双向琼脂扩散试.ppt
双向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验授课对象：临床医学专业八年制本科授课对象：临床医学专业八年制本科授课教员：汤玉瑜授课教员：汤玉瑜 授课单位：第三军医大学基础部免疫学教研室授课单位：第三军医大学基础部免疫学教研室教学重点教学重点 琼脂的制备方法 双向琼脂扩散实验的原理实验目的实验目的 掌握双向琼脂扩散试验的原理 理解琼脂的制备方法 了解双向琼脂扩散实验的应用 教学难点教学难点 如何根据沉淀线判断抗原或抗体的浓度 使使用用教材教材免疫学实验第一版 朱道银 吴玉章 科学出版社 2008 参参 考考 书书免疫学第四版 龚非力 科学出版社 2007 Medical Immunologyedical Immunology10th10th，T.G.ParslowT.G.Parslow 推荐网站推荐网站医学免疫学网络教学 http:/192.168.10.21/mta/美国国立生物技术信息中心：http:/www.ncbi.nlm.nih.gov中国生物信息网：http:/www.biosino.org概概 述述n临床免疫检验技术临床免疫检验技术的出现最早可追溯至19世纪末。1896年，Widal发现在伤寒杆菌中加入伤寒病菌人的血清可致伤寒杆菌发生特异的凝集现象，利用这种凝集现象可有效的诊断伤寒病，这就是最早用于病原体感染诊断的免疫凝集试验，亦即著名的肥达试验(Widal test)。常见的免疫检验技术常见的免疫检验技术：n经典的免疫学反应经典的免疫学反应凝集反应凝集反应沉淀反应沉淀反应补体结合反应补体结合反应中和反应中和反应n免疫电泳技术免疫电泳技术n免疫标记技术免疫标记技术免疫荧光免疫荧光免疫酶技术免疫酶技术放射免疫测定放射免疫测定 抗原抗体反应抗原抗体反应（antigen-antibody reaction）是抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。它既可发生在体内，也可发生在体外。体外的抗原抗体反应表现为沉淀沉淀、凝集、细胞溶解、补体结合、中和反应等反应现象。兰德施泰纳，1868年-1943年，普林斯顿洛克菲勒医学研究所，发现人的主要血型系统而获1930年诺贝尔生理学或医学奖。他最初研究化学,1896年後对血清学和免疫学产生兴趣,将化学方法引入血清学研究,发现不同人的血清与血细胞混合後可发生凝集反应,1901年用抗A血清和抗B血清将血液分成ABC(後称O)三型。n沉淀反应沉淀反应（precipitation）是可溶性抗原与相应抗体在电解质存在的条件下发生特异性结合所出现的沉淀现象。n影响沉淀影响沉淀反应的主要因素反应的主要因素 1.抗原、抗体反应的浓度、比例 2.电解质 3.温度 4.酸碱度可溶性抗原可溶性抗原相应抗体相应抗体+沉淀线或沉淀环沉淀线或沉淀环分分 类类沉沉淀淀反反应应环状沉淀反应环状沉淀反应絮状沉淀反应絮状沉淀反应琼脂扩散试验琼脂扩散试验双向扩散双向扩散单向扩散单向扩散电电泳泳技技术术火箭免疫电泳火箭免疫电泳对流免疫电泳对流免疫电泳Question:n怎样才能在无特殊仪器设备而又操作简便的定性检测血清中各种免疫球蛋白、甲胎蛋白、乙肝表面抗原等？实验原理实验原理 可溶性抗原与相应抗体在含适量电解质的可溶性抗原与相应抗体在含适量电解质的琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶板板的对应孔中各自向四周的对应孔中各自向四周自由扩散自由扩散,若两者分子比例适当若两者分子比例适当,则则在扩散的一定时间后在两孔之间相遇并生成白色沉淀线在扩散的一定时间后在两孔之间相遇并生成白色沉淀线.n沉淀物形成的主要原是因为抗原与抗体分子表面的疏水基沉淀物形成的主要原是因为抗原与抗体分子表面的疏水基团相互接近而有效的排出它们之间的水分团相互接近而有效的排出它们之间的水分.n免疫复合物的形成通常经过两步免疫复合物的形成通常经过两步:抗原与抗体的特异性结抗原与抗体的特异性结合合;形成肉眼可见的免疫复合物晶格形成肉眼可见的免疫复合物晶格1.1.检测未知抗原或抗体检测未知抗原或抗体2.2.抗原性质分析抗原性质分析 3.3.抗体效价滴定抗体效价滴定4.4.