基因工程12-酵母基因工程.ppt

第十四章第十四章酵母基因工程酵母基因工程E 酵母菌的表达系统酵母菌的表达系统C 酵母菌的载体系统酵母菌的载体系统B 酵母菌的宿主系统酵母菌的宿主系统A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征F 利用重组利用重组酵母生产乙肝疫苗酵母生产乙肝疫苗D 酵母菌的转化系统酵母菌的转化系统A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征酵母菌的分类学特征酵母菌的分类学特征 酵母菌酵母菌（Yeast）是一群以是一群以芽殖芽殖或或裂殖裂殖方式进行方式进行无性繁殖无性繁殖的单的单细胞细胞真核生物真核生物，分属于，分属于子囊菌纲子囊菌纲（子囊酵母菌）、（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子菌纲（担担子酵母菌子酵母菌）、半知菌类（）、半知菌类（半知酵母菌半知酵母菌），共由，共由56个属和个属和500多个多个种组成。酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。种组成。酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征酵母菌表达外源基因的优势酵母菌表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便能将外源基因表达产物分泌至培养基中能将外源基因表达产物分泌至培养基中具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的认定为安全的基因工程受体系统基因工程受体系统(Generally Recognized As Safe GRAS)酵母菌是最简单的真核模式生物酵母菌是最简单的真核模式生物B 酵母菌的宿主系统酵母菌的宿主系统提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌抑制超糖基化作用的突变宿主菌抑制超糖基化作用的突变宿主菌减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：酵母属酵母属 如酿酒酵母（如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）克鲁维酵母属克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母（如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）毕赤酵母属毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母（如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）裂殖酵母属裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）汉逊酵母属汉逊酵母属 如多态汉逊酵母（如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha）其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。赤酵母表达外源基因最理想。提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型ssc1 改善重组蛋白分泌改善重组蛋白分泌ssc2 提高重组蛋白表达提高重组蛋白表达rgr1 提高重组蛋白表达提高重组蛋白表达ose1 提高重组蛋白表达提高重组蛋白表达ssc11 改善重组蛋白分泌改善重组蛋白分泌rho-提高重组蛋白表达提高重组蛋白表达突变类型突变类型生物效应生物效应抑制超糖基化作用的突变宿主菌抑制超糖基化作用的突变宿主菌能抑制超糖基化的突变类型能抑制超糖基化的突变类型mnn 甘露糖生物合成缺陷型甘露糖生物合成缺陷型alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型och 外侧糖链添加缺陷型外侧糖链添加缺陷型突变类型突变类型生物效应生物效应 许多真核生物的蛋白质在其天冬酰胺侧链上接有寡糖许多真核生物的蛋白质在其天冬酰胺侧链上接有寡糖基团，常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由基团，常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核糖基核心心和和外侧糖链外侧糖链两部分组成。两部分组成。酵母菌普遍拥有蛋白质酵母菌普遍拥有蛋白质的糖基化系统，但野生型酿的糖基化系统，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈超糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向，因此选择超糖基化缺倾向，因此选择超糖基化缺陷株非常重要。陷株非常重要。