第六章色谱分析导论PPT讲稿.ppt

第六章色谱分析导论第1页，共56页，编辑于2022年，星期三基本要求基本要求:1.1.理解混合物中各组分在色谱柱内得到分离的原因理解混合物中各组分在色谱柱内得到分离的原因;2.2.理解柱效率的物理意义及其计算方法理解柱效率的物理意义及其计算方法;3.3.理解速率理论方程对实际分离的指导意义理解速率理论方程对实际分离的指导意义;4.4.掌握分离度的计算及影响分离度的重要色谱参数掌握分离度的计算及影响分离度的重要色谱参数.第2页，共56页，编辑于2022年，星期三色色谱谱法法定定义义:色谱法或色谱分析（chromatography）也称之为色层法或层析法，是一种物理化学分析方法，它利用混合物中各物质在两相间分配系数的差别，当溶质在两相间做相对移动时，各物质在两相间进行多次分配，从而使各组分得到分离。色色谱谱的的产产生生：1903年，俄国植物学家Mikhail Tswett 最先发明。他采用填充有固体CaCO3细粒子的玻璃柱，将植物色素的混合物(叶绿素和叶黄素chlorophylls&xanthophylls)加于柱顶端，然后以溶剂淋洗，被分离的组份在柱中显示了不同的色带，他称之 为 色 谱 Chromatography(希 腊 语 中“chromat”=color;“graphein”=graph)。植物色素分离植物色素分离见图示见图示 6.1 6.1 6.1 6.1 色谱法及其分类色谱法及其分类色谱法及其分类色谱法及其分类第3页，共56页，编辑于2022年，星期三图示固定相固定相CaCO3颗粒颗粒流动相流动相石油醚石油醚 色带色带第4页，共56页，编辑于2022年，星期三色谱的发展史色谱的发展史1940年提出液液分配色谱法（LiquidLiquid Partition Chromatography），即固定相是吸附在硅胶上的水，流动相是某种有机溶剂。1941年Martin和Syngee提出用气体代替液体作流动相的可能性，11年之后James和Martin发表了从理论到实践比较完整的气液色谱方法（GasLiquid Chromatography），因而获得了1952年的诺贝尔化学奖。1949年Macllean等在氧化铝中加入淀粉粘合剂制作薄层板使薄层色谱法（TLC）得以实际应用，而在1956年Stahl开发出薄层色谱板涂布器之后，才使TLC得到广泛地应用。续前第5页，共56页，编辑于2022年，星期三1957年Golay开创了开管柱气相色谱法（OpenTubular Column Chromatography），习惯上称为毛细管柱气相色谱法（Capillary Column Chromatography）。60年代末把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱，出现了高效液相色谱（HPLC）第6页，共56页，编辑于2022年，星期三80年代初毛细管超临界流体色谱（SFC）得到发展，但在90年代后未得到较广泛的应用。而在80年代初由Jorgenson等集前人经验而发展起来的毛细管电泳（CZE），在90年代得到广泛的发展和应用。90年代后期集HPLC和CZE优点的毛细管电色谱得到迅速发展。21世纪色谱科学将在生命科学等前沿科学领域发挥不可代替的重要作用。第7页，共56页，编辑于2022年，星期三1.1.按固定相外形分：按固定相外形分：柱色谱（填充柱、空心柱）、平板色谱（薄层色谱和纸色柱色谱（填充柱、空心柱）、平板色谱（薄层色谱和纸色谱谱)。2.2.按组份在固定相上的分离机理分：按组份在固定相上的分离机理分：吸附色谱吸附色谱：不同组份在固定相的吸附作用不同；：不同组份在固定相的吸附作用不同；分配色谱分配色谱：不同组份在固定相上的溶解能力不同；：不同组份在固定相上的溶解能力不同；离子交换色谱离子交换色谱：不同组份在固定相（离子交换剂）上的亲：不同组份在固定相（离子交换剂）上的亲和力不同；和力不同；凝胶色谱（尺寸排阻色谱）凝胶色谱（尺寸排阻色谱）:不同尺寸分子在固定相上的渗透作不同尺寸分子在固定相上的渗透作用。用。色谱分类方法色谱分类方法第8页，共56页，编辑于2022年，星期三 3.3.3.3.