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蛋白质定量分析蛋白质定量分析本讲稿第一页，共二十一页定性分析定性分析定量分析定量分析有没有有没有是不是是不是有多少有多少本讲稿第二页，共二十一页内容内容BCA法测定蛋白质含量法测定蛋白质含量蛋白质定量分析的方法蛋白质定量分析的方法操作注意事项操作注意事项思考讨论思考讨论本讲稿第三页，共二十一页 BCA法测定蛋白质含量法测定蛋白质含量 2.掌握分光光度计的使用。实验目的1.掌握BCA法测定血清蛋白质 浓度的原理。本讲稿第四页，共二十一页BCA分子式BCA试剂盒实验原理 BCA(bicinchoninic acid,二辛可酸）本讲稿第五页，共二十一页实验原理紫蓝色562nm本讲稿第六页，共二十一页实验步骤（一）实验材料（一）实验材料 1、器材 721型分光光度计、恒温水浴箱、移液管、试管 2、试剂 （1）试剂A:含1%BCA二钠盐、2%无水碳酸钠、0.16%酒 石酸钠、0.4%氢氧化钠、0.95%碳酸氢钠，将上述液体 混合后调pH至11.25。（2）试剂B：4%硫酸铜。（3）BCA工作液：试剂A100mL+试剂B2mL，混合。（4）蛋白质标准液：准确称取150mg牛血清白蛋白，溶于 100mL蒸馏水中，即为1.5mg/mL的蛋白质标准液。（5）待测样品。本讲稿第七页，共二十一页 表表1 BCA1 BCA法测定蛋白质含量法测定蛋白质含量 管号管号试剂（试剂（mLmL）空白管空白管 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 测定管测定管 标准蛋白溶液标准蛋白溶液（0.3mg/ml0.3mg/ml）0.10.1 0.20.2 0.30.3 0.40.4 0.50.5 蒸馏水蒸馏水 0.50.5 0.40.4 0.30.3 0.20.2 0.10.1 待测样品待测样品 0.50.5 BCABCA工作液工作液 2.02.0 2.02.0 2.02.0 2.02.0 2.02.0 2.02.0 2.02.0 蛋白质含量蛋白质含量g g 3030 6060 9090 120120 150150 数据有改动ug本讲稿第八页，共二十一页1、将上述各管混匀后于37C保温30分钟，用562nm波长比色测定吸光度值。2、以蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵 坐标绘制标准曲线。3、用测定管光吸收值在标准曲线上查找相 应的蛋白质含量M，再计算出待测血清中 蛋白质浓度（g/L)。（二）实验操作C=MV250本讲稿第九页，共二十一页蛋白质定量分析的方法u 紫外线吸收法u 改良微量凯式定氮法u 双缩脲法u Folin-酚试剂法u 考马斯亮蓝结合法u BCA法280nm16%本讲稿第十页，共二十一页方法灵敏度时间原理干扰物紫外线吸收法较低快速酪氨酸和色氨酸在280nm的光吸收 核苷酸改良凯氏定氮低费时将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮双缩脲法低中速肽键和碱性Cu2形成紫色络合物硫酸铵；Tris缓冲液 某些氨基酸Lowry法高费时双缩脲反应；酚试剂被还原甘氨酸硫醇考马斯亮蓝法高快速G-250与蛋白质结合物在595nm的光吸值强碱性缓冲液 TritonX-100;SDSBCA法最高较快肽键和碱性Cu2形成紫色络合物不受去污剂、尿素等的影响本讲稿第十一页，共二十一页 BCA法的特点 1、操作简便，快速 2、准确灵敏，试剂稳定性好 3、抗试剂干扰能力较强 4、经济实用本讲稿第十二页，共二十一页注意事项1、实验分组 2、准确量取试剂，吸管残余液体要吹出。3、平行加样，物归原位。4、正确使用分光光度计，比色杯不润洗。5、正确绘制标准曲线，标注名称、姓名、仪器型号、作图时间。6、实验结果书写规范，三线表。本讲稿第十三页，共二十一页可见光分光光度计的操作步骤：1）预热仪器。2）选定波长。3）固定灵敏度档。一般固定在“1”档。4）调节“0”点。5）调节T=100。6）测定。7）关机。（重复2-3次）本讲稿第十四页，共二十一页表表1 BCA1 BCA法测定蛋白质含量法测定蛋白质含量管号空白管12345测定管M（ug）306090120150？吸光值仪器型号：721/722型 波长=562nm本讲稿第十五页，共二十一页思考讨论1、蛋白质定量分析的多种方法中，哪种方法更适合测定血清蛋白的浓度，说出你的理由？2、实验设计及实验操作过程中，有没有可改进的方法，如果有请说出你的想法？本讲稿第十六页，共二十一页 下次实验：血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 预习要点：1、复习蛋白质两性解离。2、预习电泳的基本原理。3、请简要写出操作流程图。4、请写出计算公式。本讲稿第十七页，共二十一页本讲稿第十八页，共二十一页 一、蛋白质的相关理论知识16%蛋白质的平均含氮量 样品中蛋白质的含量样品中蛋白质的含量=样品中氮含量样品中氮含量 16%（或（或6.25）凯氏定氮法凯氏定氮法1、元素组成本讲稿第十九页，共二十一页 2、蛋白质的紫外吸收280nm蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸的特征性吸收峰紫外线吸收法紫外线吸收法共轭双键共轭双键本讲稿第二十页，共二十一页 3、蛋白质的呈色反应 双缩脲法双缩脲法Lowry法法考马斯亮蓝结合法考马斯亮蓝结合法肽键肽键茚三酮反应茚三酮反应 Folin-酚试剂反应酚试剂反应考马斯亮蓝结合反应考马斯亮蓝结合反应 双缩脲反应双缩脲反应 肽键肽键+CuSO4紫、红色紫、红色OH-本讲稿第二十一页，共二十一页