抗原或抗体纯度鉴定抗原或抗体纯度鉴定双向琼脂扩散试验的应用双向琼脂扩散试验的应用AgAb A B C D E F A:A:浓度浓度AgAg、AbAb及扩散率近似；及扩散率近似；B B：浓度浓度AgAg、AbAb近似，扩散率近似，扩散率AgAgAbAb ；C C：浓度浓度AgAg、AbAb近似，扩散率近似，扩散率AgAgAbAb ；D D：浓度浓度AgAgAbAb，扩散率近似；扩散率近似；E E：浓度浓度AgAgAbAb，扩散率扩散率AgAgAbAb ；F F：浓度浓度AgAgAbAb，扩散率扩散率AgAgAbAb ；1:1:待检待检Ag 2:Ag 2:标准标准AgAg待检待检AgAg与标准抗原完全吻合与标准抗原完全吻合待检待检AgAg中中含有与标准含有与标准AgAg相同的相同的AgAg；还有另还有另外的外的AgAg与与AbAb相相对应对应待检待检AgAg有与有与AbAb相对应的相对应的Ag,Ag,但与标准但与标准AgAg不同不同待检待检AgAg与标准与标准AgAg性质相同；但含量较低性质相同；但含量较低 1.1.周围周围6 6个孔放不同稀释度的相应个孔放不同稀释度的相应AbAb。2.2.以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为 该抗体的效价。该抗体的效价。3.3.可进行任意稀释。可进行任意稀释。“1 1”为单一抗原抗体系统为单一抗原抗体系统。“n n”为多个抗原抗体系统。为多个抗原抗体系统。*可以用混合抗原鉴定抗体纯度。可以用混合抗原鉴定抗体纯度。*可以用混合抗体鉴定抗原纯度可以用混合抗体鉴定抗原纯度。单向免疫扩散单向免疫扩散 将一定量的抗体混入琼脂糖凝胶中，使待测抗原在凝胶中将一定量的抗体混入琼脂糖凝胶中，使待测抗原在凝胶中自由扩散，与相应抗体结合形成沉淀环，沉淀环大小与抗自由扩散，与相应抗体结合形成沉淀环，沉淀环大小与抗原浓度呈正相关。原浓度呈正相关。n是一种定量试验，一般是用已知的抗体测未知的抗原。由于抗体已与凝胶混合，不会再扩散，仅抗原从小孔向四周扩散，因此称为单向琼脂扩散试验。n应用这一实验方法可检测正常人群或患者血清中IgG、IgA 及IgM的水平。1.1.测定沉淀环直径测定沉淀环直径2.2.在标准曲线上查找相应抗原浓度在标准曲线上查找相应抗原浓度绘制标准曲线绘制标准曲线标准品抗原浓度测定标准品抗原浓度测定 不同病人抗原浓度测定不同病人抗原浓度测定 影响因素影响因素 1.抗原分子量：与扩散速度、沉淀环反相关 6.琼脂板厚度：与沉淀环反相关 2.抗体种类：兔抗血清优于马、羊 3.抗体稀释度：抗体浓度大沉淀环小 4.扩散时间：抗原含量高，扩散时间长 5.扩散温度：437内温度与扩散速度正相关实验材料实验材料1人血清人血清.2 2.兔抗人兔抗人 IgG。3琼脂糖凝胶板，琼脂糖凝胶板，1%生理盐水。生理盐水。4其他：加样器、其他：加样器、3mm打孔器、模板、湿盒、恒打孔器、模板、湿盒、恒温箱等。温箱等。实验方法实验方法1琼脂板的制备 将载玻片置于水平台上，吸管吸取加热融化的1%琼脂糖均匀浇在载玻片上，注意勿产生气泡。2.打孔：待琼脂糖凝固后，将琼脂板至于图样上，用3mm打孔器打孔，孔间距为5mm(按模板进行)，孔的排列方式如图所示。3加样：于中央孔加入兔抗人加样：于中央孔加入兔抗人 IgGIgG，周围，周围 1-4 1-4 孔加孔加入倍比稀释不同浓度的人血清，入倍比稀释不同浓度的人血清，5 5孔加入孔加入生理生理盐水作盐水作对照。每孔各加对照。每孔各加15l15l。4将琼脂板平放于湿盒内，置37温箱中，分别于24小时观察结果。实验结果判定实验结果判定n观察孔间沉淀线的数目及特征。本试验1 至4 孔（1:5、1:10、1:20、1:40 的人抗兔IgG）与中央孔(人血清)之间是否可出现清晰的乳白色沉淀线。沉淀线与中央孔的距离随抗原的浓度减小而增大。5孔是生理盐水，为阴性对照，与中间空间无白色沉淀线。n免疫血清的滴度以一定抗原浓度下出现白色沉淀线的最高稀释度来表示。结果分析结果分析 沉淀线与中央孔的距离随抗原的浓度减小而增大。结果分析结果分析n抗原特异性与沉淀线形状的关系：在相邻两完全相同的抗原与抗体反应时，则可出现两单沉淀线的融合。反之，如相邻抗原完全不同时，则出现沉淀线之交叉；两种抗原部分相同时，则出现沉淀线的部分融合。n抗原浓度与沉淀先导形状的关系：两相邻抗原浓度相同，形成对称相融合的沉淀线；如果两抗原浓度不同，则沉淀线不对称，移向低浓度的一边。注意事项注意事项 n 加样时不要将琼脂划破，以免影响沉淀线的形成。n 反应时间要适宜，时间过长，沉淀线可解离而导 致假阴性、不出现或不清楚。n 加样时不同浓度抗体和抗原不要混淆，影响试验结果。n 试验前应做预试验，确定抗体的稀释度。思考题思考题n试述双向琼脂扩散实验的基本原理？试述双向琼脂扩散实验的基本原理？n双向琼脂扩散有哪些实际用途？双向琼脂扩散有哪些实际用途？n试用双向琼脂扩散设计一个抗原性质分析的实验试用双向琼脂扩散设计一个抗原性质分析的实验。
