丙二醛(MDA)的测定方法.ppt

丙二丙二醛（MDA）含量的）含量的测定定 丙二醛是膜脂过氧化最重要的产物丙二醛是膜脂过氧化最重要的产物之一。植物在逆境下遭受伤害与活性氧之一。植物在逆境下遭受伤害与活性氧积累诱发的膜质过氧化作用密切相关。积累诱发的膜质过氧化作用密切相关。植物生理学实验课件植物生理学实验课件u植物在逆境下遭受植物在逆境下遭受伤害（或衰老）与活性氧害（或衰老）与活性氧积累累诱发的膜脂的膜脂过氧氧化作用密切相关，膜脂化作用密切相关，膜脂过氧化的氧化的产物有二物有二烯轭合物、脂合物、脂类过氧化氧化物、丙二物、丙二醛、乙、乙烷等。其中丙二等。其中丙二醛（MDA：Malondialdehyde）是膜脂）是膜脂过氧化最重要的氧化最重要的产物之一，因此可物之一，因此可通通过测定定MDA了解膜脂了解膜脂过氧化的程度，以氧化的程度，以间接接测定膜系定膜系统受受损程程度以及植物的抗逆性。度以及植物的抗逆性。原理原理丙二丙二醛在高温及酸性在高温及酸性环境下可与境下可与2-硫代巴比妥酸硫代巴比妥酸（TBA）反）反应产生生红棕色的棕色的产物物3,5,5-三甲基三甲基恶唑2,4-二二酮（三甲川），（三甲川），该物物质在在532 nm处有一有一吸收高峰，并且在吸收高峰，并且在660nm处有有较小光吸收。根据小光吸收。根据其其532 nm的消光的消光值可可计算出溶液中丙二算出溶液中丙二醛的含量。的含量。醛、可溶性糖、可溶性糖对此反此反应有干有干扰，在，在450 nm处有一有一吸收峰，可用双吸收峰，可用双组分分光光度法加以排除。分分光光度法加以排除。原理原理硫代巴比妥酸丙二醛3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮 （三甲川）仪器器设备1.分光光度分光光度计；2.研研钵；3.剪刀；剪刀；4.恒温水浴；恒温水浴；5.试管：管：20 mL4 6.离心机。离心机。试剂1.5%三三氯醋酸；醋酸；2.0.5%硫代巴比妥酸（用硫代巴比妥酸（用5%三三氯醋酸溶解定容）；醋酸溶解定容）；3.0.05 mol L1磷酸磷酸缓冲液，冲液，pH 7.8。材料材料u正常生正常生长的以及的以及经逆境逆境处理的小麦、玉米或其他植物的叶片。理的小麦、玉米或其他植物的叶片。方法与步方法与步骤1取小麦植株上不同叶位的叶片取小麦植株上不同叶位的叶片35片，洗片，洗净擦干，剪擦干，剪成成0.5 cm长的小段，混匀。的小段，混匀。2称取叶片切段称取叶片切段0.3 g，放入冰浴的研，放入冰浴的研钵中，加入少中，加入少许石英砂和石英砂和2 mL 0.05 mol L-1磷酸磷酸缓冲液，研磨成冲液，研磨成匀匀浆。将匀。将匀浆转移到移到试管中，再用管中，再用3 mL 0.05 mol L-1磷酸磷酸缓冲液，分三次冲洗研冲液，分三次冲洗研钵，合并提取液。，合并提取液。3在提取液中加入在提取液中加入5 mL 0.5%硫代巴比妥酸溶液，硫代巴比妥酸溶液，摇匀。匀。4将将试管放入沸水浴中煮沸管放入沸水浴中煮沸10 min，（自，（自试管内溶液管内溶液中出中出现小气泡开始小气泡开始计时）。到）。到时间后，立即将后，立即将试管取出管取出并放入冷水浴中。并放入冷水浴中。5待待试管内溶液冷却后，管内溶液冷却后，3000g离心离心15 min，取上，取上清液并量其体清液并量其体积。以。以0.5%硫代巴比妥酸溶液硫代巴比妥酸溶液为空白空白测532 nm、600 nm和和450 nm处的消光的消光值。计算算结果果u式中，式中，Vt：提取液：提取液总体体积（mL）；）；u Vs：测定用提取液体定用提取液体积（ml）；）；u FW：样品品鲜重（重（g）。）。注意事注意事项 u1可溶性糖与可溶性糖与TBA显色反色反应的的产物在物在532 nm也有吸收（最大吸收在也有吸收（最大吸收在450 nm），当植），当植物物处于干旱、高温、低温等逆境于干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含可溶性糖含量会增高，必要量会增高，必要时要排除可溶性糖的干要排除可溶性糖的干扰。u2低低浓度的度的铁离子能增离子能增强MDA与与TBA的的显色色反反应，当植物，当植物组织中中铁离子离子浓度度过低低时应补充充Fe3+（最（最终浓度度为0.5 nmol L-1）u3如待如待测液液浑浊，可适当增加离心力及，可适当增加离心力及时间，最好使用低温离心机离心。最好使用低温离心机离心。思考思考题 u不同植物在同一逆境下，丙二不同植物在同一逆境下，丙二醛含量含量变化不同，化不同，说明了什么？明了什么？