CR技术及PCR仪.ppt

目 录PCR技术简史 PCR的原理PCR的反应体系和方法PCR的类型和应用PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明n n19711971年年，KhoranaKhorana提提出出：经经过过DNADNA变变性性，与与合合适适引引物物杂杂交交，用用DNADNA聚聚合合酶酶延延伸伸引引物物，并并不不断断重重复复该该过过程程便便可可克隆克隆tRNAtRNA基因。基因。n n但但由由于于测测序序和和引引物物合合成成的的困困难难，以以及及7070年年代代基基因因工工程程技技术术的的发发明明使使克克隆隆基基因因成成为为可可能能，所所以以，KhoranaKhorana的的设想被人们遗忘了设想被人们遗忘了PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明n n19851985年年，美美国国PE-CetusPE-Cetus公公司司的的MullisMullis等等人人发发明明了了聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCR）n n基本原理是在试管中模拟细胞内的基本原理是在试管中模拟细胞内的DNADNA复制复制n n最最初初采采用用E-coli E-coli DNADNA聚聚合合酶酶进进行行PCRPCR，由由于于该该酶酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错n n耐耐热热DNADNA聚聚合合酶酶的的应应用用使使得得PCRPCR能能高高效效率率的的进进行行，随随后后PE-CetusPE-Cetus公公司司推推出出了了第第一一台台PCRPCR自自动动化化热热循循环仪环仪n n19931993年，年，MullisMullis等因此项技术获诺贝尔化学奖等因此项技术获诺贝尔化学奖Kary B.Mullis 1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。故事发生在1983年的春夏之交Kary B.Mullis Kary B.Mullis(1944-)(1944-)，在在在在CetusCetus公司工作期间，公司工作期间，公司工作期间，公司工作期间，发明了发明了发明了发明了PCRPCR。他原本是他原本是他原本是他原本是要合成要合成要合成要合成DNADNA引物来进行引物来进行引物来进行引物来进行测序工作，测序工作，测序工作，测序工作，却常为没有却常为没有却常为没有却常为没有足够多的模板足够多的模板足够多的模板足够多的模板DNADNA而烦而烦而烦而烦恼。恼。恼。恼。19831983年春夏之交的年春夏之交的年春夏之交的年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下一个晚上，他开车去乡下一个晚上，他开车去乡下一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用别墅的路上萌发了用别墅的路上萌发了用别墅的路上萌发了用两个两个两个两个引物引物引物引物（而不是一个引物）（而不是一个引物）（而不是一个引物）（而不是一个引物）去扩增模板去扩增模板去扩增模板去扩增模板DNA DNA 的想法的想法的想法的想法.很少有在公司工作的科研人员得很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖，诺贝尔奖，Mullis是其中之一是其中之一Mullis开车的时候开车的时候,瞬间感觉两排路灯就是瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面的两条链，自己的车和对面开来的车象是开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着聚合酶，面对面地合成着DNA，Mullis的第一个的第一个PCR实验实验n n 1983年年9月中旬。月中旬。Mullis在反应体系中加在反应体系中加 入入DNA聚合酶后在聚合酶后在37 一直保温。结果第二一直保温。结果第二 天在琼脂糖电泳上没有天在琼脂糖电泳上没有 看到任何条带。于是他看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。聚合酶进行反应，依次循环。1983年年12月，他终于看到了被同位素标记月，他终于看到了被同位素标记的的PCR条带。条带。