减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌泛素介导的蛋白质降解作用泛素介导的蛋白质降解作用蛋白酶体蛋白酶体LysHOOCUbiquitin 76 aa ubiquitin ligase E3 Lysubiquitin ligase E3 Lys靶蛋白靶蛋白靶蛋白酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因酵母菌共有四个泛素编码基因：酵母菌共有四个泛素编码基因：UBI 1 编码泛素编码泛素-羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长期表达对数生长期表达 稳定期关闭稳定期关闭UBI 2 编码泛素编码泛素-羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长期表达对数生长期表达 稳定期关闭稳定期关闭UBI 3 编码泛素编码泛素-羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白76（CEP76）对数生长期表达对数生长期表达 稳定期关闭稳定期关闭UBI 4 编码泛素五聚体编码泛素五聚体 对数生长期关闭对数生长期关闭 稳定期表达稳定期表达酵母菌共有七个泛素连接酶基因：酵母菌共有七个泛素连接酶基因：UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7泛素降解途径衰减的酿酒酵母泛素降解途径衰减的酿酒酵母在酿酒酵母菌中，泛素主要由在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，基因表达，UBI 4-突变株能突变株能正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，因正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，因此此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体缺陷突变株是外源基因表达理想的受体UBI 4缺陷型：缺陷型：Ubc4-ubc5 双突变型：双突变型：泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效C 酵母菌的载体系统酵母菌的载体系统酵母菌克隆表达质粒的构建酵母菌克隆表达质粒的构建酵母菌中的野生型质粒酵母菌中的野生型质粒酵母菌中的野生型质粒酵母菌中的野生型质粒酿酒酵母中的酿酒酵母中的2m m环状质粒环状质粒几乎所有的酿酒酵母中都含有几乎所有的酿酒酵母中都含有2m m双链环状质粒，拷贝数达双链环状质粒，拷贝数达50至至100个。个。酵母菌克隆表达质粒的构建酵母菌克隆表达质粒的构建含有含有ARS的的YRp质粒的构建质粒的构建n酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括自主复制序列、标记酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括自主复制序列、标记基因、克隆位点、大肠杆菌质粒基因、克隆位点、大肠杆菌质粒DNA。n以以ARS为复制子的质粒称为为复制子的质粒称为YRp。n以以2m m质粒上的复制元件为复制子的质粒称为质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp。上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，但个，但培养几代后，质粒的丢失率高达培养几代后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配，主要是由于分配不均匀所致。不均匀所致。含有含有CEN的的YCp质粒的构建质粒的构建 CEN为酵母菌染色体为酵母菌染色体DNA着丝粒区，与染色体均匀分配有关着丝粒区，与染色体均匀分配有关的序列。的序列。将将CEN DNA插入含插入含ARS的质粒中，获得的新载体称为的质粒中，获得的新载体称为YCp。YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1-5个。个。含有含有TEL的的YAC质粒的构建质粒的构建含有酵母菌染色体含有酵母菌染色体DNA同源序列的同源序列的YIp质粒的构建质粒的构建 在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标记基特定序列和标记基因，构建出来的质粒称为因，构建出来的质粒称为Yip。目的基因表达盒通常插在染色体目的基因表达盒通常插在染色体DNA特定序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染特定序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体色体DNA区域。区域。D 酵母菌的转化系统酵母菌的转化系统转化质粒在酵母细胞中的命运转化质粒在酵母细胞中的命运酵母菌的转化程序酵母菌的转化程序用于转化子筛选的标记基因用于转化子筛选的标记基因碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化 酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）、等）、PEG、热休热休克处理后，也可高效吸收质粒克处理后，也可高效吸收质粒DNA，而且具有下列特性：而且具有下列特性：吸收线型吸收线型DNA的能力明显大于环状的能力明显大于环状DNA，两者相差两者相差80倍倍共转化现象极少发生共转化现象极少发生酵母菌的转化程序酵母菌的转化程序酵母菌电击转化法酵母菌电击转化法优点：优点：不依赖于受体细胞的遗传特征不依赖于受体细胞的遗传特征培养容易培养容易转化率可高达转化率可高达105/m mg DNA。