按两相状态分按两相状态分按两相状态分按两相状态分第9页，共56页，编辑于2022年，星期三6.2 6.2 色谱流出曲线（色谱图）色谱流出曲线（色谱图）色谱流出曲线图色谱流出曲线图第10页，共56页，编辑于2022年，星期三色谱术语：色谱术语：1 1）基基线线：在在实实验验条条件件下下，色色谱谱柱柱后后仅仅有有纯纯流流动动相相进进入入检检测测器器时时的的流流出出曲曲线线称称为为基基线线，S/NS/N大大的的、稳稳定的基线为水平直线。定的基线为水平直线。2 2）峰峰高高：色色谱谱峰峰顶顶点点与与基线的距离。基线的距离。3 3）保留值）保留值(Retention value,R)(Retention value,R)a.a.死死时时间间(Dead(Dead time,time,t t0 0)：不不与与固固定定相相作作用用的的物物质质从从进进样样到到出出现现峰峰极极大大值值时时的的时时间间，它它与与色色谱谱柱柱的的空空隙隙体体积积成成正正比比。由由于于该该物物质质不不与与固固定定相相作作用用，因因此，其流速与流动相的流速相近。据此，其流速与流动相的流速相近。据 t t0 0 可求出流动相平均流速可求出流动相平均流速 第11页，共56页，编辑于2022年，星期三 b.b.保保留留时时间间t tr r：试试样样从从进进样样到到出出现现峰峰极极大大值值时时的的时时间间。它它包包括括组组份份随随流流动动相相通通过过柱柱子子的的时时间间t t0 0和和组组份份在在固固定定相相中滞留的时间。中滞留的时间。c.c.调调整整保保留留时时间间t tr r ：某某组组份份的的保保留留时时间间扣扣除除死死时时间间后的保留时间，它是组份在固定相中的滞留时间。即后的保留时间，它是组份在固定相中的滞留时间。即 第12页，共56页，编辑于2022年，星期三由由于于时时间间为为色色谱谱定定性性依依据据。但但同同一一组组份份的的保保留留时时间间与与流流速速有有关关，因此有时需用保留体积来表示保留值。因此有时需用保留体积来表示保留值。d.d.死体积死体积V V0 0：色谱柱管内固定相颗粒间空隙、色谱仪管路和连接：色谱柱管内固定相颗粒间空隙、色谱仪管路和连接头间空隙和检测器间隙的总和。勿略后两项可得到：头间空隙和检测器间隙的总和。勿略后两项可得到：其中，其中，FcoFco为柱出口的载气流速为柱出口的载气流速（mL/min)mL/min)，其值为：，其值为：F F0 0-检测器出口流速；检测器出口流速；TrTr-室温；室温；TcTc-柱温；柱温；p p0 0-大气压；大气压；p pw w-室温室温时水蒸汽压。时水蒸汽压。注注:对液相色谱对液相色谱FcoFco为柱内流动相体积流速（为柱内流动相体积流速（mL/min)mL/min)，不需要进行校正。不需要进行校正。第13页，共56页，编辑于2022年，星期三 e.e.保保留留体体积积V Vr r：指指从从进进样样到到待待测测物物在在柱柱后后出出现现浓浓度度极极大大点时所通过的流动相的体积。点时所通过的流动相的体积。f.f.调调整整保保留留体体积积 ：某某组组份份的的保保留留体体积积扣扣除除死死体体积积后的体积。后的体积。g.g.相相对对保保留留值值r r2,12,1：组组份份2 2的的调调整整保保留留值值与与组组份份1 1的的调调整保留值之比。整保留值之比。第14页，共56页，编辑于2022年，星期三注意：注意：r r2,12,1只与柱温和固定相性质有关，而与柱内径、只与柱温和固定相性质有关，而与柱内径、柱长柱长L L、填充情况及流动相流速无关，因此，在色、填充情况及流动相流速无关，因此，在色谱分析中，尤其是谱分析中，尤其是GCGC中广泛用于定性的依据！中广泛用于定性的依据！具体做法：固定一个色谱峰为标准具体做法：固定一个色谱峰为标准s s，然后再求其它，然后再求其它峰峰 i i 对标准峰的相对保留值，此时以对标准峰的相对保留值，此时以 表示：表示：1,1,又称选择因子又称选择因子(Selectivity factor)(Selectivity factor)。第15页，共56页，编辑于2022年，星期三h.h.