PCR的发展史的发展史n n19831983年春，年春，年春，年春，MullisMullis发展出发展出发展出发展出PCRPCR的概念；的概念；的概念；的概念；n n19831983年年年年9 9月，月，月，月，MullisMullis用大肠杆菌用大肠杆菌用大肠杆菌用大肠杆菌DNADNA聚合酶做了第一个聚合酶做了第一个聚合酶做了第一个聚合酶做了第一个PCRPCR实验，实验，实验，实验，只用一个循环；只用一个循环；只用一个循环；只用一个循环；n n19831983年年年年1212月，用同位素标记法看到了月，用同位素标记法看到了月，用同位素标记法看到了月，用同位素标记法看到了1010个循环后的个循环后的个循环后的个循环后的49 bp49 bp长度的长度的长度的长度的第一个第一个第一个第一个PCRPCR片断；片断；片断；片断；n n19851985年年年年1212月月月月2020日，日，日，日，MullisMullis的同事的同事的同事的同事SaikiSaiki在在在在ScienceScience上发了一篇论上发了一篇论上发了一篇论上发了一篇论文，方法中用了文，方法中用了文，方法中用了文，方法中用了PCRPCR技术，导致技术，导致技术，导致技术，导致MullisMullis的文章到处被拒；的文章到处被拒；的文章到处被拒；的文章到处被拒；n n19851985年年年年1010月月月月2525日申请了日申请了日申请了日申请了PCRPCR的专利，的专利，的专利，的专利，19871987年年年年7 7月月月月2828日批准（专日批准（专日批准（专日批准（专利号利号利号利号4,683,2024,683,202 ），这回），这回），这回），这回MullisMullis是第一发明人。是第一发明人。是第一发明人。是第一发明人。n n19861986年年年年5 5月，月，月，月，MullisMullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习始学习始学习始学习PCRPCR的方法；的方法；的方法；的方法；n n19861986年年年年6 6月，月，月，月，CetusCetus公司纯化了第一种高温菌公司纯化了第一种高温菌公司纯化了第一种高温菌公司纯化了第一种高温菌DNADNA聚合酶，聚合酶，聚合酶，聚合酶，Taq Taq DNA polymeraseDNA polymerase，这是，这是，这是，这是8585年春天年春天年春天年春天MullisMullis建议做的；建议做的；建议做的；建议做的；n n19881988年，第一台年，第一台年，第一台年，第一台PCRPCR仪问世；仪问世；仪问世；仪问世；n n19911991年，年，年，年，Hoffman LaRocheHoffman LaRoche以以以以3 3亿美元的代价从亿美元的代价从亿美元的代价从亿美元的代价从CetusCetus公司获得公司获得公司获得公司获得全权开发权。全权开发权。全权开发权。全权开发权。PCR不只是一个方法改进不只是一个方法改进n nMullis的上司有句的上司有句“名言名言”，“我们要我们要扩增这么多扩增这么多DNA样品有什么用样品有什么用”；n n到了到了1991，Cetus公司以公司以3亿美元的转亿美元的转让费将让费将PCR相关专利转让给瑞士相关专利转让给瑞士Hoffman LaRoche公司，并在此后的公司，并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红；经营中又获得了数亿美元的分红；n nMullis于于1993年获得诺贝尔化学奖，年获得诺贝尔化学奖，PCR和和DNA重组技术一样意义深远。重组技术一样意义深远。生物样品生物样品生物样品生物样品DNADNA片段片段基基基基因因因因诊诊诊诊断断断断基基基基因因因因治治治治疗疗疗疗基基基基因因因因工工工工程程程程产产产产品品品品法法法法医医医医学学学学检检检检测测测测人人人人类类类类学学学学研研研研究究究究基因组基因组基因组基因组DNADNADNADNA获取特定获取特定获取特定获取特定DNADNADNADNA片段片段片段片段扩扩扩扩增增增增特特特特定定定定D D D DN N N NA A A A片片片片段段段段DNADNA聚合酶聚合酶引物引物引物引物引物引物引物引物M13M13噬菌体噬菌体Sanger的测序技术引物引物DNADNA聚合酶聚合酶引物引物引物引物Mullis的构思DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶特定特定特定特定DNADNADNADNA片段片段片段片段94949494变性变性变性变性50-6550-65退火退火退火退火XX延伸延伸延伸延伸9494949455553737Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)酶酶酶酶活活活活性性性性(%)温度温度温度温度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 207272949494945555PCRPCR循环循环循环循环PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的标准的标准的标准的PCRPCRPCRPCR反应体系反应体系反应体系反应体系4 4种种dNTPdNTP混合物混合物 