转化质粒在酵母细胞中的命运转化质粒在酵母细胞中的命运单链的转化率是双链的单链的转化率是双链的10-30倍倍含有复制子的单链质粒进入细胞转化为双链并复制含有复制子的单链质粒进入细胞转化为双链并复制不含复制子的单链质粒进入细胞后能高效地同源整合不含复制子的单链质粒进入细胞后能高效地同源整合克隆在克隆在YIp整合型质粒上的外源基因，如果含有染色体整合型质粒上的外源基因，如果含有染色体DNA的同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子总数的的同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子总数的50-80%用于转化子筛选的标记基因用于转化子筛选的标记基因 用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有营养缺陷型互补基用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有营养缺陷型互补基因和显性基因两大类因和显性基因两大类 营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA 但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难营养缺陷型的互补基因营养缺陷型的互补基因显性标记基因的编码产物是毒性物质的抗性蛋白显性标记基因的编码产物是毒性物质的抗性蛋白显性标记基因显性标记基因 aph 氨基糖苷转移酶氨基糖苷转移酶 抗抗G418 cat 氯霉素乙酰转移酶氯霉素乙酰转移酶 抗氯霉素抗氯霉素 dhfr 二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶 抗氨甲喋呤和磺胺抗氨甲喋呤和磺胺 cup1 铜离子螯合物铜离子螯合物 耐受铜离子耐受铜离子 suc2 蔗糖转化酶蔗糖转化酶 耐受高浓度蔗糖耐受高浓度蔗糖 ilv2 乙酰乳糖合成酶乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草剂抗硫酰脲除草剂标记基因标记基因编码产物编码产物遗传表型遗传表型E 酵母菌的表达系统酵母菌的表达系统外源基因在酵母菌中表达的限制因素外源基因在酵母菌中表达的限制因素酵母菌启动子的可控性酵母菌启动子的可控性酵母菌表达系统的选择酵母菌表达系统的选择酵母菌启动子的可控性酵母菌启动子的可控性pho4TS-PHO5启动子：启动子：酿酒酵母中酿酒酵母中PHO5启动子的正调控因子是启动子的正调控因子是PHO4PHO4温度敏感型突变基因温度敏感型突变基因pho4TS的编码产物在的编码产物在35时失活时失活装在装在pho4TS-PHO5启动子下游的外源基因在启动子下游的外源基因在35时关闭时关闭23诱诱导表达导表达温度控制型启动子温度控制型启动子a a 型启动子：型启动子：酿酒酵母有酿酒酵母有a和和a两种单倍体，两种单倍体，分别由分别由MATa和和MATa两个等两个等位基因决定。位基因决定。a1因子决定因子决定a细胞特征表达细胞特征表达a2因子阻遏因子阻遏a细胞细胞特征表达特征表达a1-a2阻遏阻遏a细胞特征表达细胞特征表达编码编码a2因子的基因突变型因子的基因突变型hmla2-102能产生能产生a2变体，它变体，它能灭活能灭活a1，同时阻遏同时阻遏a型。型。温度控制型启动子温度控制型启动子a 型启动子型启动子hmla2-102 MATaa1Sir3-8TSa a 型启动子型启动子 受体细胞基因组受体细胞基因组 重组质粒重组质粒a 型启动子型启动子hmla2-102 MATaa1Sir3-8TSa a 型启动子型启动子a2a12535酿酒酵母的半乳酿酒酵母的半乳糖利用酶系由糖利用酶系由GAL1 GAL7和和 GAL10基因编码基因编码超诱导型启动子超诱导型启动子GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80半乳糖诱导效果不明显，基因基底水平表达半乳糖诱导效果不明显，基因基底水平表达Gene XUASGAL4GAL80半乳糖诱导时，半乳糖诱导时，GAL4高效表达，外源基因受诱导且超高效表达高效表达，外源基因受诱导且超高效表达GAL10Promoter限制因子限制因子外源基因在酵母菌中表达的限制因素外源基因在酵母菌中表达的限制因素外源基因稳态外源基因稳态mRNA的浓度的浓度外源基因外源基因mRNA的翻译活性的翻译活性酵母菌对密码子的偏爱性酵母菌对密码子的偏爱性在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油醛在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油醛-3-磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶GAPDH、磷酸甘油激酶磷酸甘油激酶PKG、乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶ADH）中中96%以上的以上的氨基酸是由氨基酸是由25个密码子编码的个密码子编码的酵母菌表达系统的选择酵母菌表达系统的选择 酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，多种重组外源蛋白获得酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，多种重组外源蛋白获得成功表达。但最大问题在于其超糖基化能力，往往使得有些重组成功表达。但最大问题在于其超糖基化能力，往往使得有些重组蛋白与细胞紧密结合，而不能大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵蛋白与细胞紧密结合，而不能大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。母型的表达系统来弥补。酿酒酵母表达系统酿酒酵母表达系统 乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源已被广泛用作重组异源蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也能稳定遗传也能稳定遗传40代以上。