净保留体积净保留体积 经压力修正的调整保留体积，即：经压力修正的调整保留体积，即：其中其中式中式中:j-:j-色谱柱进口和出口之间的压力梯度校正系数。色谱柱进口和出口之间的压力梯度校正系数。pi-pi-色谱柱进口压力；色谱柱进口压力；po-po-色谱柱出口压力。色谱柱出口压力。i.i.比保留体积比保留体积把净保留体积进一步校正到单位质量固定液和把净保留体积进一步校正到单位质量固定液和273K273K时的保留体积，时的保留体积，如下式：如下式：式中式中:Ws-Ws-固定液的质量。固定液的质量。第16页，共56页，编辑于2022年，星期三 j.j.区区域域宽宽度度：用用于于衡衡量量柱柱效效及及反反映映色色谱谱操操作作条条件件下下的的动动力学因素。通常有三种表示方法：力学因素。通常有三种表示方法：标准偏差标准偏差：0.6070.607倍峰宽处的一半。倍峰宽处的一半。半峰宽半峰宽W W1/21/2：峰高一半处的峰宽。：峰高一半处的峰宽。W W1/21/2=2.354=2.354 峰峰底底宽宽W W：色色谱谱峰峰两两侧侧拐拐点点上上切切线线与与基基线线的的交交点点间间的的距距离离。W=4W=4 第17页，共56页，编辑于2022年，星期三色谱流出曲线的意义：色谱流出曲线的意义：色谱峰数色谱峰数=样品中单组份的最少个数；样品中单组份的最少个数；色谱保留值色谱保留值定性依据；定性依据；色谱峰高或面积色谱峰高或面积定量依据；定量依据；色谱保留值或区域宽度色谱保留值或区域宽度色谱柱分离效能评价指标；色谱柱分离效能评价指标；色谱峰间距色谱峰间距固定相或流动相选择是否合适的依据。固定相或流动相选择是否合适的依据。第18页，共56页，编辑于2022年，星期三6.3 6.3 色谱法基本原理色谱法基本原理两两组组份份峰峰间间距距足足够够远远：由由各各组组份份在在两两相相间间的的分分配配系系数决定，即由色谱过程的数决定，即由色谱过程的热力学热力学性质决定。性质决定。每每个个组组份份峰峰宽宽足足够够小小：由由组组份份在在色色谱谱柱柱中中的的传传质质和和扩散决定，即由色谱过程扩散决定，即由色谱过程动力学动力学性质决定。性质决定。因因此此，研研究究、解解释释色色谱谱分分离离行行为为应应从从热热力力学学和动力学两方面进行。和动力学两方面进行。第19页，共56页，编辑于2022年，星期三一、描述分配过程的参数一、描述分配过程的参数1 1、分配系数分配系数(Distribution constant,K)(Distribution constant,K)：描述组份在固定相和流动相间的分配过描述组份在固定相和流动相间的分配过程或吸附程或吸附-脱附过程的参数，称为分配系数。脱附过程的参数，称为分配系数。K K 只与固定相和温度有关，与两相体积、柱管只与固定相和温度有关，与两相体积、柱管特性和所用仪器无关。特性和所用仪器无关。第20页，共56页，编辑于2022年，星期三2.2.分分配配比比(Retention(Retention(Retention(Retention factor factor factor factor or or or or capacity capacity capacity capacity factor,factor,factor,factor,k)k)k)k)：在在一一定定温温度度和和压压力力下下，组组份份在在两两相相间间的的分分配配达达平平衡衡时时，分分配配在在固固定定相相和和流流动动相相中中的的质质量量比比，称称为为分分配配比比。它它反反映映了了组组分分在在柱柱中中的的迁迁移移速速率率。又又称保留因子。称保留因子。其中其中其中其中V V V Vm m V V0 0 0 0，V Vs s s s为固定相体积。为固定相体积。为固定相体积。为固定相体积。第21页，共56页，编辑于2022年，星期三分配比分配比 k k 的求算：的求算：1 1）组分滞留因子：）组分滞留因子：2 2）又，）又，3 3）因此，）因此，第22页，共56页，编辑于2022年，星期三3.3.K K 与与 k k 的关系：的关系：称为相比率，它也是反映色谱柱柱型特点的参数。称为相比率，它也是反映色谱柱柱型特点的参数。4.4.