各各200umol/L200umol/L引物引物 各各1010100pmol100pmol模板模板DNA DNA 0 0.1 12ug2ugTaq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 2 2.5u5uMgMg2+2+1 1.5mmol/L5mmol/L1234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR的基本原理n nPCRPCR反应条件反应条件n nPCRPCR过程过程n nPCRPCR的特点的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95PCR的基本原理n nPCRPCR反应条件反应条件n nPCRPCR过程过程n nPCRPCR的特点的特点50引物1引物2DNA引物PCR的基本原理n nPCRPCR反应条件反应条件n nPCRPCR过程过程n nPCRPCR的特点的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理n nPCRPCR反应条件反应条件n nPCRPCR过程过程n nPCRPCR的特点的特点第1轮结束95第2轮开始PCR的基本原理n nPCRPCR反应条件反应条件n nPCRPCR过程过程n nPCRPCR的特点的特点955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理n nPCRPCR反应条件反应条件n nPCRPCR过程过程n nPCRPCR的特点的特点72第2轮结束PCR的基本原理n nPCRPCR反应条件反应条件n nPCRPCR过程过程n nPCRPCR的特点的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增PCR PCR 动画动画1 1stst cycle cycle2 2ndnd cycle cycle3 3rdrd cycle cycle过过 程程变变变变 性性性性引引引引 物物物物 退退退退 火火火火DNA DNA 复制复制复制复制PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点n n灵敏度高灵敏度高1.1.皮克皮克(pg=10(pg=10-12-12)量级扩增到微克量级扩增到微克(ugug=10=10-6-6)水平水平2.2.能从能从100100万个细胞中检出一个靶细胞万个细胞中检出一个靶细胞3.3.病毒检测的灵敏度可达病毒检测的灵敏度可达3 3个个RFURFU4.4.细菌检测的最小检出率为细菌检测的最小检出率为3 3个细菌个细菌n n简便、快速简便、快速1.1.一次性加好反应液，一次性加好反应液，2 24 4 小时完成扩增小时完成扩增2.2.扩增产物一般用电泳分析扩增产物一般用电泳分析n n对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低uu血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提织等组织的粗提DNADNAPCR具有极高的灵敏度具有极高的灵敏度样品样品正对照正对照 负对照负对照标准分子量标准分子量 污染是污染是污染是污染是PCRPCRPCRPCR实验的常见问题。只要实验室里曾经扩增过某个实验的常见问题。只要实验室里曾经扩增过某个实验的常见问题。只要实验室里曾经扩增过某个实验的常见问题。只要实验室里曾经扩增过某个片段，就有可能以后的实验中发生污染。片段，就有可能以后的实验中发生污染。片段，就有可能以后的实验中发生污染。片段，就有可能以后的实验中发生污染。因此，做实因此，做实因此，做实因此，做实验的时候绝验的时候绝验的时候绝验的时候绝对不要忘了对不要忘了对不要忘了对不要忘了负对照。负对照。负对照。负对照。用紫外灯破用紫外灯破用紫外灯破用紫外灯破坏污染物也坏污染物也坏污染物也坏污染物也是一个办法是一个办法是一个办法是一个办法PCRPCR琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳最终产物最终产物最终产物最终产物紫外光观察紫外光观察紫外光观察紫外光观察3-4 3-4 3-4 3-4 小时小时小时小时引物设计：（1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40 bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3端为关键碱基；5端无严格限制。335535 5限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列启动子序列启动子序列启动子序列启动子序列定点突变定点突变定点突变定点突变探针标记探针标记探针标记探针标记1）PCR反应成分（1）模板 单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ng DNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。