代以上。乳酸克鲁维酵母表达系统乳酸克鲁维酵母表达系统 乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优于酿酒酵母表达系统。优于酿酒酵母表达系统。巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基中生长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，中生长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长迅速、乙醇氧化酶基因因此生长迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子、表达的可所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯德毕赤酵母表达系统的三大优势。诱导性是巴斯德毕赤酵母表达系统的三大优势。巴斯德毕赤酵母表达系统巴斯德毕赤酵母表达系统 外源基因一般整合入染色体外源基因一般整合入染色体DNA上。表达水平取决于整合拷上。表达水平取决于整合拷贝数。目前已有贝数。目前已有20余种具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵余种具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。母系统中获得成功表达。u重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。u目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该系统中目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该系统中获得成功表达。获得成功表达。多型汉逊酵母表达系统多型汉逊酵母表达系统F 利用重组利用重组酵母生产乙肝疫苗酵母生产乙肝疫苗 由乙型肝炎病毒（由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一种感染引起的急慢性乙型肝炎是一种严重的传染病，每年约有严重的传染病，每年约有200万病人死亡，并有万病人死亡，并有3亿人成为亿人成为HBV携携带者，其中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌患者。目前对带者，其中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌患者。目前对乙型肝炎病毒还没有一种有效的治疗药物，因此高纯度乙型疫苗乙型肝炎病毒还没有一种有效的治疗药物，因此高纯度乙型疫苗的生产对预防病毒感染具有重大的社会效益，而利用重组酵母大的生产对预防病毒感染具有重大的社会效益，而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为其广泛应用提供了可靠的保证。规模生产乙型疫苗为其广泛应用提供了可靠的保证。产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母 乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质肝疫苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜来源的疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大膜来源的疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模产业化。规模产业化。传统乙肝疫苗的制备传统乙肝疫苗的制备产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母 20世纪世纪80年代开始选择酿酒酵母表达重组年代开始选择酿酒酵母表达重组HBsAg，主要工作主要工作包括将包括将S多肽的编码置于多肽的编码置于ADH1启动子控制下，转化子能表达出具启动子控制下，转化子能表达出具有免疫活性的重组蛋白，它以球形脂蛋白颗粒的形式存在，平均有免疫活性的重组蛋白，它以球形脂蛋白颗粒的形式存在，平均颗粒直径为颗粒直径为 22 nm，其结构和形态均与慢性乙肝病毒携带者血清其结构和形态均与慢性乙肝病毒携带者血清中的病毒颗粒相同。中的病毒颗粒相同。目前，由酿酒酵母生产的重组目前，由酿酒酵母生产的重组HBsAg颗粒已作为乙肝疫苗商颗粒已作为乙肝疫苗商品化重组产物的最终产量可达细胞总蛋白量的品化重组产物的最终产量可达细胞总蛋白量的1%-2%。产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建PARS2Bgl II5 AOX1HBsAgHIS43 AOX1Bgl IIpBSAG15111 kbBgl II5 AOX1 HBsAgPHIS43 AOX1his+的转化子的转化子重组分子重组分子转化转化his-的受体细胞的受体细胞染色体染色体DNA重组巴斯德毕赤酵母的性能重组巴斯德毕赤酵母的性能重组菌首先在含有甘油的培养基中培养，待甘油耗尽后，加入甲重组菌首先在含有甘油的培养基中培养，待甘油耗尽后，加入甲醇诱导醇诱导HBsAg表达，最终表达，最终S蛋白的产量可达细胞可溶性蛋白总量蛋白的产量可达细胞可溶性蛋白总量的的3%。在大规模的生产过程中，巴斯德毕赤酵母工程菌在一个在大规模的生产过程中，巴斯德毕赤酵母工程菌在一个240L的发的发酵罐中培养，最终可获得酵罐中培养，最终可获得90克克22nm的的HBsAg颗粒，足够制成颗粒，足够制成900万份乙肝疫苗。万份乙肝疫苗。