选选择择因因子子 ：色色谱谱柱柱对对A A、B B两两组组分分的的选选择择因因子子 定定义义 如下：如下：A A为先流出的组分，为先流出的组分，B B为后流出的组分。为后流出的组分。第23页，共56页，编辑于2022年，星期三注注意意：K K 或或 k k 反反映映的的是是某某一一组组分分在在两两相相间间的的分分配配；而而 是是反反映映两两组组分分间间的的分分离离情情况况！当当两两组组分分 K K 或或 k k 相相同同时时，=1=1 时时，两两组组分分不不能能分分开开；当当两两组组分分 K K 或或 k k 相相差差越越大大时时，越越大，分离得越好。大，分离得越好。两组分在两相间的分配系数不同，是色谱分离的先决条件。两组分在两相间的分配系数不同，是色谱分离的先决条件。和和 k k 是计算色谱柱分离效能的重要参数！是计算色谱柱分离效能的重要参数！第24页，共56页，编辑于2022年，星期三二、峰间距、峰形状和峰宽的理论描述二、峰间距、峰形状和峰宽的理论描述1.1.塔板理论塔板理论（Plate theory)Plate theory)1952 1952年，年，MartinMartin等人提出的塔板理论将一根等人提出的塔板理论将一根色谱柱当作一个由许多塔板组成的精馏塔，用塔板色谱柱当作一个由许多塔板组成的精馏塔，用塔板概念来描述组分在柱中的分配行为。塔板是从精馏概念来描述组分在柱中的分配行为。塔板是从精馏中借用的，是一种半经验理论，但它成功地解释了中借用的，是一种半经验理论，但它成功地解释了色谱流出曲线呈正态分布。色谱流出曲线呈正态分布。第25页，共56页，编辑于2022年，星期三塔板理论假定：塔板理论假定：1 1）塔板之间）塔板之间不连续不连续；2 2）塔板之间）塔板之间无分子扩散无分子扩散；3 3）组分在各塔板内两相间的分配瞬间达至平衡，达一次平）组分在各塔板内两相间的分配瞬间达至平衡，达一次平衡所需柱长为衡所需柱长为理论塔板高度理论塔板高度H H；4 4）某组分在所有塔板上的分配系数相同；）某组分在所有塔板上的分配系数相同；5 5）流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔板体积）流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔板体积加入。加入。当塔板数当塔板数n n较少时，组分在柱内达分配平衡的次数较较少时，组分在柱内达分配平衡的次数较少，流出曲线呈峰形，但不对称；当塔板数少，流出曲线呈峰形，但不对称；当塔板数n50n50时，峰时，峰形接近正态分布。形接近正态分布。第26页，共56页，编辑于2022年，星期三由塔板理论假设导引出一个描述色谱流出曲线的数学表示式：由塔板理论假设导引出一个描述色谱流出曲线的数学表示式：式中式中 c c:色谱流出曲线上任意一点样品的浓度；色谱流出曲线上任意一点样品的浓度；n n:理论塔板数；理论塔板数；m m:溶质的质量；溶质的质量；V VR R:溶质的保留体积，即从进样到色谱峰极大点溶质的保留体积，即从进样到色谱峰极大点 出现时通出现时通入色谱柱载气的体积；入色谱柱载气的体积；V V:在色谱流出曲线上任意一点的保留体积。在色谱流出曲线上任意一点的保留体积。第27页，共56页，编辑于2022年，星期三 根根据据呈呈正正态态分分布布的的色色谱谱流流出出曲曲线线可可以以导导出出计计算算塔塔板板数数n n的的公公式式，用用以以评评价价一一根柱子的柱效。由于色谱柱并无真正的塔板，故塔板数又称理论塔板数：根柱子的柱效。由于色谱柱并无真正的塔板，故塔板数又称理论塔板数：若柱长为若柱长为L L，则每块理论塔板高度，则每块理论塔板高度H H为为 由由上上述述两两式式知知道道，理理论论塔塔板板数数n n越越多多、理理论论塔塔板板高高度度H H越越小小、色色谱谱峰峰越越窄窄，则则柱柱效效越越高。高。但但上上述述两两式式包包含含死死时时间间t t0 0，它它与与组组分分在在柱柱内内的的分分配配无无关关，因因此此不不能能真正反映色谱柱的柱效。通常以有效塔板数真正反映色谱柱的柱效。