PCR反应条件（2）引物浓度 0.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。耐高温耐高温DNA聚合酶的种类聚合酶的种类n nTaq DNA聚合酶聚合酶 (Thermus aquaticus(Thermus aquaticus，Cetus/Roche)Cetus/Roche)n nTth DNA聚合酶聚合酶 (Thermus thermophilus(Thermus thermophilus，Toyobo)Toyobo)n nPfu DNA聚合酶聚合酶 （Pyrococcus furiosusPyrococcus furiosus，StratageneStratagene）DeepDeep VentVent DNA DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶(Bio-labs(Bio-labs）n nTfl DNA聚合酶聚合酶 （Thermus flavusThermus flavus，Promega)Promega)n nTli DNA聚合酶聚合酶 (Thermococcus litoralis(Thermococcus litoralis，Promega)Promega)VentVent DNA DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶(Bio-labs(Bio-labs）n nPwo DNA聚合酶聚合酶 (Pyrococcus woesei(Pyrococcus woesei，Roche)Roche)n nPfx DNA聚合酶聚合酶 (Thermococcus kodakaraensis,Invitrogen)(Thermococcus kodakaraensis,Invitrogen)n nDynazyme DNA聚合酶聚合酶（Thermus brockianusThermus brockianus，FinnazymeFinnazyme）n nFD DNA聚合酶聚合酶 (Thermus sterophilus(Thermus sterophilus？，复旦大学？，复旦大学？，复旦大学？，复旦大学)n nTma,Tne,KOD,Tma,Tne,KOD,PCR反应中Taq酶的选择n n高特异性：热启动高特异性：热启动TaqTaq酶酶-高温激活高温激活 修饰（抗体抑制剂、蜡封等）如修饰（抗体抑制剂、蜡封等）如ClongtechstratagenClongtechstratagen等公司或重组酶，如等公司或重组酶，如QIAGENQIAGEN公司的公司的HotStarHotStar系列系列n n高保真高保真TaqTaq酶（因其具有酶（因其具有3”3”到到5“5“核酸外切核酸外切酶活性，错配率酶活性，错配率1010-6-6，）普通）普通TaqTaq酶酶25102510-5-5碱基碱基/循环，如循环，如StratageneStratagene的的PfuPfu，NEBNEB公司公司的的Vent DNAVent DNA聚合酶，聚合酶，QIAGEN QIAGEN公司的公司的ProofStar DNAProofStar DNA聚合酶，兼特异性与保真性聚合酶，兼特异性与保真性于一体于一体n n高耐热性高耐热性TaqTaq酶酶 NEB NEB公司的公司的Vent Vent 和和Deep Deep Vent DNAVent DNA聚合酶系列，从海底火山口分离后聚合酶系列，从海底火山口分离后克隆的，是普通克隆的，是普通TaqTaq酶耐热性的三倍以上，酶耐热性的三倍以上，前者在前者在95 95 半衰期近半衰期近7h7h，100 100 近近2h2h；后；后者更甚分别为者更甚分别为23h23h和和8h8h n n超长片段扩增超长片段扩增TaqTaq酶；基因组图谱、测序及酶；基因组图谱、测序及分子遗传学研究。分子遗传学研究。ClontechClontech公司的公司的Advantage GenomicAdvantage Genomic系列混有系列混有TthDNATthDNA聚合酶，聚合酶，ProofreadingProofreading酶和热启动抗体，对复杂模板酶和热启动抗体，对复杂模板可扩增可扩增10kb10kb片段，简单模板可达片段，简单模板可达40kb40kb。n n关于复杂模板的扩增关于复杂模板的扩增 对于模板结构复杂，对于模板结构复杂，如如GCGC含量高（含量高（60%60%），有二级结构等，普通），有二级结构等，普通的的TaqTaq酶可能难以延伸下去，加入酶可能难以延伸下去，加入DMSODMSO等助等助溶剂可帮助扩增顺利进行，但溶剂可帮助扩增顺利进行，但DMSODMSO有毒，而有毒，而且用量需要优化。