1写出实验目的写出实验目的2 写出简单染色、革兰氏染色的基本原理写出简单染色、革兰氏染色的基本原理3根据实验结果绘出简单染色和革兰氏染色的结果图。根据实验结果绘出简单染色和革兰氏染色的结果图。4思考题：思考题：A如果对一如果对一未知菌未知菌进行革兰氏染色，如何能确进行革兰氏染色，如何能确证染色结果正确可靠？证染色结果正确可靠？5 C为什么说为什么说95%酒精脱色是革兰氏染色的关键步酒精脱色是革兰氏染色的关键步骤？骤？下次实验内容：下次实验内容：实验四实验四 微生物细胞大小的测定及显微镜下直接计数微生物细胞大小的测定及显微镜下直接计数菌名：放大倍数：细菌简单染色结果图细菌简单染色结果图细菌革兰氏染色结果图细菌革兰氏染色结果图 要求：标出菌名、颜色、阳性或阴性菌放大倍数：