通常以有效塔板数n neff eff 和有效塔板高度和有效塔板高度H Heff eff 表示：表示：第28页，共56页，编辑于2022年，星期三有关塔板理论的说明：有关塔板理论的说明：1 1）说说明明柱柱效效时时，必必须须注注明明该该柱柱效效是是针针对对何何种种物物质质、固固定定液液种种类及其含量、流动相种类及流速、操作条件等；类及其含量、流动相种类及流速、操作条件等；2 2）应定期对柱效进行评价，以防柱效下降、延长柱寿命。）应定期对柱效进行评价，以防柱效下降、延长柱寿命。塔塔板板理理论论的的贡贡献献:描描述述了了组组分分在在柱柱内内的的分分配配平平衡衡和和分分离离过过程程、导导出出流流出出曲曲线线的的数数学学模模型型、解解释释了了流流出出曲曲线线形形状状和和位位置置、提提出出了了计计算算和和评评价价柱效的参数。柱效的参数。塔塔板板理理论论的的不不足足:该该理理论论是是在在理理想想情情况况下下导导出出的的，未未考考虑虑分分子子扩扩散散因因素、其它动力学因素对柱内传质的影响。因此它不能解释素、其它动力学因素对柱内传质的影响。因此它不能解释：v 峰形为什么会扩张？峰形为什么会扩张？v 影响柱效的动力学因素是什么？影响柱效的动力学因素是什么？第29页，共56页，编辑于2022年，星期三 19561956年年，荷荷兰兰化化学学工工程程师师van van DeemterDeemter提提出出了了色色谱谱过过程程动动力力学学速速率率理理论论：吸吸收收了了塔塔板板理理论论中中的的板板高高H H概概念念，考考虑虑了了组组分分在在两两相相间间的的扩扩散散和和传传质质过过程程，从从而给出了而给出了van Deemtervan Deemter方程：方程：u u 为流动相线速度；为流动相线速度；A A，B B，C C为常数，其中为常数，其中 A A分别表示涡流扩散系数；分别表示涡流扩散系数；B B分子扩散系数；分子扩散系数；C C传质阻力系数（包括液相和固相传质阻力系数）。传质阻力系数（包括液相和固相传质阻力系数）。该该式式从从动动力力学学角角度度很很好好地地解解释释了了影影响响板板高高（柱柱效效）的的各各种种因因素素！任任何减少方程右边三项数值的方法，都可降低何减少方程右边三项数值的方法，都可降低H H，从而提高柱效。，从而提高柱效。2.2.速率理论速率理论（Rate theoryRate theory）第30页，共56页，编辑于2022年，星期三1）涡流扩散项涡流扩散项(Multipath term,A)(Multipath term,A)在在填填充充柱柱中中，由由于于受受到到固固定定相相颗颗粒粒的的阻阻碍碍，组组份份在在迁迁移移过过程程中中随随流流动动相相不不断断改改变变方方向向，形形成成紊紊乱乱的的“涡涡流流”：从从图图中中可可见见，因因填填充充物物颗颗粒粒大大小小及及填填充充的的不不均均匀匀性性同同一一组组分分运运行行路路线线长长短短不不同同流流出出时时间间不同不同峰形展宽。峰形展宽。展宽程度以展宽程度以A A表示：表示：A=2A=2 d dp p其中其中d dp p填充物平均直径；填充物平均直径；填充不规则因子。填充不规则因子。可可见见，使使用用细细粒粒的的固固定定相相并并填填充充均均匀匀可可减减小小A A，提提高高柱柱效效。对对于于空空心心毛毛细细管管柱柱，无涡流扩散，即无涡流扩散，即A=0A=0。流动方向流动方向第31页，共56页，编辑于2022年，星期三2）分子扩散项）分子扩散项(Longitudinal diffusion term,B/u)纵纵向向分分子子扩扩散散是是由由于于浓浓度度梯梯度度引引起起的的。当当样样品品被被注注入入色色谱谱柱柱时时，它它呈呈“塞塞子子”状状分分布布。随随着着流流动动相相的的推推进进，“塞塞子子”因因浓浓度度梯梯度度而而向向前前后后自自发发地地扩扩散散，使使谱谱峰峰展宽。其大小为展宽。其大小为B=2 D 称为弯曲因子，它表示固定相几何形状对自由分子扩散的阻碍情况；称为弯曲因子，它表示固定相几何形状对自由分子扩散的阻碍情况；D组分在流动相中的扩散系数。组份为气体或液体时，分别以组分在流动相中的扩散系数。