且用量需要优化。QIAGENQIAGEN公司的任何一种公司的任何一种TaqTaq酶都附有特制的酶都附有特制的Q-Q-溶液，操作方便、安溶液，操作方便、安全，对复杂模板的扩增特别有效。全，对复杂模板的扩增特别有效。（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。2）循环参数(1)(1)(2)n n变性变性使双链使双链DNADNA解链为单链解链为单链959520-3020-30秒秒n n变性温度低，解链不完全是导致变性温度低，解链不完全是导致PCRPCR失败的最主要原因。一般情况失败的最主要原因。一般情况下，下，939394941min1min足以使模板足以使模板DNADNA变性，若低于变性，若低于9393则需延长时则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或使靶基因模板或PCRPCR产物完全变性，产物完全变性，就会导致就会导致PCRPCR失败。失败。n n(2)(2)退火退火(复性复性)温度与时间：温度与时间：n n温度由引物长度和温度由引物长度和GCGC含量决定。含量决定。n n增加温度能减少引物与模板的非特异性结合增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温降低温度可增加反应的灵敏性。度可增加反应的灵敏性。n n退火温度是影响退火温度是影响PCRPCR特异性的较重要因素。变性后温特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至度快速冷却至40406060，可使引物和模板发生结合。，可使引物和模板发生结合。由于模板由于模板DNADNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于还有靶基序列的长度。对于2020个核苷酸，个核苷酸，G+CG+C含量约含量约50%50%的引物，的引物，5555为选择最适退火温度的起点较为理为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：温度：TmTm值值(解链温度解链温度)=4(G+C)=4(G+C)2(A+T)2(A+T)复性温度复性温度=Tm=Tm值值-(5-(51010)在在TmTm值允许范围内，值允许范围内，选择较高的复性温度可大大选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，减少引物和模板间的非特异性结合，提高提高PCRPCR反应的反应的特异性。复性时间一般为特异性。复性时间一般为303060sec60sec，足以使引物与，足以使引物与模板之间完全结合。模板之间完全结合。（3）延伸）延伸温度与时间：温度与时间：TaqDNATaqDNA聚合酶的生物学活性：聚合酶的生物学活性：70708080150150核苷酸核苷酸/S/S/酶分子酶分子70706060核苷酸核苷酸/S/S/酶分子酶分子55552424核苷酸核苷酸/S/S/酶分子酶分子高于高于9090时，时，DNADNA合成几乎不能进行。合成几乎不能进行。PCRPCR反应的延伸温度一般选择在反应的延伸温度一般选择在70707575之间，之间，常用温度为常用温度为7272，过高的延伸温度不利于引物和模板，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。的结合。PCRPCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般长度而定，一般1Kb1Kb以内的以内的DNADNA片段，延伸时间片段，延伸时间1min1min是足够是足够 的。的。3 34kb4kb的靶序列需的靶序列需3 34min4min；扩增；扩增10Kb10Kb需需延伸至延伸至15min15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加PCR产物生成曲线产物生成曲线logDNACycleslogDNACycles不同样品有不同的生成曲线不同样品有不同的生成曲线PCR的类型和应用研究基因克隆，DNA测序，分析突变诊断细菌、病毒、寄生虫检测，诊断人类基因组工程遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱法医犯罪现场标本分析肿瘤各种肿瘤检测其他PCR相关的术语和产品层出不穷相关的术语和产品层出不穷n nT-vectorT-vectorn nHotStartTaqHotStartTaqn nRT-PCRRT-PCRn nRAPD-PCRRAPD-PCRn nDDRT-PCRDDRT-PCRn nLM-PCRLM-PCRn nInversePCRInversePCRn nNestedPCRNestedPCRn