胚胎干细胞的分离培养技术精选文档.ppt

胚胎干细胞的分离培养技术本讲稿第一页，共十五页第六节第六节 胚胎干细胞技术胚胎干细胞技术 Embryonic Stem cells(ES cells)一、概述一、概述哺乳动物胚胎干细胞（哺乳动物胚胎干细胞（embryonic stem cells,ES细胞）细胞）一般是指从早期胚胎经一般是指从早期胚胎经体外分化抑体外分化抑制制培养分离出来的具有全能性的细胞。培养分离出来的具有全能性的细胞。ES细胞是由细胞是由Evans和和Kauf-man1981年首次从年首次从延迟小鼠囊胚中分离出来的多能性细胞，当延迟小鼠囊胚中分离出来的多能性细胞，当时称之为时称之为EK细胞。以后称之为胚胎干细胞。细胞。以后称之为胚胎干细胞。本讲稿第二页，共十五页人胚胎干细胞分离技术途径人胚胎干细胞分离技术途径ICMPGCs本讲稿第三页，共十五页ES细胞的特点：细胞的特点：ES细胞具有胚胎细胞的特性细胞具有胚胎细胞的特性，在，在形态上形态上表现为表现为体积小、核大，核仁突出，培养时呈克隆状生体积小、核大，核仁突出，培养时呈克隆状生长；在长；在功能上功能上，ES细胞具有发育的全能性，即细胞具有发育的全能性，即具有分化为成年动物体内任何一种细胞类型的具有分化为成年动物体内任何一种细胞类型的能力。能力。ES细胞具有细胞系的特征细胞具有细胞系的特征，在饲养层上能维持，在饲养层上能维持未分化状态并实现自我更新。因为可无限增殖，未分化状态并实现自我更新。因为可无限增殖，也可冷冻保存。也可冷冻保存。本讲稿第四页，共十五页二、二、胚胎干细胞研究的意义胚胎干细胞研究的意义胚胎干细胞研究的意义胚胎干细胞研究的意义ES细胞在哺乳动物个体发生发育规律的研究细胞在哺乳动物个体发生发育规律的研究中极有价值的工具；中极有价值的工具；ES细胞是研究细胞是研究细胞分化细胞分化的理想手段；图的理想手段；图ES细胞是研究基因功能的首选细胞；细胞是研究基因功能的首选细胞；Es细胞作为生产转基因动物的主要途径之一；细胞作为生产转基因动物的主要途径之一；ES细胞治疗技术将引起一场医学革命；细胞治疗技术将引起一场医学革命；ES细胞可用于研究细胞癌变机理和新药物的细胞可用于研究细胞癌变机理和新药物的筛选。筛选。本讲稿第五页，共十五页二、胚胎干细胞研究的历史二、胚胎干细胞研究的历史1、1981年 Evans 和 Kaufman 获得小鼠ES细胞系2、1988年 Doetschman获得仓鼠ES细胞系3、1994年 Wheeler 和Robert获得猪ES细胞系4、1998年 Thomson获得人的ES细胞系5、2007年 日本的Yamanaka研究小组和美国的James Thomson 研究小组分别获得诱导多能性干 细胞（induced pluripotent stem cell，iPS 细胞）本讲稿第六页，共十五页四、胚胎干细胞分离培养的基本程序四、胚胎干细胞分离培养的基本程序(一一)选择抑制细胞分化的培养体系选择抑制细胞分化的培养体系1、饲养层培养体系、饲养层培养体系2、条件培养体系、条件培养体系3、培养液中添加分化抑制因子体系、培养液中添加分化抑制因子体系本讲稿第七页，共十五页四、胚胎干细胞分离培养的基本程序四、胚胎干细胞分离培养的基本程序（二）早期胚胎的选择（二）早期胚胎的选择（三）胚胎干细胞的分离（三）胚胎干细胞的分离（四）胚胎干细胞的保持（四）胚胎干细胞的保持（五）胚胎干细胞的鉴定（五）胚胎干细胞的鉴定（六）胚胎干细胞的分化潜力验证（六）胚胎干细胞的分化潜力验证本讲稿第八页，共十五页五、五、胚胎干胚胎干细胞技术目前存在的问题和发展远景细胞技术目前存在的问题和发展远景1、根据细胞的分化特点建立更有效的培养体系2、加强胚胎干细胞体外诱导分化研究3、提高家畜胚胎干细胞的分离水平4、加速胚胎干细胞在医学上的应用本讲稿第九页，共十五页第七节第七节 嵌合体嵌合体 ChimeraChimera嵌嵌合合体体动动物物：指指由由2个个以以上上不不同同的的受受精精卵卵或或3个个以以上上的的配配子子相相结结合合，有有不不同同基基因因型型的的细细胞胞群群所构成的复合体。所构成的复合体。嵌合体动物制作方法：嵌合体动物制作方法：1 1、集集合合（凝凝集集）法法：在在卵卵裂裂阶阶段段使使2个个以以上上的的胚胎发生粘着和结合。胚胎发生粘着和结合。2、注注入入法法：在在临临近近着着床床的的胚胚泡泡期期，用用显显微微操操作作方法将另一个体的细胞注入到囊胚腔中。方法将另一个体的细胞注入到囊胚腔中。本讲稿第十页，共十五页研究现状：研究现状：家家畜畜的的嵌嵌合合体体不不但但已已在在个个体体间间和和品品种种间间取取得得成成功功（绵绵羊羊、牛牛等等），而而且且在在异异种种间间也也得得到到了了活活的的后后代代，如如绵绵山山羊羊人人工工嵌嵌合合体体，该该技技术术对对遗遗传传学学研研究究具具有有重重要要意意义义，塑塑造造特特异异性性状状的的新新奇奇物物种种，从从而而为为动动物物园园展展示示了了新新的的前前景景，嵌嵌合合体体也也被被用用来来研研究究免免疫疫学学系统的机理。系统的机理。本讲稿第十一页，共十五页哺乳动物嵌合体生产基本方法示意图哺乳动物嵌合体生产基本方法示意图12本讲稿第十二页，共十五页小鼠胚小鼠胚胎囊胚胎囊胚腔注入腔注入嵌合法嵌合法本讲稿第十三页，共十五页嵌合体猪嵌合体猪(A)Female piglet 6899 developed from a Duroc-Pietrain blastocyst(red and black pigmentation)injected with German Land-race PGCs(white pigmentation on head and legs).(B)(B)Chimeric piglets 7003(male)and 7006(female)with red areas across the back developed from red Duroc cells injected into Landrace blastocysts.本讲稿第十四页，共十五页利用胚胎聚合和类胚胎干细胞制备嵌合体牛利用胚胎聚合和类胚胎干细胞制备嵌合体牛四细胞期胚胎与类干细胞四细胞期胚胎与类干细胞聚合后，培养成为桑椹胚聚合后，培养成为桑椹胚和囊胚，移植后生出嵌合和囊胚，移植后生出嵌合体牛犊。体牛犊。本讲稿第十五页，共十五页