组份为气体或液体时，分别以Dg或或Dm表示；表示；讨论：讨论：q 分子量大的组分，分子量大的组分，Dg小，即小，即B小小;q Dg 随柱温升高而增加，随柱压降低而减小；随柱温升高而增加，随柱压降低而减小；q 流动相分子量大，流动相分子量大，Dg 小，即小，即 B 小；小；q u 增加，组份停留时间短，纵向扩散小；增加，组份停留时间短，纵向扩散小；（B/u）q 对于液相色谱，因对于液相色谱，因Dm 较小，较小，B 项可勿略。项可勿略。球状颗粒；球状颗粒；大分子量流动相；大分子量流动相；适当增加流速；适当增加流速；短柱；短柱；低温。低温。第32页，共56页，编辑于2022年，星期三3）传质阻力项）传质阻力项(Mass-transfer term,Cu)因因传传质质阻阻力力的的存存在在，使使分分配配不不能能“瞬瞬间间”达达至至平平衡衡，因因此此产产生生峰峰形形展展宽宽。气气相相色色谱谱以以气气体体为为流流动动相相，液液相相色色谱谱以以液液体体为为流流动动相相，二二者者传传质质过过程程不完全相同。下面分别作讨论。不完全相同。下面分别作讨论。a）气气液液色色谱谱：传传质质阻阻力力项项C包包括括气气相相传传质质阻阻力力系系数数Cg和和液液相相传传质质阻阻力力系系数数Cl。流动相流动相固液界面固液界面固定液固定液组分分子组分分子ClCg第33页，共56页，编辑于2022年，星期三讨论：讨论：减小填充颗粒直径减小填充颗粒直径dp；采用分子量小的流动相，使采用分子量小的流动相，使Dg增加；增加；减小液膜厚度减小液膜厚度df，Cl下降。下降。但此时但此时k又减小。又减小。因此，当保持固定液含量不变时，可通过增加固定因此，当保持固定液含量不变时，可通过增加固定液载体的比表面来降低液载体的比表面来降低df。但比表面过大又会因吸附。但比表面过大又会因吸附过强使峰拖尾。过强使峰拖尾。增加柱温，可增加增加柱温，可增加Dl，但，但k值也减小，为保持合适值也减小，为保持合适Cl值，应控制柱温。值，应控制柱温。第34页，共56页，编辑于2022年，星期三b）液液色谱：传质阻力项）液液色谱：传质阻力项C包括流动相传质阻力系数包括流动相传质阻力系数Cm和固定相传质阻力系数和固定相传质阻力系数Cs。sm第35页，共56页，编辑于2022年，星期三讨论：讨论：v 流流动动相相传传质质阻阻力力包包括括两两方方面面：流流动动相相中中的的传传质质阻阻力力Cm、滞滞留留的的流流动动相相传传质质阻阻力力Csm。分分别别与与填填充充物物大大小小 dp、扩扩散散系系数数(Dm)、微孔大小及其数量等有关。微孔大小及其数量等有关。因因此此，降降低低流流动动相相传传质质阻阻力力的的方方法法有有：细细颗颗粒粒固固定定相相、增增加加组组分在固定相和流动相中的扩散系数分在固定相和流动相中的扩散系数D、适当降低线速度、短柱。、适当降低线速度、短柱。v 固固定定相相传传质质阻阻力力与与液液膜膜厚厚度度df、保保留留因因子子 k 和和扩扩散散系系数数Ds等等有有关。关。因此，降低固定相传质阻力的方法有：因此，降低固定相传质阻力的方法有：减小液膜厚度减小液膜厚度df，Cl下下降。但此时降。但此时k又减小。当保持固定液含量不变时，可通过增加又减小。当保持固定液含量不变时，可通过增加固定液载体的比表面来降低固定液载体的比表面来降低df。但比表面过大又会因吸附过强。但比表面过大又会因吸附过强使峰拖尾。使峰拖尾。第36页，共56页，编辑于2022年，星期三4）流速）流速u 由由van Deemter方程方程 H=A+B/u+Cu知道：知道：当当u一一定定时时，仅仅在在A、B、C较较小小时时，H较较小小，柱柱效效较较高高；反反之之则柱效较低，色谱峰将展宽。则柱效较低，色谱峰将展宽。以以u对对H作图，可得作图，可得H-u曲线（如图），从该曲线得到：曲线（如图），从该曲线得到：板高，板高，H(cm)HminA+B/u+CuCmuCsuAB/u第37页，共56页，编辑于2022年，星期三涡流扩散项涡流扩散项A与流速与流速u无关；无关；低流速区低流速区(u小小)，B/u大，分子扩散项占主导，此时选择分子量大大，分子扩散项占主导，此时选择分子量大的气体如的气体如N2和和Ar为载气，可减小扩散，提高柱效；为载气，可减小扩散，提高柱效；高流速区高流速区(u大大)，Cu大，传质阻力项占主导，此时选择分子量小大，传质阻力项占主导，此时选择分子量小的气体如的气体如H2和和He为载气，可增加扩散系数，提高柱效；为载气，可增加扩散系数，提高柱效；曲线的最低点对应最佳线速曲线的最低点对应最佳线速uopt()下的最小板高下的最小板高Hmin()；LC的的Hmin和和uopt均比均比GC的小一个数量级，即在的小一个数量级，即在 LC中，较低流速可获中，较低流速可获得较大的柱效。