nReal-timePCRReal-timePCRn nRACERACEn nFlowchipPCRFlowchipPCRn nTASTASn nMultiplexPCRMultiplexPCRn nImmunoPCRImmunoPCRn nAsymmetricPCRAsymmetricPCRn nLP-PCRLP-PCRn nNASBANASBAn nRecombinantPCRRecombinantPCRn nAFLPAFLPn nSSCPSSCPn nIn situIn situPCRPCRn nTaqMan/SYBRgreenTaqMan/SYBRgreen1）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究 高浓度引物低浓度引物2)反向PCR(reverse PCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶连接酶连接酶3）多重PCR用于检测特定基因序列的存在或缺失。电电电电泳泳泳泳引物引物4）LP-PCR（Labelled primers)利用同位素、荧光素等对引物进行标记，用以直观地检测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分病毒病毒1 1 病毒病毒2 2 病毒病毒 3 3 病毒病毒4 4标记引物标记引物标记引物标记引物观察观察PCRPCR产物产物5）锚式PCR已知靶基因片段两测的序列 cDNAcDNA末端核酸转移酶末端核酸转移酶3GGGG3GGGG5 5 CCCC CCCC 锚定引物锚定引物3GGGG3GGGG5 5 CCCCCCCC3GGGG3GGGGCCCCCCCC6）原位 原位聚合酶链式反应（In Still PCR，IsPCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位。适用于检测病理切片中含量较少的靶序列 原位PCR的作用 既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH），但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下，该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列，敏感度很高，但却未能与细胞形态学研究相结合。ISPCR则可把这两者结合起来，成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。操作步骤 细胞或组织的固定 PCR扩增细胞内目的片段 原位杂交检测扩增产物人类染色体端粒人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片的荧光原位杂交照片 7 7）逆转录酶聚合酶mRNAmRNAcDNAcDNA杂化双链杂化双链PCR扩增基因mRNAmRNA蛋白质多肽链蛋白质多肽链8 8）实时定量）实时定量PCRPCR技术原理技术原理普通普通PCR和定量和定量PCR的区别的区别n适用定性分析，适用定性分析，不适合定量分不适合定量分析；析；nPCR 产物的产物的长度从长度从100bp 数数kbn n实时检测实时检测:每个循每个循环都产出荧光信环都产出荧光信号号n n绝对定量，灵敏绝对定量，灵敏度更高度更高 n nPCR产物的长度产物的长度一般在一般在 60-150 bpslogDNACycles不同样品有不同的生成曲线不同样品有不同的生成曲线TaqMan系统的一个例子系统的一个例子10ng0.001ngTitrate a template;10,1,0.1,0.01,0.001 ngPCR的应用领域生物学领域几乎无处不用生物学领域几乎无处不用n n基因、基因、DNA片段的克隆片段的克隆n n人工基因构建人工基因构建n nDNA序列测定序列测定n n基因定点突变基因定点突变n n基因型（突变）检测，基因型（突变）检测，n nSNP分析，遗传背景分析分析，遗传背景分析n n生物物种鉴定，系统进化研究生物物种鉴定，系统进化研究n n基因表达量研究基因表达量研究（real-time PCRreal-time PCR）/基因表达谱研究基因表达谱研究（DNA chip,SAGE DNA chip,SAGE）医学领域医学领域n n疾病基因检测疾病基因检测/遗传病的产前诊断遗传病的产前诊断n n致病病原体的检测致病病原体的检测 n n肿瘤治疗中癌基因的检测肿瘤治疗中癌基因的检测 会推广到大部分疾病治疗前的检测会推广到大部分疾病治疗前的检测 n nDNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别、指纹、个体识别、亲子关系鉴别、法医物证法医物证 n n其他其他:动、植物检疫动、植物检疫（转基因动植物检测）（转基因动植物检测）（转基因动植物检测）（转基因动植物检测）PCRPCR技术的应用技术的应用1)1)基因克隆基因克隆重组重组DNADNA质粒质粒DNADNA基因片段基因片段2)基因检测A内源性病变基因内源性病变基因正常人A病 人病原微生物基因正常人 (-)病 人 (+)遗传病的诊断遗传病的诊断 基因缺失、插入或置换等基因缺失、插入或置换等地中海贫血地中海贫血珠蛋白链合成不平衡珠蛋白链合成不平衡A正常人正常人正常人正常人病病病病 人人人人正正正正常常常常病病病病人人人人探针杂交NC膜探针正常人突变纯合突变纯合子子突变杂合子突变杂合子PCR-RFLP法：限制性内切酶限制性内切酶恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）Ras基因突变限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶正常正常正常正常突变突变突变突变电电泳泳 HLA系统基因分型 PCR-RFLP法PCR-SSO法PCR-SSCPPCR-PCR-SSPSSP3)基因配型4）基因鉴定女女性性男男性性Y Y引物引物PCR男性男性 女性女性法医学分析 个体识别、亲缘鉴定方法：PCR-RFLP DNA遗传指纹 PCR-ASO PCR-VNTR多态性 PCR-SSCP 线粒体DNA测序PCR-VNTR多态性检测PCRPCR；电泳检测；电泳检测父父父父 父父父父 子子子子 母母母母 现 嫌1 嫌2 嫌3(一一)PCR基因扩增仪的类型基因扩增仪的类型n nPCR仪，也称DNA热循环仪、基因扩增仪n nPCR基因扩增仪的设计均按照DNA变性、复性和延伸三个环节以及温度均恒、传导快和升降温迅速等原则，结合传感技术、微电子技术和电子计算机等技术发展而成的自动化和智能化的仪器设备n n19711971年年KleppeKleppe等人在等人在JournalofmolecularbiologyJournalofmolecularbiology上发表上发表文章首次准确、精炼、客观的阐述了文章首次准确、精炼、客观的阐述了PCRPCR方法，方法，n n19761976年一种从嗜热水生菌年一种从嗜热水生菌(Thermusaquaticus)(Thermusaquaticus)分离得到的分离得到的热稳定的热稳定的DNADNA依赖的依赖的DNADNA聚合酶的应用大大增加了聚合酶的应用大大增加了PCRPCR的的效率。效率。n n而现今所发展出来的而现今所发展出来的PCRPCR则是源于由则是源于由SaikiSaiki和和MullisMullis等人于等人于19881988年发表在年发表在ScienceScience上的一篇论文，上的一篇论文，MullisMullis当时服务于当时服务于PerkinElmerPerkinElmer（PEPE）公司，因此）公司，因此PEPE公司在公司在PCRPCR界有着特殊界有着特殊的地位。的地位。n n后来后来PEPE被被AppliedBiosystemsInc.AppliedBiosystemsInc.（ABIABI）公司收购、分拆、）公司收购、分拆、再转卖，而再转卖，而PCRPCR的专利和倍受信赖的的专利和倍受信赖的PCRPCR仪器生产和销售仪器生产和销售就留在就留在ABIABI名下。名下。n n到如今，到如今，PCRPCR方法愈发趋向自动化，并从中衍生出更多的方法愈发趋向自动化，并从中衍生出更多的新技术方法，可以说，新技术方法，可以说，PCRPCR技术是支撑现代分子生物学发技术是支撑现代分子生物学发展的一块重要基石。这种技术的广泛应用催生了一个庞大展的一块重要基石。这种技术的广泛应用催生了一个庞大的市场，多个公司均有各种类型的商品化的市场，多个公司均有各种类型的商品化PCRPCR仪出售。仪出售。n nPCRPCR的专利目前依然掌握在的专利目前依然掌握在ABIABI和和RocheRoche（罗氏）两大公司（罗氏）两大公司手中，去年业界颇为引人瞩目手中，去年业界颇为引人瞩目ABIABI诉诉MJMJ公司侵犯侵犯公司侵犯侵犯PCRPCR仪知识产权案最终以仪知识产权案最终以MJMJ败诉并宣布破产、最终被败诉并宣布破产、最终被Bio-radBio-rad收收购暂告一段落。其后还会不会有后继的故事还需拭目以待。购暂告一段落。其后还会不会有后继的故事还需拭目以待。PCR仪器的变迁仪器的变迁n n三个水浴锅，三个水浴锅，三个水浴锅，三个水浴锅，用手移动用手移动用手移动用手移动 （MullisMullis等人当时用的）等人当时用的）等人当时用的）等人当时用的）n n电加热块电加热块电加热块电加热块 自来水冷却自来水冷却自来水冷却自来水冷却 （PEPE，19881988）n n电加热块电加热块电加热块电加热块 内置循环液冷却内置循环液冷却内置循环液冷却内置循环液冷却 （PEPE，19891989）n n三个加热块三个加热块三个加热块三个加热块 机械手机械手机械手机械手 （StratageneStratagene，19941994）n n半导体制冷和加热半导体制冷和加热半导体制冷和加热半导体制冷和加热