得较大的柱效。第38页，共56页，编辑于2022年，星期三5）固定相颗粒大小对板高的影响）固定相颗粒大小对板高的影响 实实验验表表明明，颗颗粒粒越越细细，板板高高越越小小，受受线线速速影影响响越越小小。即即，在在HPLC分分析析中中采采用细粒作固定相的理论根据！用细粒作固定相的理论根据！但颗粒细导致柱流速慢，当采用高压技术，才能实现但颗粒细导致柱流速慢，当采用高压技术，才能实现HPLC的分析要求。的分析要求。上上面面分分别别介介绍绍了了影影响响色色谱谱分分离离的的基基本本原原理理以以及及影影响响柱柱效效的的各各种种因因素素，但但是是如如何何从从总总体上定量描述色谱分离效能？如何将各种影响因素对分离的影响定量地表述出来呢？体上定量描述色谱分离效能？如何将各种影响因素对分离的影响定量地表述出来呢？板高板高,H(cm)第39页，共56页，编辑于2022年，星期三6.4 分离度及色谱分离方程分离度及色谱分离方程一、分离度一、分离度(Resolution,R)同同时时反反映映色色谱谱柱柱效效能能和和选选择择性性的的一一个个综综合合指指标标。也也称称总总分分离离效效能能指指标或分辨率。其定义为：标或分辨率。其定义为：利用此式，可直接从利用此式，可直接从色谱流出曲线上求出分离度色谱流出曲线上求出分离度R。R 越越大大，相相邻邻组组分分分分离离越越好好。当当R=1.5时时，分分离离程程度度可可达达99.7%，因此，因此R=1.5通常用作是否分开的判据。通常用作是否分开的判据。第40页，共56页，编辑于2022年，星期三R=1.5R=0.75R=1.0响应信号保留时间保留时间 t,min第41页，共56页，编辑于2022年，星期三二、色谱分离方程二、色谱分离方程 R 的的定定义义并并未未反反映映影影响响分分离离度度的的各各种种因因素素。也也就就是是说说，R 未未与与影影响响其其大大小小的的因因素素：柱柱效效n、选选择择因因子子 和和保保留留因因子子 k 联联系系起起来。来。对对于于相相邻邻的的难难分分离离组组分分，由由于于它它们们的的分分配配系系数数 K 相相差差小小，可可合合理理假假设设k1 k2=k，W1 W2=W。因因此此可可导导出出R与与n（neff）、和和 k 的的关系：关系：第42页，共56页，编辑于2022年，星期三附附,具体推导过程如下：具体推导过程如下：第43页，共56页，编辑于2022年，星期三有关色谱方程的讨论：有关色谱方程的讨论：1）分离度）分离度R与柱效的关系与柱效的关系 分离度分离度R与理论塔板数与理论塔板数n有关，即有关，即R受动力学性质的影响。受动力学性质的影响。对对具具一一定定相相对对保保留留值值 的的物物质质对对，R与与有有效效塔塔板板数数neff有有关关，说说明明neff可正确代表柱效能。可正确代表柱效能。由色谱方程可得：由色谱方程可得：因因此此可可通通过过增增加加柱柱长长提提高高分分离离度度。然然而而，分分析析时时间间也也相相应应增增加加，且且峰峰宽宽也也展展宽宽！为为提提高高柱柱效效，用用减减小小塔塔板板高高度度 H 的的方方法法比比增增加加柱柱长更有效。长更有效。第44页，共56页，编辑于2022年，星期三2）分离度）分离度R与保留因子与保留因子 的关系的关系 越大，柱选择性越好，对分离有利。越大，柱选择性越好，对分离有利。的微小变的微小变化可引起化可引起 R 较大改变。如，当较大改变。如，当 从从1.01增加至增加至1.10(增增加加9%)时，时，R 则增加则增加 9 倍倍(但但 1.5,R增加不大增加不大)。改变改变 的方法有：的方法有：降低柱温、改变流动相及固定相的降低柱温、改变流动相及固定相的性质和组成性质和组成。3）分离度）分离度R 与与分配比分配比 k 的关系的关系 k 增加，分离度增加，分离度R 增加，但当增加，但当k10，则，则R的增加不明显。的增加不明显。通常通常k在在210之间。之间。改变改变 k 的方法有：的方法有：适当增加柱温适当增加柱温(GC)、改变流动相性、改变流动相性质和组成质和组成(LC)以及固定相含量。以及固定相含量。第45页，共56页，编辑于2022年，星期三70%CH3OH+30H2O60%CH3OH+40H2O50%CH3OH+50H2O40%CH3OH+60H2O溶剂溶剂(流动相流动相)组成对色谱分离的影响组成对色谱分离的影响(梯度淋洗梯度淋洗)1：9,10-蒽醌；蒽醌；2：2-甲基甲基-9,10-蒽醌；蒽醌；3：2-乙基乙基-9,10-蒽醌蒽醌4：1,4-二甲基二甲基-9,10-蒽醌；蒽醌；5：2-特丁基甲基特丁基甲基-9,10-蒽醌；蒽醌；改变组成使 k 最佳第46页，共56页，编辑于2022年，星期三色谱分离中的问题色谱分离中的问题 由由于于分分析析物物组组成成复复杂杂，以以某某一一组组成成的的流流动动相相可可能能使使部部分分待待测测物物得得到到好好的的分分离离，但但同同时时出出使使其其它它待待测测物物的的分分离离不不令令人人满满意意！实实际际工工作作中中采采用用程程序序升升温温（GC）和和梯梯度度淋淋洗洗（LC）来来解解决决这这个个问问题。题。第47页，共56页，编辑于2022年，星期三三、分析时间三、分析时间 t 分析时间通常指最后一个组分出峰的时间。分析时间通常指最后一个组分出峰的时间。由以下三式：由以下三式：得到得到 可可见见，分分析析时时间间与与R，k、H/u等等参参数数有有关关。R增增加加1倍倍，分分析析时间则是原来的时间则是原来的 4 倍。倍。实实际际工工作作中中，即即要要能能获获得得有有效效的的分分离离，又又要要在在较较短短时时间间内内完完成成分分析。析。第48页，共56页，编辑于2022年，星期三概念、表示方法及计算公式汇总概念、表示方法及计算公式汇总表表-1第49页，共56页，编辑于2022年，星期三续表续表-1第50页，共56页，编辑于2022年，星期三例题例题1：在在一一定定条条件件下下，两两个个组组分分的的调调整整保保留留时时间间分分别别为为85秒秒和和100秒秒，要要达达到到完完全全分分离离，即即R=1.5 。计计算算需需要要多多少少块块有有效效塔塔板板。若若填填充充柱柱的的塔塔板板高高度度为为0.1 cm，柱柱长长是是多多少？少？解：解：r21=100/85=1.18 n有效有效 =16R2 r21 /(r21 1)2 =161.52(1.18/0.18)2 =1547（块）（块）L有效有效 =n有效有效H有效有效 =15470.1=155 cm 即柱长为即柱长为1.55米时，米时，两组分可以得到完全分离两组分可以得到完全分离。第51页，共56页，编辑于2022年，星期三例题例题2：在在一一定定条条件件下下，两两个个组组分分的的保保留留时时间间分分别别为为12.2s和和12.8s，计计算算分离度。要达到完全分离，即分离度。要达到完全分离，即R=1.5 ，所需要的柱长。，所需要的柱长。解：第52页，共56页，编辑于2022年，星期三例例：两两物物质质A和和B在在30cm长长的的色色谱谱柱柱上上的的保保留留时时间间分分别别为为16.4和和17.63min，有有一一不不与与固固定定相相作作用用的的物物质质，其其在在此此柱柱上上的的保保留留时时间间为为1.30 min。物物质质A和和B的的峰峰底底宽宽分分别别为为1.11和和1.21min。试问：试问：1）柱分辨率）柱分辨率R；2）柱平均理论塔板数）柱平均理论塔板数nav3）平均塔板高度）平均塔板高度Hav4）若要求）若要求R达到达到1.5，则柱长至少应为多少？，则柱长至少应为多少？5）使用上述较长的柱进行分析时，其分析时间为多长？）使用上述较长的柱进行分析时，其分析时间为多长？6）不不增增加加柱柱长长，要要求求在在原原来来的的分分析析时时间间内内R达达到到1.5，该该柱柱的的塔塔板板高高度度应为多少？应为多少？第53页，共56页，编辑于2022年，星期三1）2）3）4）第54页，共56页，编辑于2022年，星期三5）6）第55页，共56页，编辑于2022年，星期三本章练习P123:6、9、12、13第56页，共56页，编辑于2022年，星期三